SARS冠状病毒磷酸化核蛋白(N蛋白)克隆表达及其用途 严重呼吸道综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是去年11月份在中国广东首先报告，并在全球许多地区出现的一种传染性很强的新传染病。2003年4月16日，世界卫生组织宣布，冠状病毒中的一个变种，即一种新型冠状病毒是引起SARS的病原体，并建议命名为SARS冠状病毒(SARS Coronavirus，SARS-CoV)。随后，加拿大，美国和中国等国测定了SARS病原体冠状病毒的全基因序列。病原体的确定以及病毒基因测序工作的完成，为SARS的预防、治疗和诊断研究提供了理论基础。
根据SARS冠状病毒全基因组的生物信息学分析，发现该病毒编码主要蛋白有：(1)病毒复制酶1a，1b；(2)四种结构蛋白：S(纤突糖蛋白)，M(膜糖蛋白)，N(核蛋白)，E(小囊膜蛋白)，以及(3)5-9种功能未知的ORF。目前，对SARS病毒编码的蛋白质结构与功能的认识主要基于对已知的动物和人类冠状病毒认识和生物信息学理论预测，对SARS病毒蛋白在病毒复制过程中的表达特性及其生物学功能尚不清楚。当前最紧要的另一任务是，尽快研制出SARS快速检测技术，实现SARS的快速早期诊断，以便尽快实现SARS病人与其他呼吸道感染的鉴别诊断，尽早控制SARS的传播。
本发明的目的是，根据已公开的SARS冠状病毒基因序列，设计针对N蛋白基因的特异引物，通过RT-PCR扩增并克隆SARS病毒N蛋白基因，经原核系统表达获得了SARS病毒主要结构蛋白N蛋白。表达的SARS冠状病毒N蛋白可以作为抗原，应用于ELISA和蛋白质芯片等SARS病毒诊断检测技术研究和开发，也可应用于SARS病毒药物和疫苗研究，对SARS的防治药物和疫苗以及诊断技术研究具有重要意义。
本发明的主要内容是：
1.SARS冠状病毒N蛋白基因克隆、表达和纯化
根据已经报道地SARS冠状病毒全基因组序列，设计了N蛋白的引物。以浙江病毒株RNA为模板反转录合成cDNA，然后以此cDNA为模板、设计的N蛋白引物和高保真的DNA聚合酶PCR扩增N蛋白基因。扩增得到了N蛋白全长基因，回收目的基因，经Nde I和EcoR I双酶切并回收后和经同样酶切的PET28a大肠杆菌表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布到加有卡那霉素的LB平板上，37℃温箱培养12小时。待长出肉眼可见菌落后，挑取菌落进行菌落PCR，挑选阳性克隆并抽出质粒。所抽质粒一部分以T7引物进行测序，测序结果和国外报道的序列一至。另取部分质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。待长出菌落后，挑取单菌落进行摇瓶诱导表达。当摇瓶中细菌长到OD600＝0.5时加入终浓度为10mM的IPTG，37℃诱导3小时。取少量菌液进行SDS-PAGE分析，结果发现N蛋白获得了高表达。摇瓶获得的菌液经离心收集菌体，菌体用PH8.5的磷酸盐缓冲液充分悬浮，经超声破碎，离心去沉淀和0.45μm滤膜抽虑后，上阳离子柱纯化。所用系统为法玛西亚公司的Biopilot中亚层析系统，所用柱子为法玛西亚公司S柱。收集各蛋白组分后进行SDS-PAGE分析。把有目的蛋白组分的部分混合后把PH值调到7.4，用Ni2+亲合柱纯化。经两步纯化后，得到了纯度超过90％的蛋白样品。
2.SARS病毒N蛋白作为抗原的ELISA检测技术建立
基因重组表达的SARS冠状病毒N蛋白为抗原包被微孔板、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG，以间接酶联法原理(ELISA)检测重症急性呼吸综合症病人血清或血浆样本中抗体，对重症急性呼吸综合症病人进行诊断。检测结果发现，20份SARS康复期病人血清时OD450为0.43±0.05，20份正常人血清时OD450为0.115±0.04，P/N＝3.75，说明特异性好。
附图说明：
图1为N蛋白表达载体构建示意图。
图2为SARS冠状病毒N蛋白基因的PCR扩增。
图3为SARS冠状病毒N蛋白基因的重组表达载体的PCR筛选。
图4为SARS冠状病毒N蛋白的表达与纯化。
实施例
一、SARS冠状病毒N蛋白基因克隆、表达和纯化
1.扩增引物的设计
根据已知的冠状病毒N蛋白(核衣壳蛋白)的基因序列设计了一对PCR扩增引物，为了便于以后的蛋白表达，在引物中分别引入了NdeI和EcoRI酶切位点。序列如下：上游引物5’-GGCAATTGCATATGTCTGATAATGGACC-3’；下游引物5’-CCGAATTCTT AT GCCTG AGTTG AATC-3’。扩增SARA病毒全基因的28105-29373核苷酸位点的N蛋白基因，共1269bp。
2.病毒总RNA的提取
采用TRIZOL(Invitrogen)试剂一步法提取病毒总RNA。简述如下：收集患者血清，加入TRIZOL试剂，每1ml TRIZOL试剂加入200μl氯仿，5min后4℃ 12000×g离心15min，收集水相，加入0.5ml异丙醇，10min后4℃12000×g离心10min，沉淀用75％的乙醇洗一次，空气干燥后，加入无RNase的水，-70℃保存，即得。
3.反转录PCR
