化合物7-羰基表雄酮对慢性轻度应激BALB/C小鼠抑郁症的改善作用 技术领域：
本发明通过建立慢性轻度应激抑郁症模型，研究7-羰基脱氢表雄酮对抑郁抑郁症的改善作用，涉及生物医学高技术中新药物的开发与应用领域。
发明背景：
世界卫生组织曾发表过一项关于“疾病负担”的调查，以因病造成“伤残”——功能缺损统计，抑郁症位居第二，仅次于慢性阻塞性肺部疾患，占全部疾病总负担的6.2％；如果加上居第13位的双相情感性疾病(躁狂——抑郁状态交替发作)，则达8.0％。随着现代化的进程，抑郁症的重要性还将继续增加，估计在25年后，将占疾病总负担10％左右。从某种意义上来说，抑郁症将是跨世纪的挑战。在焦虑抑郁的发病机理上，认为中枢神经系统生化功能异常与之密切相关，并主要涉及NE、5-HT等神经递质。早在20世纪50年代，就有单胺氧化酶抑制剂(MAOIS)应用于抑郁症的治疗，因其严重的毒副反应后被三环类抗抑郁剂(TCAS)取代，TCAS疗效较好，延用至今。但临床发现，TCAS仍有许多使患者难以忍受而终断使用的不良反应。同时他们对与抑郁症伴发的免疫功能低下和学习记忆功能障碍没有作用。因此选择毒副作用小，治疗效果好且能改善抑郁伴发症的化合物成为精神药理学家追求的目标。
发明目的：
通过对BALB/C小鼠使用多种以不可预见方式安排的多种应激原，在建立与人抑郁症相似动物模型基础上，研究7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠抑郁症状的改善作用，并评价7-羰基脱氢表雄酮对抑郁症并发的免疫功能低下和学习记忆障碍的改善作用，为7-羰基脱氢表雄酮在临床应用奠定理论和技术基础。
内容与要求：
建立慢性轻度应激抑郁动物模型，给抑郁小鼠补充7-羰基脱氢表雄酮，测定小鼠2％蔗糖溶液饮用量变化，观察7-羰基脱氢表雄酮对逆转抑郁导致地欣快感情况。同时观察7-羰基脱氢表雄酮抑郁小鼠自发活动的影响。结合淋巴细胞增殖实验和自然细胞(NK)杀伤实验分析，评价7-羰基脱氢表雄酮对抑郁导致免疫低下功能的影响。应用Morris水迷宫方法，评价7-羰基脱氢表雄酮补充后，对抑郁小鼠学习记忆能力的影响。
该化合物达到的技术指标为：
1. 7-羰基脱氢表雄酮补充后能恢复抑郁症小鼠减少的2％蔗糖溶液饮用量，改善抑郁小鼠欣快感缺失症状。
2. 7-羰基脱氢表雄酮补充后能逆转抑郁小鼠自发活动减少，恢复小鼠自发活动。
3. 7-羰基脱氢表雄酮补充后逆转抑郁引起的小鼠免疫功能低下，增强抑郁小鼠免疫功能。
4. 7-羰基脱氢表雄酮补充后改善抑郁小鼠空间学习记忆能力，增强抑郁小鼠学习能力。
附图说明：
图1. 7-羰基脱氢表雄酮结构式
分子式C19H27O3，分子量：302.4
图2. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠2％蔗糖溶液饮用量
Control为对照组，Stress为模型组，Stress+7OD-L为5mg/kg剂量组，Stress+7OD-H为15mg/kg剂量组。
图3. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠自发活动的影响
Control为对照组，Stress为模型组，Stress+7OD-L为5mg/kg剂量组，Stress+7OD-H为15mg/kg剂量组。
图4. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠空间学习记忆的影响
Control为对照组，Stress为模型组，Stress+7OD-L为5mg/kg剂量组，Stress+7OD-H为15mg/kg剂量组。
图5. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠T淋巴细胞Con A刺激增殖反应的影响
Control为对照组，Stress为模型组，Stress+7OD-L为5mg/kg剂量组，Stress+7OD-H为15mg/kg剂量组。
图6. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠NK细胞杀伤活性的影响
Control为对照组，Stress为模型组，Stress+7OD-L为5mg/kg剂量组，Stress+7OD-H为15mg/kg剂量组。
实施例：
1.合成制备7-羰基脱氢表雄酮
将DHEA(10g，0.0255mol)溶于12ml吡啶和8ml乙酸酐的混合溶液中，室温下搅拌过夜。TLC法监测反应进行程度(展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)，254nm紫外检测后，用5％硫酸/乙醇溶液浸润后加热后显色。(DHEA及3β-Acetoxyandrost-5-ene-17-one均无荧光，但能显色。)将反应混合物倒入100ml冰水中，用2M HCl溶液调节pH为6-7，抽滤收集析出物，并将固体物用冰水洗涤多次至滤液中性。于红外灯箱干燥10hr。得到白色固体10.5g，m.p.171-173℃，收率为92％。重结晶(丙酮/石油醚)，得到白色结晶，m.p.172-173℃。
