一种3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原及其制备的抗体技术领域
本发明涉及一种3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原及其制备的抗体。
背景技术
3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹乙醇、乙酰甲喹和喹烯酮在动物体内产生的代谢物。由于能够抑制多种革兰氏阳性菌和阴性菌，并且对畜、禽、鱼肉类等具有明显的促生长作用，喹噁啉类药物(包括喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮等药物)在我国的应用十分广泛。研究发现，喹噁啉类原形药物及代谢物存在着明显的安全性问题，具有明显的致畸、致癌、致突变、光敏和肾上腺皮质损害等毒副作用，严重危害了人和动物的健康。
欧盟于1998年发文禁止在饲料中添加喹乙醇，在我国仅被批准用于35kg以下的猪使用。乙酰甲喹批准的是原料和片剂，规定用作猪痢疾和猪、牛细菌性肠炎的治疗药。3-甲基喹噁啉-2-羧酸是世界粮农组织和世界卫生组织所属的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)确定的喹噁啉类药物残留的标志物和监控对象。国际上有关喹噁啉类药物的最高残留限量规定非常严格。欧盟规定卡巴氧和喹乙醇以及其代谢产物在动物性食品中不得检出而且规定这两种兽药禁止销售。我国农业部公告第235号规定，喹乙醇最高残留限量为喹乙醇+3-甲基喹噁啉-2-羧酸：4ug/kg(肌肉)，50ug/kg(肝脏)，2mg/kg(饲料)。
我国进行残留监测时，常采用免疫化学分析进行初筛，仪器方法进行确证。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原及其制备的抗体。
本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将3-甲基喹噁啉-2羧酸进行结构改造得到的化合物，既最大程度保留了3-甲基喹噁啉-2羧酸的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。
本发明还保护式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：将3-甲基喹噁啉 -2羧酸和γ-氨基丁酸反应，获得所述化合物。所述3-甲基喹噁啉-2羧酸和所述γ-氨基丁酸的质量比具体可为1∶2。所述反应具体可采用吡啶作为催化剂。
本发明还保护一种3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物。所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为(11-8)∶1。所述偶联比指的是摩尔比。式(I)所示化合物与所述载体蛋白具体可通过活性酯法偶联。所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原如式(II)所示。所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。将所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。将所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原包被酶标板，也可以用于喹乙醇代谢物(3-甲基喹噁啉-2羧酸)抗血清的检测。包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。
所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原可用于制备3-甲基喹噁啉-2羧酸特异性抗体。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
以所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原为免疫原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还保护一种杂交瘤细胞，命名为抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2(简称杂交瘤细胞5A2)，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5778。
所述杂交瘤细胞5A2分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。
所述3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原可用于检测喹乙醇代谢物(如3-甲基喹噁啉-2羧酸或喹噁啉-2羧酸)。
所述抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)可用于检测喹乙醇代谢物(如3-甲基喹噁啉-2羧酸或喹噁啉-2羧酸)。
本发明对于喹乙醇代谢物(3-甲基喹噁啉-2羧酸)的检测具有重大价值。
附图说明
图1为3-甲基喹噁啉-2羧酸人工抗原的紫外光谱图。
图2为采用3-甲基喹噁啉-2羧酸制作的标准曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。卵清蛋白简称OVA。
3-甲基喹噁啉-2-羧酸购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，产品目录号为81121，结构示意见式(III)。
N，N-二甲基甲酰胺(DMF)如式(IV)所示。
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)如式(V)所示。
式(V)
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)如式(VI)所示。
实施例1、制备3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原
一、3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原的制备
1、称取3-甲基喹噁啉-2-羧酸10mg，置于10mL反应瓶中；加入适量丙酮和少量DMF使其完全溶解(丙酮作为反应体系溶解3-甲基喹噁啉-2-羧酸，DMF的作用是促进溶解)，加入亚硫酰氯10μL(作用为活化羧基)，加热回流反应1h；然后加入正己烷0.5ml并用氮气吹至体积恒定，然后加入正己烷0.5ml并用氮气吹至体积恒定，然后加入正己烷0.5ml并用氮气吹至体积恒定，得到溶液I。
2、称取20mg γ-氨基丁酸，溶于1ml 2mol/L的KOH水溶液(作为反应体系溶解γ-氨基丁酸)中，加入0.5ml吡啶(作为3-甲基喹噁啉-2-羧酸和γ-氨基丁酸发生反应的催化剂)，得到溶液II。
3、在冰浴中将溶液I逐滴加入到溶液II中，搅拌反应1.5h，然后用6mol/L HCl调pH至6.0左右，用二氯甲烷萃取两次(每次5ml)，合并两次萃取的有机相，用水洗涤3次，将有机相用无水酸钠干燥后进行旋蒸浓缩，得到15mg产物，即为3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原，以下简称MQCA-GABA。
二、3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原的表征
