筛查鼻咽癌的系统和方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN00808453.X	申请日：	2000.04.28
公开号：	CN1367844A	公开日：	2002.09.04
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回\|\|\|公开\|\|\|实质审查的生效
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/70	主分类号：	C12Q1/68; C12Q1/70
申请人：	先进警戒股份有限公司;
发明人：	R·H·W·恩; V·戴金; J·菲利浦斯
地址：	加拿大安大略
优先权：	1999.04.30 US 60/131,944
专利代理机构：	上海专利商标事务所	代理人：	陈剑华
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内容摘要

公开了筛查和诊断鼻咽癌的新颖的方法。还公开了用于这些方法的DNA引物和DNA探针。

权利要求书

1：一种筛查鼻咽癌的方法，其特征在于，它包括以下步骤： (i)从不患有鼻咽癌的对照病人的鼻咽中取得样品，确定其细胞内EB病毒的数量，确定临界值； (ii)从试验患者的鼻咽中获得样品，确定其细胞内EB病毒的数量，确定试验值； (iii)将试验值与临界值作比较。
2：如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)包括使用PCR技术。
3：如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)包括使用PCR技术。
4：如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)和步骤(ii)各包括PCR技术。
5：如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR技术包括一对引物的使用，该引物能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸的相对链。
6：如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一对引物选自下列序列：                      SEQ ID NO：1/SEQ.ID 2，                      SEQ ID NO：4/SEQ.ID 5，                      SEQ ID NO：7/SEQ.ID 8，                      SEQ ID NO：10/SEQ.ID 11，                      SEQ ID NO：13/SEQ.ID 14，                      SEQ ID NO：16/SEQ.ID 17，                      SEQ ID NO：19/SEQ.ID 20，                      SEQ ID NO：22/SEQ.ID 23，                      SEQ ID NO：25/SEQ.ID 26，                      SEQ ID NO：28/SEQ.ID 29，                      SEQ ID NO：31/SEQ.ID 32，和                      SEQ ID NO：34/SEQ.ID 35。
7：如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR技术包括使用：(i)一对引物，各引物能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸一对相对链中的一条链；和(ii)一标记探针，它能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸成对的双链的各条链，并在核酸聚合酶作用时能释放出可检测的标记片段。
8：如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述一对引物和标记的探针选自以下序列：引物对                                    探针 SEQ ID NO：1/SEQ.ID 2                     SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4/SEQ.ID 5                     SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7/SEQ.ID 8                     SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：10/SEQ.ID 11                   SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13/SEQ.ID 14                   SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：16/SEQ.ID 17                   SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19/SEQ.ID 20                   SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：22/SEQ.ID 23                   SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25/SEQ.ID 26                   SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：28/SEQ.ID 29                   SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：31/SEQ.ID 32                   SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：34/SEQ.ID 35                   SEQ ID NO：36。
9：一种预测患者存在鼻咽癌的诊断方法，其特征在于，它包括以下步骤： (i)获取患者鼻咽部上皮细胞样品； (ii)确定该样品细胞内EB病毒的数量，获得试验值； (iii)将试验值与不患鼻咽癌的受检者的EB病毒数量的预定的临界值比较；和 (iv)试验值超过预定的临界值，预测该患者存在鼻咽癌。
10：如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)包括从患者经口获得上皮细胞样品。
11：如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)包括从患者经鼻获得上皮细胞样品。
12：如权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)包括使用PCR技术。
13：如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述PCR技术包括一对引物的使用，该引物能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸的暴露的链。
14：如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述一对引物选自下列序列：                 SEQ ID NO：1/SEQ.1D 2，                 SEQ ID NO：4/SEQ.ID 5，                 SEQ ID NO：7/SEQ.ID 8，                 SEQ ID NO：10/SEQ.ID 11，                 SEQ ID NO：13/SEQ.ID 14，                 SEQ ID NO：16/SEQ.ID 17，                 SEQ ID NO：19/SEQ.ID 20，                 SEQ ID NO：22/SEQ.ID 23，                 SEQ ID NO：25/SEQ.ID 26，                 SEQ ID NO：28/SEQ.ID 29，                 SEQ ID NO：31/SEQ.ID 32，和                 SEQ ID NO：34/SEQ.ID 35。
15：如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述PCR技术包括使用： (i)一对引物，各引物能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸一对相对链中的一条链上；和(ii)一标记探针，它能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸成对相对链中的各条链，并在核酸聚合酶作用时能释放出可检测的标记片段。