在三口瓶装置回流管、冷凝管及通气管，将2.5g N-羟基邻苯二甲酰亚胺溶于丙酮/乙酸乙酯(1∶1)的55ml的混合溶液中，加入3β-乙酸氧DHEA 5g和偶氮环己晴0.5g。将反应加热回流，并持续通入空气，并在反应中分批加入偶氮环己晴(约每次50mg×15次)。反应50小时后，将溶剂蒸干。加入甲苯40ml，在50℃恒温搅拌1h后放置至室温。过滤除去固体(N-羟基邻苯二甲酸亚胺)，可重复使用，并用少量甲苯洗涤。将滤液用饱和的碳酸氢钠的水溶液洗涤至水层无色。减压除去甲苯。用硅胶层析法纯化(柱：5×15cm，展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)收集含产物的滤液段，得到粗品1.5g。柱层析纯化(柱：20×3cm，洗脱剂 石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)，收集洗脱液，浓缩，得到220mg淡黄色固体。m.p.185-187℃，收率为31％。用丙酮/甲醇重结晶，得到白色晶体，熔点186-187℃。
将约2g甾体溶于90ml甲醇中，向其中加入氢氧化钾500mg溶于2.5ml的水溶液，反应液室温搅拌1小时(TLC展开剂 石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)。减压除去甲醇至一半体积，倒入100ml水中，置于0℃约1小时，过滤收集固体，并用水洗涤多次，得到干燥固体1.7g。熔点检测为212-217℃。
重结晶 先将固体溶于氯仿中，并用棉花过滤一次。将滤液收集浓缩，加入石油醚后使晶体析出，收集固体，并用少量的氯仿∶石油醚约为1∶5的液体洗涤，干燥固体，得到针状结晶1.55g。m.p.219-222℃。结构见图1。
2. 7-羰基脱氢表雄酮悬液配制
称取7-羰基脱氢表雄酮，用芝麻油(Sigma公司产品)配制成2mg/ml和6mg/ml两种悬液。
3.建立慢性轻度应激抑郁症动物模型
本发明采用Monleon等建立的小鼠应激程序并稍加改动，每周应激程序包括以下应激原内容：两次食物剥夺，每次12h；两次饮水剥夺，每次14h；两次彻夜光照；两次湿笼饲养，每次14h；两次冰水游泳，每次5min；两次倒悬，每次30min；两次配对饲养，每次17h。上述之应激原随机组合实施，每天两种应激原处理，连续进行4周。对照小鼠也饲养于同样环境中，但不接触处理组动物和应激原。
4.动物补充7-羰基脱氢表雄酮悬液
应激动物分为模型组、7-羰基脱氢表雄酮低剂量(5mg/kg)、7-羰基脱氢表雄酮高剂量(15mg/kg)三组。7-羰基脱氢表雄酮低剂量、7-羰基脱氢表雄酮高剂量三组小鼠每天早晨8:00按每kg体重5ml腹腔注射2mg/ml或6mg/ml 7-羰基脱氢表雄酮悬液；对照组和模型组动物腹腔注射芝麻油代替7-羰基脱氢表雄酮悬液。
5. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠2％蔗糖溶液饮用量的影响
应激处理4周后，先将小鼠禁食禁水3h，然后将饮用水换成2％蔗糖溶液，测定1h内2％蔗糖溶液饮用量，并经过体重校正。7-羰基脱氢表雄酮能增加抑郁小鼠蔗糖溶液饮用量，逆转抑郁导致的欣快感缺失(图2)。
6. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠自发活动的影响
4周慢性应激处理结束后，在安静环境中将各组BALB/C小鼠分别放入小鼠自发活动箱内(中国医学科学院药物研究所研制)，观察7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠自发活动的影响。7-羰基脱氢表雄酮能增加抑郁小鼠自发活动(图3)。
7. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠空间学习记忆的影响
水迷宫实验在自发活动测定后进行。水迷宫装置包括一直径90cm的圆桶及运动视频捕捉系统组成(北京杰日欧科技公司产品)。实验开始前，向桶内注入清水，水深15cm，调节水温20℃，然后在桶内放置一直径7cm圆形实台，台面没水1cm左右，用碳素墨水将水调黑，以免动物看到实台。开启水迷宫测试程序，标定捕捉视野、实台、虚台及入水点等参数，将动物头朝桶壁放入水中。小鼠在桶中自由游动寻找实台，水桶上方的视频系统捕捉其泳动轨迹。第一次实验时，如果小鼠在120s内找到实台并在台上停留2s，将小鼠迅速取出，用毛巾擦干放回饲养笼；如果小鼠在120s未能找到实台，将小鼠放置台上15s，然后取出擦干放回笼中。水迷宫实验共进行3天，每天上午下午各进行一次。7-羰基脱氢表雄酮能增强抑郁小鼠空间学习记忆能力(图4)。
8. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠T淋巴细胞Con A刺激增殖能力的影响
自发活动测定结束后，将小鼠断头处死。按常规制备小鼠脾脏单细胞悬液在96孔培养板每孔加入细胞悬液(2×106个/ml)100μl和Con A 2μg/ml，对照孔用完全培养基代替Con A。实验和对照均设4复管。培养板置37℃、5％CO2条件下培养72h，培养终止前8h，每孔加入37kBq 3H-TdR(放射比活度0.93TBq·mmol-1)，随后于细胞收集器上收获细胞，滤膜烘干，加入5ml液闪液置于液闪计数仪上测定。7-羰基脱氢表雄酮能增强抑郁小鼠T淋巴细胞对Con A刺激的增殖能力(图5)。
9. 7-羰基脱氢表雄酮对抑郁小鼠NK细胞杀伤活性的影响
用培养液调整细胞密度4×106个ml-1，以小鼠淋巴瘤YAC-1细胞为靶细胞，在96孔培养板上每孔加入75μl脾细胞悬液，按效应细胞∶靶细胞＝50∶1加入75μl YAC-1靶细胞悬液，另设效应细胞和靶细胞对照。每孔150μl，设4平行管，37℃、5％CO2条件下培养10h，采用MTT法测定A值。7-羰基脱氢表雄酮能增强抑郁小鼠NK细胞杀伤活性(图6)。