按照试剂盒说明书(Reverse Transcription System，Promega公司)分两步进行RT-PCR。RNA样品于70℃ 10min后，42℃反应30min，然后加热95℃ 5min以灭活AMV酶活性及防止AMV酶与cDNA结合，即得PCR模板，-20℃保存。在PCR扩增仪进行反应，PCR条件：变性94℃ 30S，退火58℃ 40S，延伸72℃，60S，循环数35，最后延伸10min.PCR产物用1％琼脂糖DNA电泳(见图1)。
4.原核表达载体的构建
采用宝生物公司的DNA fragment purification kit回收PCR产物，然后用NdeI和EcoRI分别双酶切PCR产物和原核表达载体PET-28a，纯化酶切产物后，在T4 DNA连接酶作用下进行定向连接。如图2所示。
5.基因的鉴定
连接产物转化大肠杆菌DH5α(采用道普生物公司的感受态试剂盒)，涂布到加有卡那霉素的LB平板，37℃温箱培养12小时。挑取菌落用PCR扩增鉴定，DNA电泳，结果正确。并进行DNA测序，测序引物为T7引物，DNA分析表明，序列与报道的完全一致。DNA及氨基酸序列如下所示。
DNA序列 ATG TCT GAT AAT GGA CCC CAA TCA AAC CAA CGT AGT GCC
氨基酸序列M S D N G P Q S N Q R S A
CCC CGC ATT ACA TTT GGT GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AAC
P R I T F G G P T D S T D N N
CAG AAT GGA GGA CGC AAT GGG GCA AGG CCA AAA CAG CGC CGA CCC
Q N G G R N G A R P K Q R R P
CAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGG TTC ACA GCT CTC ACT
Q G L P N N T A S W F T A L T
CAG CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAG GGC GTT
Q H G K E E L R F P R G Q G V
CCA ATC AAC ACC AAT AGT GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TAC
P I N T N S G P D D Q I G Y Y
CGA AGA GCT ACC CGA CGA GTT CGT GGT GGT GAC GGC AAA ATG AAA
R R A T R R V R G G D G K M K
GAG CTC AGC CCC AGA TGG TAC TTC TAT TAC CTA GGA ACT GGC CCA
E L S P R W Y F Y Y L G T G P
GAA GCT TCA CTT CCC TAC GGC GCT AAC AAA GAA GGC ATC GTA TGG
E A S L P Y G A N K E G I V W
GTT GCA ACT GAG GGA GCC TTG AAT ACA CCC AAA GAC CAC ATT GGC
V A T E G A L N T P K D H I G
ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GCT GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT
T R N P N N N A A T V L Q L P
CAA GGA ACA ACA TTG CCA AAA GGC TTC TAC GCA GAG GGA AGC AGA
Q G T T L P K G F Y A E G S R
GGC GGC AGT CAA GCC TCT TCT CGC TCC TCA TCA CGT AGT CGC GGT
G G S Q A S S R S S S R S R G
AAT TCA AGA AAT TCA ACT CCT GGC AGC AGT AGG GGA AAT TCT CCT
N S R N S T P G S S R G N S P
GCT CGA ATG GCT AGC GGA GGT GGT GAA ACT GCC CTC GCG CTA TTG
A R M A S G G G E T A L A L L
CTG CTA GAC AGA TTG AAC CAG CTT GAG AGC AAA GTT TCT GGT AAA
L L D R L N Q L E S K V S G K
GGC CAA CAA CAA CAA GGC CAA ACT GTC ACT AAG AAA TCT GCT GCT
G Q Q Q Q G Q T V T K K S A A
GAG GCA TCT AAA AAG CCT CGC CAA AAA CGT ACT GCC ACA AAA CAG
E A S K K P R Q K R T A T K Q
TAC AAC GTC ACT CAA GCA TTT GGG AGA CGT GGT CCA GAA CAA ACC
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CAA GGA AAT TTC GGG GAC CAA GAC CTA ATC AGA CAA GGA ACT GAT
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TAC AAA CAT TGG CCG CAA ATT GCA CAA TTT GCT CCA AGT GCC TCT
Y K H W P Q I A Q F A P S A S
GCA TTC TTT GGA ATG TCA CGC ATT GGC ATG GAA GTC ACA CCT TCG
A F F G M S R I G M E V T P S
GGA ACA TGG CTG ACT TAT CAT GGA GCC ATT AAA TTG GAT GAC AAA
G T W L T Y H G A I K L D D K
GAT CCA CAA TTC AAA GAC AAC GTC ATA CTG CTG AAC AAG CAC ATT
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GAC GCA TAC AAA ACA TTC CCA CCA ACA GAG CCT AAA AAG GAC AAA
D A Y K T F P P T E P K K D K
AAG AAA AAG ACT GAT GAA GCT CAG CCT TTG CCG CAG AGA CAA AAG
K K K T D E A Q P L P Q R Q K
AAG CAG CCC ACT GTG ACT CTT CTT CCT GCG GCT GAC ATG GAT GAT
K Q P T V T L L P A A D M D D
TTC TCC AGA CAA CTT CAA AAT TCC ATG AGT GGA GCT TCT GCT GAT
F S R Q L Q N S M S G A S A D
TCA ACT CAG GCA TAA
S T Q A
6.目的蛋白的诱导表达
表达质粒的采用promega公司的质粒回收试剂盒提取，然后转化表达菌株B121(DE3)。表达菌株接种到摇瓶，37℃振摇培养，用分光光度计测OD600的值，当OD600大概为0.5时加入终浓度为5mM的IPTG诱导，37℃诱导3小时。离心收集菌体后，菌体用pH8.5的20mM磷酸盐缓冲液充分悬浮。菌悬液在冰浴条件下超声破碎。超声破碎后的溶液，8000rpm(转/分)离心去沉淀，上清用0.45μm的滤膜进行抽虑。
7.目的蛋白的纯化
(1)所用阳离子柱为安玛西亚公司的S柱。阳离子柱先用A液(pH8.5的20mM磷酸盐缓冲液)平衡到基线，然后将上述表达的蛋白样品上柱，然后再用A液平衡到基线。洗脱时，在十个柱体积内，B液(pH8.5的20mM磷酸盐缓冲液+1M NaCl)由0％升高到100％，收集蛋白峰，进行SDS-PAGE。纯度较好的组分混合后，把pH值调到7.4，准备上亲和柱。所用Ni2+亲和柱为安玛西亚公司的亲和预装柱。
(2)亲和柱先用5个柱体积的0.2M的硫酸镍平衡，然后用10个柱体积的A液(20mM PB，500mM NaCl，pH7.4)平衡柱子到基线。然后上样，上样后再用A液平衡到基线。然后洗脱，B液(20mM PB，500mM NaCl，500mM咪唑，pH7.4)在十个柱体积内从0％升高到100％，收集蛋白组分，进行SDS-PAGE。
二、SARS病毒N蛋白作为抗原的ELISA检测技术建立
由上述的基因重组表达SARS病毒N蛋白作为抗原包被微孔板、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG，以间接酶联法原理(ELISA)检测SARS病人血清或血浆样本中抗体，对重症急性呼吸综合症病人进行诊断。
1.试剂盒组成
本试剂盒包括下列主要成分：
(1)重组SARS病毒抗原包被酶联板条 96人份
(2)阳性对照血清 0.5ml/瓶 1瓶
(3)阴性对照血清 0.5ml/瓶 1瓶
(4)样品稀释液 12ml/瓶 1瓶
(5)酶结合物 12ml/瓶 1瓶
(6)显色剂A 6ml/瓶 1瓶
(7)显色剂B 6ml/瓶 1瓶
(8)终止剂 6ml/瓶 1瓶
(9)洗涤液(20×浓缩) 50ml/瓶 1瓶
2.操作方法
(1)取出试剂，15-30℃放置20分钟；每孔加100μl样品稀释液，然后再加入10μl待测样品；包被板均需留空白孔，阴、阳性对照双孔。空白孔加入100μl样品稀释液。直接加入100μl阴、阳性对照血清各双孔，混匀后37℃水浴震荡30分钟。
(2)用1∶20稀释后的洗涤液洗板4次，最后一次拍干。
(3)每孔加100μl酶结合物37℃水浴20分钟，剩余酶结合物4℃保存。
(4)洗板同2。
(5)先加入显色剂A液50μl再加入显色剂B液50μl，37℃水浴避光显色10-15分钟。
(6)每孔加50μl终止液。
3.结果判定
(1)测定：以酶联仪450nm测定各孔OD值(减去空白对照计算)。阳性对照每孔OD＞1.0，阴性对照每孔OD＜0.06试剂盒有效，终止后10分钟内测OD值。
(2)临界值：阴性对照平均OD值+0.05。若阴性对照OD值0.06时，按0.06计算；若＞0.06，按实际OD值计算。
4.注意事项
(1)浓缩洗涤液使用前，用蒸馏水稀释20倍使用。
(2)不同批号试剂不可混合使用。
(3)必须严格控制培育反应板的温度和时间。
(4)记过判定以仪器为准，不能肉眼观察。
(5)样品中血脂、黄胆、血红蛋白对本品检测结果基本不影响。
(6)保存条件2-8℃保存，有效期暂定为12个月，在有效期内使用。
(7)试剂规格为96人份。