对步骤一制备的产物进行元素分析，结果如下：
C：61.51；H：5.52；N：15.40；O：17.57
结果表明，步骤一制备的产物为式(I)所示化合物。
实施例2、3-甲基喹噁啉-2-羧酸人工抗原的制备和表征
一、3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原的合成和表征
1、3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原的制备
(1)将10mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于2mL N，N’-二甲基酰胺中，加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液III。
(2)将30mg牛血清白蛋白加入2mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液IV。
(3)将溶液III缓慢滴加至溶液IV中，缓慢搅拌24h后入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，然后于4℃条件下，8000rmp离心30min，取上清，即3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存。3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原简称MQCA-BSA，3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原溶液简称MQCA-BSA溶液。
(4)将MQCA-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原MQCA-BSA溶液中的MQCA-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。MQCA-BSA溶液中的MQCA-BSA浓度为6.2mg/ml。
2、3-甲基喹噁啉-2-羧酸人工抗原的鉴定
将MQCA-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使MQCA-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL MQCA-GABA的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。
溶液乙的最大吸收波长值为297nm，溶液丙的最大吸收波长值为280nm。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。
分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，式(I)所示化合物和BSA的偶联比为11∶1，即11个式(I)所示化合物结合1个BSA。
二、3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原的制备和表征
1、3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原的制备
用卵清蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤一的1。
3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原简称MQCA-OVA，3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原溶液简称MQCA-OVA溶液。
MQCA-OVA溶液中的MQCA-OVA浓度为3.2mg/ml。
2、3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原的表征
用MQCA-OVA代替MQCA-BSA，用OVA代替BSA，其它同步骤一的2。
式(I)所示化合物和OVA的偶联比为8∶1，即8个式(I)所示化合物结合1个OVA。
实施例3、3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体的制备
Balb/c小鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司；
SP2/0骨髓瘤细胞：购自Siggma-Aldrich公司，产品目录号为08060101。
一、动物免疫
将实施例2制备的MQCA-BSA溶液免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μgMQCA-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，后三次的免疫方式为腹膜内注射。
二、细胞融合与克隆化
1、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。
2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到可以分泌3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将一株杂交瘤细胞株命名为抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2(简称杂交瘤细胞5A2)，于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5778。
三、细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞5A2制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、增量培养法
细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。
将杂交瘤细胞5A2置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液(-20℃保存)。
单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。
采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为24.1mg/ml。
2、腹水制备
Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞5A2(5×105个/只)。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。
五、单克隆抗体的鉴定
将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：
1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒(Sigma公司产品，产品目录号为19285)检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1。
2、利用非竞争性ELISA法测定单克隆抗体的亲和力
(1)用MQCA-OVA作为包被原包被酶标板
采用实施例2制备的MQCA-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释)进行包被，100μL/孔；分别设置以下MQCA-OVA包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。