16：如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述一对引物和标记的探针选自下列序列：引物对                                      探针 SEQ ID NO：1/SEQ.ID 2                       SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4/SEQ.ID 5                       SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7/SEQ.ID 8                       SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：10/SEQ.ID 11                     SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13/SEQ.ID 14                     SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：16/SEQ.ID 17                     SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19/SEQ.ID 20                     SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：22/SEQ.ID 23                     SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25/SEQ.ID 26                     SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：28/SEQ.ID 29                     SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：31/SEQ.ID 32                     SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：34/SEQ.ID 35                     SEQ ID NO：36。
17：一种预测患者存在鼻咽癌的诊断方法，其特征在于，它包括以下步骤： (i)从患者的鼻咽中取得含有上皮细胞的活检组织样品； (ii)处理该活检组织样品，将上皮细胞从该样品的非细胞物质中分离出来； (iii)检测该上皮细胞中细胞内EB病毒的存在；和 (iv)如果细胞中检测到存在细胞内EB病毒，预测该患者存在鼻咽癌。
18：如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)包括从患者经口得到上皮细胞样品。
19：如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)包括从患者经鼻得到上皮细胞样品。
20：如权利要求17-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)包括使用PCR技术。
21：如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述PCR技术包括一对引物的使用，该引物能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸的相对链。
22：如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述一对引物选自下列序列：                     SEQ ID NO：1/SEQ.ID 2，                     SEQ ID NO：4/SEQ.ID 5，                     SEQ ID NO：7/SEQ.ID 8，                     SEQ ID NO：10/SEQ.ID 11，                     SEQ ID NO：13/SEQ.ID 14，                     SEQ ID NO：16/SEQ.ID 17，                     SEQ ID NO：19/SEQ.ID 20，                     SEQ ID NO：22/SEQ.ID 23，                     SEQ ID NO：25/SEQ.ID 26，                     SEQ ID NO：28/SEQ.ID 29，                     SEQ ID NO：31/SEQ.ID 32，和                     SEQ ID NO：34/SEQ.ID 35。
23：如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述PCR技术包括使用：(i) 一对引物，各引物能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸一对相对链中的一条链；和(ii)标记探针，它能退火结合于EB病毒中变性DNA寡核苷酸成对相对链中的各条链，并在核酸聚合酶作用时能释放出可检测的标记片段。
24：如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述一对引物和标记的探针选自下列序列：引物对                                           探针 SEQ ID NO：1/SEQ.ID 2                            SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4/SEQ.ID 5                            SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7/SEQ.ID 8                            SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：10/SEQ.ID 11                          SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13/SEQ.ID 14                          SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：16/SEQ.ID 17                          SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19/SEQ.ID 20                          SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：22/SEQ.ID 23                          SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25/SEQ.ID 26                          SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：28/SEQ.ID 29                          SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：31/SEQ.ID 32                          SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：34/SEQ.ID 35                          SEQ ID NO：36。
25： DNA引物，其序列选自：                     SEQ ID NO：1       SEQ.ID 2                     SEQ ID NO：4       SEQ.ID 5                     SEQ ID NO：7       SEQ.ID 8                     SEQ ID NO：10      SEQ.ID 11                     SEQ ID NO：13      SEQ.ID 14                     SEQ ID NO：16      SEQ.ID 17                     SEQ ID NO：19      SEQ.ID 20                     SEQ ID NO：22      SEQ.ID 23                     SEQ ID NO：25      SEQ.ID 26                     SEQ ID NO：28      SEQ.ID 29                     SEQ ID NO：31      SEQ.ID 32                     SEQ ID NO：34      SEQ.ID 35。
26： DNA探针，其序列选自：                     SEQ ID NO：3                     SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：33和 SEQ ID NO：36。

说明书

筛查鼻咽癌的系统和方法
                             技术领域

    本发明一方面涉及筛查鼻咽癌(NPC)的系统(system)。本发明另一方面涉及筛查NPC的方法。

                             背景技术

    鼻咽癌常称为NPC，这两个术语在本发明中可交换使用。NPC发生在两个鼻孔之后和软腭之上的头部深处区域，发生在通常所说的鼻咽处，鼻咽是咽的一部分，它位于鼻的后端，上部连接于颅骨基底，成楔形，侧接咽鼓管和咽隐窝的一对圆枕。后鼻孔在前面形成了空间限制，而在硬腭水平的人造线(artificial line)下划定了鼻咽和口咽之间的界限。

    北美和欧洲高加索人很少患NPC，其年龄调整的(age adjusted)发病率小于十万分之一。相反，中国南部的NPC发病率为十万分之60到80。从这些地方流行病区域迁移出来的人保持着他们的高危状况，并且他们的后代也保持着相对的高危状况。在美国和加拿大，随着亚洲移民的增加，NPC已成为重要的社会和医学问题。

    通常，或用肉眼检查鼻咽部，或当患者出现临床上可见的卫星病灶症状时方可检查出NPC。然后，用局部或全身麻醉剂将患者麻醉后，在鼻咽进行随机的、有计划或有目标的穿孔活组织检查(punch biopsy)，以证实病灶的诊断。然后将活组织检查样品送交组织学分析以确证诊断结论。

    由于难于到达和没有适当训练的造影术和/或特殊的医学器械如内镜的有效性，NPC发生在一般的身体检查不作常规检查的区域。因而，NPC常常长时间内不被发现，无任何信号和症状，直到肿瘤出现质的效应(mass effect)才被检测出来。因此局部淋巴结地扩散是常见的，发生于大多数NPC患者。患者常出现鼻塞、流脓、鼻出血、耳痛或听力下降。还常常涉及颅神经，可能导致面部肌肉症状、吞咽困难、面部疼痛和味觉异常。晚期NPC患者的预后和存活都很差。

    不会令人奇怪的是，如果治疗开始得早，早期疾病患者有优异的预后，且有治愈的可能。相反，晚期NPC患者的预后差。见：(1)“RETROSPECTIVE ANALYSISOF 5037 PATIENTS WITH NASOPHARNGEAL CARCINOMA TREATEDDURING 1976-1985：OVERALL SURVIVAL AND PATTERNS OF FAILURE”，Lee等人，Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.，23卷，第2期，1992，pp.261-270；和(2)“CARCINOMA OF THE NASOPHARYNX：FACTORS AFFECTINGPROGNOSIS”，Perez等人，Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.，23卷，第2期，1992，pp.271-280。

    EB病毒(“EBV”)是具有非常多样致癌潜能的一种人DNA肿瘤病毒。在血清学证据的基础上首次提出了EBV和NPC之间的联系。采用聚合酶链反应(“PCR”)技术可很好确定编码EBV的脱氧核糖核酸实际上存在于所有的活检NPC肿瘤组织和癌变前上皮细胞中，而与组织分化无关。人们已广泛认为在健康组织中不能检测出EBV DNA。

    EBV普遍存在，在所有所寻找的人群中都发现了EBV。世界上90％的成年人携带EBV。EBV独特地隐藏在B淋巴细胞的一个小亚组中，并分泌于唾液和泌尿生殖道中。一个月有几次(随意的间隔)相当高浓度的传染性病毒颗粒释放出来。还从子宫颈中分离出EBV，它包含在B淋巴细胞中通过血液循环。EBV感染比他们产生的癌症要常见得多。被感染通常无症状，恶变是相对少见的后果。

    已研究了对EBV的免疫应答，以用作预测NPC的可能筛查工具。最初的血清学研究证明病人比对照有更高的抗体滴度和更强的沉淀带，这表明了在该疾病中EBV起了病原性作用。在大多数鼻咽癌患者中，经常观察到抗-EBV-VCA的血清IgA滴度升高，升高程度与NPC肿瘤块的大小有些相平行。虽然大多数鼻咽肿瘤有阳性IgA滴度，但大多数的阳性滴度并不能反映阳性肿瘤。这种筛查方法的不足之处是以不同的截止点测得的灵敏性或特异性不令人满意。由于许多阳性检测结果中仅有少数表明是NPC，所以这种检测的特异性有问题[特异性＝(真阴性)/(真阴性+假阴性)]。筛查试验的特异性是该试验区别无异常健康个体能力的一种指标。

    虽然不能清楚地了解在NPC的发展中EBV如何介入，但据认为EBV感染是NPC的辅助因素和先兆(precursor)。认为EBV是通过上皮细胞的微小病损感染分层上皮细胞层的基底细胞，即基底层，产生的被感染的子代细胞开始并在基底层上延续。这些子代细胞离开基底层，并通过通常的细胞运动迁移到分层上皮细胞层的最上层即角质层。虽然可能要过数年才会看见病灶，但是几乎从它们开始从基底层迁移出来的第一天起，EBV感染的和癌性细胞就普遍存在于鼻咽中。收集这些细胞以筛查EBV基因组的存在；这些基因组是可进行恶性推测和可预测NPC存在的代用标记。

    鼻咽处于鼻孔后深部，其样品可以经鼻(transnasally)或经口(transorally)获得。经鼻途径会让人不舒服，且难于在具有解剖异常如中隔偏离的病人身中实行。而且，出血可能是个问题，因为将活检检查器械横向穿过鼻孔时，可能使鼻粘膜表面受伤。由于经口途径相对舒服，且到达鼻咽的方法不会造成创伤，出血最少或不出血，因此是理想的途径。

    通常，一个月有几次(随机间隔)相当浓度的传染性病毒颗粒排泄到唾液中，且在之后的几天它们可残留在嘴里。因而，理想的是设计出一种活检检查器械，使其在通过口腔到达鼻咽时避免发生被唾液或口腔粘膜组织的EBV污染。NPC细胞含有比所有可能从唾液得到的病毒污染的总和还多得多的病毒基因组。因而，还需要通过设计活检检查器械使NPC筛查具有最大灵敏度，这样，可最大程度减少或排除样品收集区域与唾液或非鼻咽组织的接触。

    在待授权的国际专利申请PCT/CA 00/00242[Ng等人(NG)]中描述了一种新颖的活检器械和获得活检样品的方法。本文将这种装置称为Ng装置。

    Ng装置代表了用于筛查NPC的活检样品收集领域的重大进步。

    在Ng装置发展之前，检测NPC的主要方法涉及采用具有相对侵袭性的经鼻和经口方法，以获得穿孔活检样品。然后将该穿孔活检样品送到病理学实验室，进行患者的NPC诊断。

    Ng装置的出现在较佳实施例中使得能收集筛查NPC的活检组织刷(brushbiopsy)。收集这种活检样品，然后分析EB病毒(“EBV”)的存在。在正确使用Ng装置的过程中，由于所收集的样品保持为相对无菌的形式(即基本上没被污染)，因此所进行的试验仅仅是检测样品中EBV存在与否。样品中存在EBV表明患者患有NPC。

    对于先前的活检组织收集技术，本领域并不知或未提议过甚或希望过确定样品中EBV的数量。故仍然需要一种简单的程序或方法，它们可在高危人群中在流动的背景下常规地进行NPC(尤其是疾病早期)存在的大量筛查。

                             发明的公开

    本发明的一个目的是提供一种新颖的筛查鼻咽癌的方法，该方法避免或减少了现有技术的至少一个缺点。

    本发明的另一目的是提供一种新颖的诊断鼻咽癌的方法，该方法避免或减少另外现有技术的至少一个缺点。

    因此，一方面，本发明提供一种筛查鼻咽癌的方法，它包括以下步骤：

    (i)从不患有鼻咽癌的对照病人的鼻咽中取得样品，确定其细胞的EB病毒的数量，确定临界值；

    (ii)从测试患者的鼻咽中取得样品，确定其细胞的EB病毒的数量，确定试验值；

    (iii)将试验值与临界值进行比较。

    另一方面，本发明提供一种诊断方法，预测患者中鼻咽癌的存在，它包括：

    (i)获取患者的鼻咽上皮细胞样品；

    (ii)确定该样品中细胞EB病毒的数量，以获得试验值；

    (iii)将试验值与不患鼻咽癌的受检者的EB病毒数量的预定的临界值比较；和

    (iv)试验值超过预先确定的临界值，可预测患者患有鼻咽癌。

    又一方面，本发明提供一种诊断方法，预测患者中鼻咽癌的存在，它包括：

    (i)从患者的鼻咽中获得含有上皮细胞的活检样品；

    (ii)处理该活检样品，将上皮细胞从该样品的非细胞物质中分离出来；

    (iii)检测该上皮细胞中细胞EB病毒的存在；和

    (iv)如果在该细胞中检测到细胞EB病毒的存在，那么可预测患者存在鼻咽癌。

    在整篇说明书中进行了样品中和/或样品的细胞中EBV或EB病毒存在数量的确定或检测。应理解这包括EBV或EB病毒的DNA、RNA、蛋白质和其他任何独特的指示器。虽然本发明实施例是通过确定或检测(尤其是采用PCR)EBV基因组的数量或EB病毒基因组来进行描述的，但是这仅仅是为了方便，而本发明的较佳实施例不应用于限制本发明的范围。

    本发明者已发现了一种新颖的筛查NPC以诊断NPC的方法以及该方法的体系。对于从患者鼻咽中获得的样品，该方法可与能提供细胞EBV基因组和所有EBV基因组之间的差异的任何方法(如这样一种方法，从非细胞材料中洗出样品中的细胞，这样可对细胞EBV基因组作可被特异性地检测或数量确定)一起应用。

    此新颖方法一方面是以从患者的鼻咽中获得样品和确定该样品中存在的EBV数量为基础(这可以包括细胞性和非细胞性EBV)。之后，将在该样品中检测到的EBV数量与预先确定的临界值比较。通常，该预先确定的临界值是在无NPC的患者中测得的EBV数量，例如该患者的非细胞性EBV数量(通常在唾液、口腔和鼻咽的其他区域)。如果样品中的EBV数量高于该临界值，这表明该患者患有NPC。如果样品中的EBV数量低于该临界值，表明患者没有患NPC。

    通过确定活检样品中EBV存在的数量，避免或减少了患者NPC假阳性和假阴性的发生。

    另外，由于确定的EBV的临界量与患者口腔和其他与鼻咽无直接关系区域中(即在EBV应被检测的感兴趣的特殊的位点)存在的EBV最大聚集量相同，而提出活检收集过程中样品的污染是无实际意义的，所以本发明考虑采用Ng装置的简化或改进形式。

    此新颖方法的另一方面涉及处理(如洗涤或类似的方法)从患者鼻咽中获得的含有上皮细胞的样品，以将上皮细胞从非细胞材料中分离出来，然后检测上皮细胞中EBV的存在(即上皮性EBV)。此分离方案导致了样品中非细胞性EBV的去除，因而避免了产生假阴性结果。

                             实施本发明的最佳实施例

    如上所述，Ng装置代表了活检组织样品收集装置(具体是用于筛查NPC的装置)领域的重大进步。

    如在Ng中所述的，该Ng装置是“有鞘的”装置。这样，在使用中，Ng装置的样品收集刷套在鞘中，直到该装置处于正确的位置。在该点，暴露刷子，采集样品，然后将刷子收回鞘中。这种鞘状的安排保持了上皮细胞样品的完整性，并帮助避免了污染，特别是受到患者口腔和其他远离鼻咽区域的EBV污染的发生。

    因而，如果不正确使用Ng装置(如刷子在该装置处于正确位置前暴露)，那么就有受污染的危险，导致在筛查过程中出现假阳性。另外，如果要修改Ng装置的较佳实施方式，例如除去鞘，那么由于刷子接触到患者口腔和其他远离感兴趣区域(即远离鼻咽)的整个内部腔隙，其受污染的风险将大大增加。

    因而，本发明者已发现，通过确定样品中EBV的数量并将其与预先确定的临界值比较有可能避免这些与污染有关的问题。如果样品中EBV数量高于临界值，这是该患者的NPC阳性指示。如果样品中的EBV数量低于临界值，这是该患者的NPC阴性指示。可从对照者即NPC阴性个体确定该预定的临界值。因而，可将该预定的临界值加入对照数据库(用作NPC筛查方案中的比较目的)中，即使用该筛查方案时不必每次都确定NPC阴性患者的EBV数量。

    在本发明的一个方面，预处理样品，以将上皮细胞从非细胞物质中分离出来，之后，可检测样品的上皮细胞部分有无EBV。此时，可不必确定NPC阴性患者的EBV数量。

    确定样品中EBV数量的具体方式不受具体限制。较佳的是，采用聚合酶链反应(“PCR”)技术来确定样品中EBV的数量。虽然常用PCR技术，但迄今为止，尚不知道可使用其来确定样品(具体是含有上皮细胞的样品)中的EBV的数量以筛查NPC。如果样品是含有上皮细胞的样品，那么优选该样品是使用经鼻或经口方法获得的。

    PCR是一种生化过程，在该过程中，DNA(脱氧核糖核酸)的某特定区域被反复复制(即以链式反应方式扩增)，这样可获得用于生物化学研究的大量的感兴趣的DNA拷贝。PCR过程的优点可检测出少量的DNA并进行研究。

    下面是该过程的一般描述。许多特有的细节可在美国专利4683195中找到[Mullis等人，(Mullis)]。更佳的是，采用美国专利5210015[Gelfand等人，(Gelfand)]所述的PCR方式。为支持目的，这两份参考文献的书面说明书明确纳入本文作为参考。

    因而，如本领域所周知的，DNA是含有人类细胞遗传密码的生化结构。DNA的基本构件是四种核苷酸碱基：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。还已进一步知道，DNA是双螺旋结构，两条链相互配对，其中A与T配对，C与G配对。DNA存在于所有细胞的细胞核中。

    为了发生该复制过程，需要一种酶来催化A与T、C与G之间的配对。本质上，该酶是聚合酶。当DNA链随着碱基对的增加而变长时，发生了聚合作用。

    “引物”是含有核苷酸碱基的DNA短序列。在PCR过程开始时引发扩增需要引物。引物将杂交或退火结合到感兴趣的DNA序列的起点，然后聚合酶将开始将碱基加到引物序列的末端以加长该DNA序列。因而，如本领域周知的，引物是互补DNA的特定序列，它能识别感兴趣的该DNA序列区域。在本说明书下面的序列表中列出了适用于本发明的不同引物。

    PCR反应通常分3个阶段进行。

    第一阶段，双螺旋结构的两条DNA链被分开(也称为“解链”或“变性”)。这通常在生化试剂的存在下通过加热该DNA样品而达到。

    反应第二阶段，通常降低样品的温度，加入引物，使其结合或“退火”到感兴趣DNA链的特定区域。

    在第三阶段，加入聚合酶和核苷酸，再次升高样品的温度以发生碱基配对的生化过程。

    这三个阶段称为一种单“循环”，其结果复制可样品中DNA的新的和精确的序列。每条新合成的DNA序列又可作为复制的模板，因此，该过程经多次循环以指数方式显著地扩增。实际上，在30或40轮循环扩增后，DNA的量通常足够用于进行检测和生化分析。

    为了检测和确定产生的DNA的量，通常将所用的引物接上荧光染料。然后使用例如激光装置诱导含有新合成的带有该荧光标记引物的DNA全长序列的最终产物和发出荧光。之后分析激光诱导的荧光信号的量，并与作为标准的含有已知量荧光标记PCR产物的标准对照比较。将荧光信号随着扩增循环增加而增加的标准曲线作为基线水平。

    检测和确定所产生的DNA的量的另一更佳方法涉及采用Gelfand所述的标记的寡核苷酸探针。如Gelfand所述，可有利地用核酸聚合酶的5′到3′核酸酶活性来将退火的标记寡核苷酸从杂交的二倍体中切割下来，从而释放出标记寡核苷酸用于检测。在本说明书下面的序列表中列出了这些适合用于本发明的不同的探针。

    通常机械性(如在液氮冷冻条件下研磨成粉)和生化性(如使用裂解缓冲液)处理含有感兴趣DNA的细胞样品，以释放出其细胞核内容物，包括细胞的DNA。然后采用标准的酸夸拟定鎓(qtuanidinium)硫氰酸酯-苯酚法处理分离的DNA。对于扩增和研究EBV中PCR的应用，参考了N.ENGL.J.MED.，1992；326：17-21的说明。

    由于许多正常或健康的活检组织样品中也可能含有低水平的EBV基因组(由于受口腔倒流的污染或存在感染的健康细胞)，本文所述的PCR定量方法特别的优点是去除了“背景”或污染水平，因此避免了假阳性的发生。由于NPC肿瘤细胞的EBV基因组拷贝比可能由污染源得到的聚集物多得多，因此从NPC得到的EBV基因组水平的进一步扩增将会放大这些差异。因而，“临界值背景污染”水平不难确定。对于给定样品，超过此水平为阳性，表明存在NPC。

    或者，可以处理活检组织样品以从细胞的EBV基因组(筛查NPC时感兴趣的)中分离出非细胞的EBV基因组(筛查NPC时不感兴趣的)。这可通过使用缓冲液和其他已知试剂洗涤样品方便地进行。

    另外，确定样品中EBV基因组数量的能力可能导致不同预测因子的建立，这些预测因子有助于在没表现出NPC症状的患者中如何证明有NPC。因而，使用定量性PCR确定的EBV基因组水平可获得用于高危个体中NPC筛查的参考数据。这使得可相对早地检测出NPC，对患者这样导致了对患者好得多的预后，这是本发明的显著优点之一。

    虽然本发明以阐述性实施例进行了描述，但是这种描述不应认为是限制性的。因而，可对这些阐述性实施例以及本发明的其他实施例进行不同修改是本领域熟练技术人员所明白的。因此，下面的权利要求书中将包括任何这样的修改或

    实施例。

    本文所涉及的所有的出版物、专利和专利申请都在相同程度上被完整地纳入作为参考，如同各出版物、专利或专利申请明确地和单独地被完整地纳入作为参考一样。

                              序列表<110>先进警戒股份有限公司(Advance Sentry Corporation)<120>筛查鼻咽癌的系统和方法<130>T846451WO<140><141><150>US60/131944<151>1999-04-30<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物510F)<400>1gcaaatggcg  gtgttatgaa                    20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物580R)<400>2ggcttgggaa gtgacaggtc                   20<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(532T)<400>3aaaaggatgg gagcctctct gttgctgt       28<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物21F)<400>4agggctttgc ctgcctaac                     19<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物90R)<400>5caatgtgagc cgcgaacc                    18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(52T)<400>6tcgaaaccca ccgcaaccgc                   20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物43F)<400>7ggagacgtgt gtggctgtag c                 21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物143R)<400>8gaagacggca gaaagcagag tc              22<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(90T)<400>9tggtgaggac ggtgtctgtg gttgtc                26<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物793F)<400>10caggcgcaag tgtgtgtaat tt                  22<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物859R)<400>11gtgggcgggc caagatag                    18<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(818F)<400>12ctccagatcg cagcaatcgc gc                22<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物409F)<400>13gtcgtctccc ctttggaatg                       20<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物483R)<400>14aataacagac aatggactcc cttagc             26<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(432T)<400>15cctggacccg gcccacaacc                20<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物53F)<400>16ctgattctgc agcccagaga gta              23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物127R)<400>17gcggtctatg atgcgacgat                   20<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(77T)<400>18tctcagggca tcctctggag cctg            24<210>19<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物244F)<400>19gccttgtccg gccatct                17<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物310R)<400>20tgatgtcgtg tggaggcaac            20<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(262T)<400>21ttagacacgg aagacaatgt gccgcc           26<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物131F)<400>22cgcaaaaaag gagggtggtt                 20<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物230R)<400>23ctgcaatgtt ctcaaatttc gg                 22<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物154T)<400>24aaagcatcgt ggtcaaggag gttcca             26<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物1F)<400>25tgaataccac caagaaggtg gc                22<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物65R)<400>26cctgctctat cgctcccg                 18<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(24T)<400>27cagatggtga gcctgacgtg ccc                 23<210>28<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物159F)<400>28ctggtcacct cctttgtttt caa                 23<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物229R)<400>29gcgactctgc tggaaatgat g          21<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(183T)<400>30ctcttccgtc aattgtggag ggcct              25<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物88F)<400>31tgagagcaaa ggaatagagg acaa              24<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物167R)<400>32ggcgctactg ttttggctgt ac                 22<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(114T)<400>33agggctcctc cagtccagtc actcataac            29<210>34<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物SENTRY1-FOR)<400>34cttaggtatg gagcgaaggt tagtg            25<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸(DNA引物SENTRY1-REV)<400>35gcatctctta ggtccctcaa catt             24<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：DNA探针(SENTRY1-PROBE)<400>36tggtgctgct ttacctggca cctga           25