(2)4℃孵育16小时。
(3)封闭并洗板。
(4)每孔加入100μL单克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀释液中的蛋白质浓度分别为1.25、0.625、0.3125、1.5625×10-1、7.8×10-2、3.9×10-2、1.95×10-2、9.75×10-3、4.88×10-3、2.44×10-3、1.22×10-3、6.1×10-4mg/L；每种稀释液设置三个复孔。
(5)室温孵育2h，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。
(7)洗板。
(8)加入TMB显色液，避光显色15min。
(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
以单克隆抗体中的蛋白质浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标制作曲线。
每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S曲线的顶部，对应的OD450值设定为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。采用1μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为4.2×10-12mol/L。采用0.5μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为19.4×10-12mol/L。采用0.25μg/mL包被浓度，50％ODMAX 对应的抗体浓度为185.7×10-12mol/L。采用0.125μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为415.8×10-12mol/L。
将4个浓度两两一组，根据公式计算单克隆抗体的亲和常数
Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t1-[Ab]t2)
公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t1、[Ab]t2分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。例如：1μg/mL包被浓度、50％OD450对应的抗体浓度为4.2×10-12mol/L，0.5μg/mL包被浓度、50％OD450对应的抗体浓度为19.4×10-12mol/L，Ka＝(2-1)/2(2×19.4×10-12-4.2×10-12)＝14.4×109M-1。依次类推，得到其余5个Ka值，分别为1.4×109M-1、0.7×109M-1、2.0×109M-1、0.9×109M-1、1.0×109M-1，取平均值计算得出单克隆抗体的亲和常数为3.4×109M-1。
3、单克隆抗体灵敏度的计算
(1)采用实施例2制备的MQCA-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液进行稀释)进行包被，100μL/孔；MQCA-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。
(2)4℃孵育16小时。
(3)封闭并洗板。
(4)每孔加入50μL 3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准品溶液(由3-甲基喹噁啉-2-羧酸和PBS缓冲液组成；3-甲基喹噁啉-2-羧酸的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。
(5)每孔加入50μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液。
(6)室温孵育2h，洗板。
(7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。
(8)洗板。
(9)加入TMB显色液，避光显色15min。
(10)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
将采用各个浓度的标准品溶液得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图2。
对照图2，得到纵坐标数值等于50％时对应的3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度即为IC50值。单克隆抗体检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的灵敏度(IC50值)为3.1ng/mL。
4、交叉反应率的计算
(1)至(3)同步骤3的(1)至(3)。
(4)每孔加入50μL结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成；结构类似物的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。
(5)至(10)同步骤3的(5)至(10)。
将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50％时对应的结构类似物浓度(μg/L)，即结构类似物的IC50值。
表1交叉反应率
购买途径 IC50 交叉反应率
MQCA Dr.Ehrenstorfer公司，货号为81121 3.1 100％
QCA 武汉汇丰达，货号87-96-52 7.2 43.2％
喹乙醇 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，货号C 15716500 无 ＜0.1％
喹烯酮 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，货号C 16709000 无 ＜0.1％
卡巴氧 sigma公司，货号C6770 无 ＜0.1％
乙酰甲喹 Sigma-Aldrich公司，货号MO-189 无 ＜0.1％
实施例4、3-甲基喹噁啉-2-羧酸多克隆抗体制备及ELISA竞争抑制实验
新西兰大白兔：购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
将新西兰大白兔以实施例2制备的MQCA-BSA溶液进行免疫(免疫方式为颈背部皮下多点注射)。每只兔子每次免疫1mg(以BSA量计)，每两周免疫一次，共免疫7次，第三次免疫开始，每次免疫之后的第7天，耳缘静脉采血，取血清，即多克隆抗体，放于-20℃环境保存。
建立间接ELISA方法(见实施例3的步骤五的3；采用100ng/mL的3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准品溶液，将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，用倍比稀释的血清代替单克隆抗体溶液。
分析结果表明，与对照孔相比，加入3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准品溶液的各孔的吸光值明显下降，随着血清稀释倍数的增加，吸光值呈明显的递减梯度。说明获得的兔血清能够特异性地识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸。