全氟化合物降解菌基因、其合成方法及其应用.pdf

本发明涉及一种全氟化合物降解菌基因、及其合成方法及应用。该降解菌基因的序列为SEQIDNO：1所示的碱基序列。采用本发明的降解菌基因对全氟化合物进行降解，其降解率可达到75%左右。本发明对利用微生物降解技术来实现全氟化合物工业污染的治理具有重要的理论指导及实际应用价值。

权利要求书
1.  一种全氟化合物降解菌基因，其特征在于该降解菌基因的序列为SEQIDNO：1所示
的碱基序列。

2.  一种合成根据权利要求1所述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于该方法的具体步骤为：
配制质量分数为1%～50%的土壤溶液，充分静置后，取上清液作为初始菌种液；添加全氟有机化合物作为菌株生长的诱变因子，使其初始浓度为100毫克每升至～1×105克每升，在37摄氏度和100～200转每分钟转速下培养至菌液浑浊；以10%转接量接入新鲜菌液，并梯度增加全氟化合物的浓度，至全氟化合物的终浓度达到初始浓度的1～10倍，在同样条件下培养至菌液浑浊；
将步骤a所得菌液采用稀释涂布和反复划线分离方法，获得能够正常生长的微生物；具体稀释步骤如下：
b-1.从步骤a所得的浑浊菌液取出50～100微升，加入到含有3～5毫升无菌水内；然后，振荡小试管使菌液与无菌水混合均匀，得混合液，编号标记；
b-2.将步骤b-1所得混合液中再取出50～100微升液体，加入到第二支含有3至5毫升无菌水的10毫升规格的小试管内，振荡混合均匀；重复操作10～15次；并按顺序依次编号；
b-3.从每个编号中取出混合液均匀涂抹在固体培养皿中，并编好相应号码，放入37摄氏度的生化培养箱中培养至出现菌落；
采用基因组试剂盒对步骤b所得微生物进行基因组DNA快速提取，即得到全氟化合物降解菌基因。

3.  根据权利要求2所述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于上述步骤c的具体方法为：
c-1.将上述步骤b所得微生物配制成菌体密度OD600为0.8～1.2浓度的菌液，培养
7～12小时的菌液作为被测试对象，将没有加菌的培养液作为测吸光度时的空白对照；
c-2.在10000rpm转速下离心分离30s；弃上清液，再加入Digestion消化液，并吹打均匀；再加入10mg/mL蛋白酶K，混均匀后在56℃水浴锅内消化30~60min至完全透明；消化完全后，再加入RNase酶，室温消化5min；加入BDBuffer混均，在70℃温度下消化10min；加入无水乙醇混均；将所有液体移入回收柱内，在转速为12000rpm的离心机内离心3min；舍弃上清液，加入PWSolution，在转速为10000rpm下离心1min，离心后弃上清液；在转速为10000rpm下离心2min；将回收柱移入离心管内，在吸附膜正中央加入经65℃~80℃下预热后的ElutionBuffer，在60℃水浴锅内水浴5min；水浴结束后，在转速为10000rpm下离心1min即得到基因组提取液。

4.  一种降解全氟化合物的方法，采用根据权利要求1所述的降解菌基因，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.将降解菌加入到液体培养基中，降解菌的体积为液体培养基的5%～20%；
b.再在步骤a所得液体培养基中加入浓度为100mg/L～1×105g/L每升的全氟有机化合物；
c.在35～38摄氏度，转速为100～200转每分钟的振荡培养箱中培养至菌液完全浑浊；
d.从步骤c所得液体培养基中取出10～50毫升，离心后取上清液体，然后，从上清液体里取7～10毫升用作离子色谱测定分析液；
e.剩下的液体培养基进行萃取，分别收集有机层和水层，再采用旋转蒸发仪对有机相和水相进行旋干；
f.水相旋干瓶内加入氘代乙醇或重水进行H1NMR和19FNMR检测分析；
g.有机旋干瓶内加入等体积的三氟乙酸乙酯标准溶液作为内标和DMSO-d，进行H1
NMR和19FNMR检测分析；根据19FNMR测试结果中氟信号强度比，计算出全氟化合物大致的降解率。

说明书全氟化合物降解菌基因、其合成方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种全氟化合物降解菌基因、及其合成方法及应用。
背景技术
[0002]一、PFOA在工业上的使用
全氟有机化合物(perfluorinatedcompounds，PFCs)由于分子中的C-H键全被C-F键所取代，而氟元素具有较大的电负性和较小的原子半径，使其形成的C-F键高度极化，键能极大(484千焦每摩尔)，表现出以下两方面的特殊性质：
（1）氟碳链既疏水又疏油和氟碳链之间很弱的相互作用使这类物质在水中呈现很高的表面活性，这是其他任何非氟表面活性剂所不能达到的表面活性；
（2）氟原子独特的几何尺寸和电负性等因素使这类物质具有很高的热稳定性、很高的耐强酸、高浓度碱和强氧化剂等化学稳定性；
全氟辛酸(PFOA)作为一种典型的全氟化合物，由于其具有优良的热稳定性、化学稳定性、高表面活性和疏水、疏油等性能，被大量应用于聚合物添加剂、农用化学品、表面活性剂、合成洗涤剂、化妆品、纺织品、毛毯制造、室内装璜、皮革制品、不粘锅和电子工业、药物、航空业、电镀等诸多领域。
[0003]例1：PFOA作为工业原料在金属表面处理特别是特殊涂层处理方面有较多的应用，最为典型的是制造特富龙（美国杜邦公司注册的氟聚合物商标名）的基本加工助剂，也是人工制造的含氟聚合酸。
[0004]二、全氟化合物的毒性与环境污染
从第一个全氟化合物被生产至今的50多年里，由于全氟化合物在全球范围内的大量使用，随着科学技术的发展和环境科学界对其研究的日益深入，人们逐渐认识到全氟化合物具有的化学稳定性及难降解性。在环境中长期存在会导致其具有极高的生物蓄积性，大量研究证实，全氟化合物在生物体内的蓄积水平高于己知的多氯联苯、有机氯农药等传统型持久性有机污染物数百倍至数千倍。并且，伴随着全氟化合物远距离的环境迁移行为，全氟化合物及其相关化学品广泛存在于大气、水体、生物体的血液及肝脏内，甚至在北极地区也检测到了该类物质的存在。根据经合组织（OECD）2002年编写的危害评估所得出的结论：认为全氟化合物在环境中的存在持久性，及其毒性和生物累积潜力是关系到环境和人类健康的重要问题。参见祝凌燕,林加华.全氟辛酸的污染状况及环境行为研究进展.应用生态学报,2008,19(5):1149-1157。
[0005] 三、PFOA的限制规定全氟有机化合物一直被广泛应用于工业生产及日常生活用品中，大量研究证实：全氟
有机化合物给环境带来了严重危害，并可在生物体内产生积累，对动植物体和人类健康产生了危害。
[0006] 2000至2003年间全球最大的全氟化学品生产商3M公司宣布削减并最终停产了一类含氟化学产品，2004年加拿大环境部和卫生部对全氟化合物的风险预警作出评估，一些
发达国家已经开始启动了一些相关措施和相关的法律法规限制使用全氟化合物。
[0007] 四、全氟化合物污染治理技术全氟化合物（PFCs）的降解技术主要包括焚烧降解、催化降解、等离子体等技术。现对
几种常见降解技术介绍如下：
4.1.1微波等离子体降解技术
HARTZ等利用微波等离子体技术降解全氟化合物，通过等离子体反应装置，在500至
2000瓦的微波发射功率下降解全氟乙烷，主要产物有二氧化碳、一氧化碳、氟气和氟化氢，并未发现四氟化碳的产生，去除率为99.6%。（CHRISLH,JOHNWB.InnovativesurfacewaveplasmareactortechniqueforPFCabatement.EnvironSciTechnol,1998,
32(5):682-687.）
RADOIU对影响四氟化碳降解的因素进行了研究，四氟化碳作为最稳定的有机化合物之一，在900℃时，不与铜、镍、钨、钼反应，仅在碳弧温度下缓慢分解。RADOIU利用微波等离子体技术，在微波发射功率为1900瓦时，研究发现四氟化碳的去除率为98%。（MARILENAT.R.Studiesof2.45GHzmicrowaveinducedplasmaabatementofCF4.EnvironSciTechnol,2003,37(17):3985-3988.）
XIE等研究发现：通过添加氧气或水可以提高反应器内羟基自由基和氧自由基的浓度，进而提高了四氟化碳的降解率。（HONGDUANX,BINGS,XIAOMEIZ.Abatementofperfuorocompoundswithmicrowaveplasmainatmosphericpressureenvironment.Jourmalofhazardousmaterials,2009(168):765-769.）
4.1.2水等离子体降解技术
KIM等研究了水等离子体降解技术的影响因素，发现增加电流及降低气流速率，可以提高全氟化合物（PFCs）的去除率。在输出功率为2.5千瓦和6毫升每分钟的水蒸气流速下，对四氟化碳的去除率达到99%。（DONGYK,DONGWHAP.DecompositionofPFCsbysteamplasmaatatmosphericpressure.Surface&CoatingsTechnology,
2008(202):5280-5283.）
WATANABE等利用水等离子体技术处理聚四氟乙烯，发现对聚四氟乙烯的去除率达到
99.9%，降解产物主要为二氧化碳、一氧化碳、氢气和氟化氢。（TAKAYUKIW,TAITRAT.WaterplasmagenerationunderatmosphericpressureforHFCdestruction.ThinSolidFilms,2008(516):4391-4396.）
4.1.3填充床等离子体技术填充床等离子体技术是采用介质阻挡放电的形式，将某种球形介质填充于2个放电电
极之间，利用填充介质来改变反应特性，从而达到对全氟化合物有较好的去除效果。目前，利用较为广泛的填充介质主要有铜、锌及铝等金属氧化物，而且常常采用几种金属氧化物的混合物作为填充介质。
[0008] YU等利用氧化铜、氧化锌和三氧化二铝作为填充介质，研究了电压、停留时间、氧浓度、放电频率等因素对四氟化碳降解的影响。（SHENGJY,MOOBC.OxidativeconversionofPFCviaplasmaprocessingwithdielectricbarrierdischarges.PlasmaChemistryandPlasmaProcessing,2001,21(3):
311-327.）
CHANG等通过改进填充介质而达到彻底清除四氟化碳和全氟乙烷的目的，反应产物主要为二氧化碳和极少的一氧化碳，从而有效地避免了二次污染。研究主要采用氧化铜/氧化锌/氧化镁/三氧化二铝（各种成分的比例分别为64%，24%，2%，10%）复合介质作为催化剂，对四氟化碳和全氟乙烷的去除率分别为66%，83%。（MOOBEENC,HOWMINGL.Abatementofperfluorocarbonswithcombinedplasmacatalysisinatmospheric-pressureenvironment.CatalysisToday,2004(89):109-115.）
SUZUKI等利用氢氧化钙和氧化钙作为填充介质，使得四氟化碳的降解率达到了
99.99%（，SUZUKIK,ISHIHAEAY,SAKODAK,etal.DevelopmentofahighefficiencyPFCabatementsystemutilizingplasmaandCa(OH)2/CaOunderadecompressionatmosphere.IEEEISSMPaper:ES-P-111,2007.）
OGATA等研究了单一填充介质二氧化钛对三氟甲烷、一氯二氟甲烷、一氯三氟甲烷和四氟化碳混合气体的去除效果，结果发现：二氧化钛不仅在高温光照下起催化作用，而且在常温的等离子体反应器内也具有催化能力。（ATSUSHIO,HYUNHK,SHiIHRRUF,etal.Effectsofcatalystsandadditivesonfouorocarbonremovalwithsurfacedischargeplasma.AppliedCatalysisB:Environmental,2004(3):175-180.）
4.1.4光催化降解技术
化学降解技术除高温燃烧和热解等常用技术之外，光催化降解也是一种重要的有机污染物的化学降解技术。其原理是指：有机污染物在光照下，通过催化剂实现降解。所以，光催化剂的活性是实现光催化降解的关键。通常，由于全氟有机物在紫外光区域内有吸收，所以一般采用紫外光源作为降解光源，而研究的重点在于催化剂的选择。
[0009]2003~2006年间，日本国家产业技术综合研究院的Hori等连续报道了采用光催化方法降解全氟羧酸(PFCAs)的报道，即采用200瓦氙汞灯作为光源(主要波段220至
460纳米)，以杂多酸(H3PW12O40)作为均相催化剂，在0.55兆帕的氧气压力下对全氟羧酸进行降解。（HoriH,TakanoY,KoikeK,etal.Decompositionofenvironmentallypersistenttrifluoroaceticacidtofluorideionsbyahomogeneousphotocatalystinwater.Environ.Sci.Technol.,2003,37(2):418~422.）
陈静等人对全氟辛酸、全氟庚酸、全氟己酸、全氟戊酸和全氟丁酸等五种全氟羧酸在
185纳米真空紫外光下的光降解行为进行了研究。结果发现：在185纳米紫外光照下，全氟羧酸发生了显著的降解，并生成氟离子。而在254纳米的紫外光照下降解不明显。液相/质谱分析表明，全氟辛酸光降解时会逐级生成短链的全氟庚酸、全氟己酸、全氟戊酸和全氟丁酸。在185纳米光照下，全氟羧酸首先发生脱羧反应，进而与水反应生成少1个碳原子的全氟羧酸和氟离子。（陈静,张彭义,等.全氟羧酸在185纳米真空紫外光下的降解研究.环境科学,2007,28(4):773-776.）
HORI等尝试用过硫酸盐作为添加剂，光降解PFOA。结果发现：过硫酸根在紫外光激发下产生两个激发态的硫酸根，其在水溶液中具有很强的氧化能力，从而对全氟有机物起降解作用，这表明起催化作用的是激发态的硫酸根，而不是过硫酸盐。（HORIH,YAMAMOTOA,HAYAKAWAE,etal.Efficientdecompositionofenvironmentallypersistentperfluorocarboxylicacidsbyuseofpersulfateasaphotochemicaloxidant.Environ.Sci.Technol.,2005,39(7):2383-2388.)
曲燕等人在第六届全国环境化学大会中，报道了《光致水合电子还原降解水中全氟辛酸（PFOA）的研究》。文中着重论述了一种采用碘化钾（KI）作为媒介光催化还原降解PFOA废水的新方法。（曲燕,张超杰,周琪.光致水合电子还原降解水中全氟辛酸（PFOA）的研究.第六届全国环境化学大会(水环境化学).）
曹梦华等人于2011年考察高碘酸盐对PFOA的光化学降解行为的影响。（曹梦华,王贝贝,朱湖地,等.高碘酸盐光化学降解水中PFOA研究.环境科学,2011,32(1):130-134.）
李振明等人在持久性有机污染物论坛2010暨第五届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集中报道了利用纳米氧化铟光催化降解全氟辛酸的研究，发现纳米氧化铟可以快速降解PFOA。（李振明,邵田,张彭义.纳米氧化铟光催化降解全氟辛酸的研究.持久性有机污染物论坛2010暨第五届持久性有机污染物全国学术研讨会,2010.）
4.1.5超声波降解技术
MORIWAKI等利用超声波对全氟有机物进行降解，其原理是：依靠超声波在液体中产生的气穴现象对全氟有机物进行降解。实验中由于氩气具有很高的多元系数，使反应体系具有更高的温度，因此在氩气的存在时会显著加快PFOA的降解过程。实验测得，在氩气气氛下超声降解PFOA的半衰期为22分钟。（MORIWAKIH,TAKAGIY,TANAKAM,etal.Sonochemicaldecompositionofperfluorooctanesulfonateandperfluorooctanoicacid.Environ.Sci.Technol.,2005,39(9):3388-3392.）
4.1.6微生物降解技术微生物降解技术通常具有高效、稳定性好、安全和无二次污染等特性，是治理含氟化合
物残留问题的有效途径之一。近十几年来，随着基因工程技术的发展，利用微生物降解含氟化合物的研究日益增多与深入。
[0010] 吴敏等人从长期受全氟有机物污染的污泥中驯化分离得到了数株优势降解菌，研究证明以全氟有机物为唯一碳源的两株优势菌种对多种全氟有机物都具有一定的浓度耐受能力。（吴敏,周钮明,薛静,等.含氟有机化合物优势降解菌的筛选.江苏环境科
技,2003,16(1):30-32.）邱吉国等人从污水处理池的活性污泥中分离了一株乙羧氟草醚的降解细菌，命名为
YF1。文中着重对影响菌株降解效果的环境因素进行了单变量考查。该菌株能以苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、邻氯苯酚、苯甲酸、龙胆酸和对硝基苯酚为底物生长，但不能利用3-苯氧基苯甲酸为唯一碳源生长。（邱吉国,郑金伟,张隽,等.乙羧氟草醚降解菌Pseudomonassp.YF1的分离、鉴定与降解特性.应用与环境生物学报,2009,15(5):686~691.）
吴敏等人从活性污泥中筛选获得两株能以含氟有机化合物为唯一碳源生长的降解菌Z1和Z3。生物忍耐力实验结果表明：当全氟辛酸浓度高达1000毫克每升时，Z1和Z3不能正常生长，见表2：（吴敏,周钰明,薛静,等.含氟有机化合物优势降解菌的筛选.江苏环境科技,2003,16(1):30-31.）
并且通过液-质色谱联用检测技术对Z1和Z3的降解特性进行考查，结果发现：全氟辛酸是通过与羧基相邻碳上的一个氟被氢取代而被降解菌株所利用的。
[0011]氟苯酚作为典型的单取代氟化合物，是一种重要的化工原料和有机中间体，主要应用于合成含氟农药、医药、染料和感光材料等精细化工品。在生产使用过程中，造成严重的生物累积，危害着人类健康。
[0012]张超杰等人通过气质联用仪器检测了微生物降解间氟苯酚的中间降解产物，初步确定3-氟邻苯二酚和4-氟邻苯二酚为中间降解产物，参见张超杰,周琪,陈玲,等.间氟苯酚的好氧生物降解性及降解途径研究.环境科学,2006,27(9):1841-1845.）气质联用仪器进一步检测表明：间氟苯酚羟基化的产物先邻位开环，再环化脱氟。
[0013]Goldman,TonomuraandKelly等人证实了假单胞杆菌属（pseudomonads）能够顺利降解氟乙酸盐为乙醇酸盐，并释放出氟负离子，参P.Goldman,J.Biol.Chem.
240(1965)3434–3438。
[0014]H.Kawasaki,N.Esaki等人通过分析X.autotrophicusGJ10菌株的Asp-105和His-272的核苷酸序列，提出了氟乙酸的催化降解机理。其中，Asp-105作为亲核试剂取代氟乙酸中的F-离子，形成酯中间体。然后，在His-272活化水分子作用下酯发生水解，重新释放出Asp-105酶。参见J.-Q.Liu,T.Kurihara,S.Ichiyama,M.Miyagi,S.Tsunasawa,H.Kawasaki,K.Soda,N.Esaki,.
J.Biol.Chem.273(1998)30897–30902。
[0015]Bertau在研究乙烯醇浓度如何影响面包酵母催化的对应选择性时，也发现了氟负离子的存在，参见O.Cabon,D.Buisson,M.Larcheveque,R.Azerad,Tetrahedron:Asymm.
6(1995)2199–2210。
[0016]Reineke等人研究Pseudomonassp.strainB13分泌的马来酰醋酸还原酶对含氟马来酰醋酸的微生物降解作用。发现降解过程中需要TwoequivalentsofNADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）还原型辅酶（可以提供氢负离子），参见S.R.Kaschabek,W.Reineke,J.Bacteriol.177(1995)320–325。
[0017] 氯氟氰菊酯是一种具有高效、广谱的含氟杀虫剂，对多种鳞目幼虫都有很好的效果，亦可有效地防治某些地下害虫。2010年，张建云等人发表了《1株氟氯氰菊酯降解菌GZ-3的分离和鉴定》的文章。笔者通过富集筛选的方法，从农药污染的土壤中筛选到1株氟氯氰菊酯降解菌GZ-3，通过16SrDNA序列测定，初步鉴定该菌为铜绿假单胞菌。将与其最相近的25个16SrDNA核糖核酸序列构建进化树，该文对氟氯氰菊酯降解的研究较为简单，对降解产物和可能的机理没有说明。而且铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌，将其作为工程菌应用于生物修复之前，必须对其生物安全性进行严格评价。
[0018]何志桥等人采用臭氧法降解含氟苯模拟废水，主要考察了反应液初始酸碱度、反应物初始浓度、臭氧投量、反应温度对臭氧氧化降解氟苯反应速率的影响，测定主要中间降解产物为苯酚、苯醌、呋喃二酮、亚联苯等。（何志桥,宋爽,杨岳平,等.臭氧法降解水中氟苯的动力学研究.高校化学工程学报.2007,21(2):298-303.)
通常，微生物降解酶比菌株本身具有更好的降解能力，且降解酶比较稳定，降解具有广谱性。林淦和姚威:运用超声波细胞粉碎法，提取了阴沟肠杆菌W-1中的粗酶液，通过农药降解特性实验和气质联用检测技术，充分证明该粗酶液对氟氯氰菊酯具有降解作用，参见林淦,姚威.阴沟肠杆菌w-1粗酶液对氯氟氰菊酯的降解效果及其作用机理.江苏农业科学,2006,3:191-192,198。
[0019] 在2009年，徐莲等人从农药厂的废水排放口附近的活性污泥中也分离到一株能以功夫菊酯为惟一碳源生长的细菌GF-3。应用渗透休克原理进行酶定域试验，结果表明：绝大多数降解酶属于胞外酶，参见徐莲,张丽萍,刘怡辰,等.功夫菊酯降解菌GF-3的筛
选鉴定及其降解特性研究.农业环境科学学报,2009,28(7):1545-1551。最重要的是，该研究通过质粒消除及电泳检测分析发现：功夫菊酯的降解与质粒无关，该降解基因不存在于质粒中。
[0020] 降解技术的比较微波等离子体、水等离子体和填充床等离子体技术都属于低温等离子体技术，对含氟
有机化合物降解的不足之处在于：副产物较多、能耗高、仪器设备要求高、费用大、易造成二次污染及影响降解的因素复杂等几方面。而光催化降解技术目前常用的光催化剂比较单一，大多数研究都集中在采用二氧化钛或其复合型作为光催化剂。所以，光催化降解技术的发展需要解决的问题是：（1）如何合成更多具有较高催化活性的光催化剂；（2）催化剂的分离回收与再利用技术；（3）设计低耗高能的光源和仪器设备等几方面。
[0021]微生物降解法与它们不同，其实质是：有机污染物在生物或其酶的作用下的一系列的酶促反应，主要通过细菌或其他微生物的酶系活动来分解有机物质。
[0022]其降解方式主要有以下三种：
（1）共代谢降解：是指一些难降解的有机物通过微生物的作用能改变其化学结构，但不能被微生物用作碳源和能源，而必须从其它底物中获取大部分或全部碳源和能源的代谢过程；
（2）生长代谢：是指微生物可将某些污染物作为其生长的碳源和能源物质加以分解和利用的代谢过程。其中，许多有毒物质都可以像天然有机化合物那样作为微生物的生长基质；
（3）矿化作用：是指在土壤微生物的作用下，土壤中有机态化合物转化为无机态化合物过程的总称。复杂的有机物质经过微生物酶的一系列作用，可以使其最终被分解二氧化碳和水等简单的无机（矿质）化合物，同时释放出能量。
[0023]余慧等人曾撰文又指出，要能转化含氟有机化合物，必须有能分解代谢碳-氟键
（C-F）的酶。酶作用于碳-氟键（C-F）并使其断裂，有以下四种情况：
（1）氧化脱卤：依靠单、双加氧酶作用于卤代有机底物上产生卤化氢，卤离子会自发的从不稳定的卤化氢中释放出来；（2）消除脱卤：在脱氢脱卤酶的催化脱卤作用下，脱卤形成双键；（3）取代脱卤：在卤代水解酶的催化作用下发生水解取代反应，达到脱卤的目的；（4）还原脱卤：在提供电子供体的条件下,从一个分子上去除卤代原子的同时添加一个电子到这个分子上。另外,某些厌氧细菌，可以利用特殊的卤代有机物作为呼吸过程的电子受体。
[0024] 在应用微生物降解技术处理污染物时，最终产物大都是无毒无害的、稳定的物质，如二氧化碳、水和氮气。这种治理污染物的方法可以有效避免污染物的多次转移，一般可以做到一步到位。因此，它是一种安全而彻底消除污染的好方法。
[0025]目前，微生物降解技术已成为环境保护中应用最广、最为重要的技术之一，在处理环境污染物方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和、以及无二次污染等特点。而且，随着现代生物技术的发展，尤其是基因工程、细胞工程和酶工程等生物技术的飞速发展和应用，使其具有更高的效率、更低的成本和更好的专一性，从而大大强化了微生物降解的处理过程。因此，在水和大气污染的治理、有毒有害物质的降解、废物资源化、环境监测和污染环境的修复等环境保护的各个方面，都发挥着极为重要的作用。
发明内容
[0026] 本发明的目的之一在于提供一种全氟化合物降解菌基因。该基因能够顺利实现碳-氟键（C-F）的切断，释放出了氟负离子。
[0027] 本发明的目的之二在于提供该基因的合成方法。
[0028]本发明的目的之三在于提供该基因降解全氟化合物的方法，即能够顺利实现这一类全氟化合物的微生物降解，同时实现碳-氟键（C-F）的有效切断，从而为全氟化合物的工业污染提供一种有效的解决途径；
为达到上述目的，本发明的基本原理为：自然界中本身并不存在能够顺利降解全氟化合物的菌株，本发明通过梯度增加全氟化
合物在富集培养基中的浓度作为环境限制因子，选取恰当的培养时间，给予土壤液中微生物菌群足够适应与竞争时间，最终通过驯化、基因诱变、基因组重组及基因组杂交等过程，诱导合成相应的全氟有机化合物降解酶，建立新的酶系统，筛选获得能够以全氟有机化合物作为碳源和能源生长，并能够顺利切断碳-氟键（C-F）的降解菌株；
首先，采用富集筛选的方法，并且梯度增加全氟化合物在富集培养基中的浓度，作为微生物菌群生长的环境限制因子，经过长期的诱变和驯化微生物，能够筛选获得在含有一定浓度全氟化合物的富集培养基中正常生长的微生物；
其次，鉴定微生物切断碳-氟键（C-F）的能力，从而才可以确定筛选获得的微生物是否对全氟有机化合物具有降解能力，鉴定手段主要采用离子色谱及核磁共振技术；
再对具有降解能力的微生物进行分离纯化，目的是获取一株具有高效降解能力的纯菌株。分离纯化采用的主要方法是：利用固体平皿稀释涂布和反复划线分离的方法，同时通过普通光学显微镜（革兰氏染色法）和透射电子显微镜（TEM）观察，获得能够顺利降解全氟化合物的纯菌株；
最后，对纯菌株进行分子生物学水平的鉴定，主要采用聚合酶链式扩增技术（PCR技术），然后将测到的序列与美国国立生物技术信息中心(TheNationalCenterforBiotechnologyInformation)中已知的细菌序列相比较，根据亲缘关系远近最终确定种属。一般来说，90％以上的同源性就可以确定到属，但确定到种的可能性很小。
[0029] 根据上述原理，本发明采用以下技术手段：一种全氟化合物降解菌基因，其特征在于该降解菌基因的序列为SEQIDNO：1所示的
碱基序列。
[0030] 一种合成上述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.培养质量分数为1%～50%的土壤溶液，充分静置后，取上清液作为初始菌种液；添加全氟有机化合物作为菌株生长的诱变因子，使其初始浓度为10毫克每升至1×105克每升，在37摄氏度和100至200转每分钟转速下培养至菌液浑浊；以10%转接量梯度增加全氟化合物的浓度，至全氟化合物的终浓度达到初始浓度的1至10倍左右倍，在同样条件下培养至菌液浑浊；
b.将步骤a所得菌液采用稀释涂布和反复划线分离方法，获得能够正常生长的微生物；
具体稀释步骤如下：
第一步：从步骤a所得的浑浊菌液取出50至100微升左右，加入到含有3至5毫升无菌水的10毫升规格的小试管内。然后，振荡小试管使菌液与无菌水混合均匀；
第二步：从第一步混合好的小试管内再取出50至100微升液体，加入到第二支含有3
至5毫升无菌水的10毫升规格的小试管内，振荡混合均匀；
第三步：再从第二步混合好的小试管内再取出50至100微升液体，加入到第三支含有
3至5毫升无菌水的10毫升规格的小试管内，振荡混合均匀；如此，重复上述操作，从上一次混合好的液体中取出50至100微升液体，加入到下一支
提前准备好的含有3至5毫升无菌水的10毫升规格的小试管内，振荡混合均匀；
重复操作10至15次；并按顺序分别对每一只试管进行编号1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或1到15；
第四步，从每个编号的小试管内分别吸取相同体积的液体（10至200微升范围内均可），分别加入到提前制作好的每个无菌固体培养皿中，然后，用无菌涂棒把液体在固体培养皿中涂抹均匀，并编好相应号码，放入37摄氏度的生化培养箱中培养至出现菌落。[0031] c.采用基因组试剂盒对步骤b所得微生物进行基因组DNA快速提取，即得到全氟化合物降解菌基因。
[0032]上述步骤c的具体方法为：将上述步骤b所得微生物配制成菌体密度（OD600）约为1.0左右浓度的菌液【备注：没有加菌的培养液作为测吸光度时的空白对照，培养约7至12小时的菌液作为被测试对象，采用721型紫外分光光度计在波长600纳米处，与空白对照培养基同时测定吸光度，空白对照培养液菌体密度（OD600值）调节为零，这时仪器上读出的数字即为菌体密度（OD600值）】。在10000rpm转速下离心分离30s；弃上清液，再加入Digestion消化液，并吹打均匀；再加入10mg/mL蛋白酶K，混均匀后在56℃水浴锅内消化
30~60min至完全透明；消化完全后，再加入RNase酶，室温消化5min；加入BDBuffer混均，在70℃温度下消化10min；加入无水乙醇混均；将所有液体移入回收柱（快速分离、基因组提取试剂盒获取基因DNA，这个试剂盒是厂家配制好的，基因组提取这步实验所用的试剂
【除乙醇外自己准备】和回收柱【即专用柱】都包含在内，产品名称是EZ-10SpinColumnBacterialGenomicDNAMiniPrepsKi），在转速为12000rpm的离心机内离心3min；舍弃上清液，加入PWSolution，在转速为10000rpm下离心1min，离心后弃上清液；在转速为
10000rpm下离心2min；将专用柱子移入离心管内，在吸附膜正中央加入经65℃~80℃下预热后的ElutionBuffer，在60℃水浴锅内水浴5min；水浴结束后，在转速为10000rpm下离心1min即得到基因组提取液。
[0033]一种降解全氟化合物的方法，采用上述的降解菌基因，其特征在于该方法的具体步骤为：
补充内容如下：
第一步，在250毫升【或500毫升】的锥形瓶内，配制50至100毫升的液体培养基【或
100至200毫升】，在121摄氏度的高压灭菌锅里高压灭菌20分钟；灭菌结束后，取出培养瓶放入温度为50摄氏度左右的烘箱内烘干；烘干后，再打开无菌操作工作台内的紫外灯，对培养瓶内培养基液进行30分钟的紫外灭菌；
第二步，采用根据权利要求1所述的降解菌，按体积百分比为【百分之五到百分之二十】取出权利要求1已经获得的菌液加入到第一步的液体培养基；
第三步，再在第二步的液体培养基中加入全氟有机化合物【初始浓度为100毫克每升至～1×105克每升】；
第四步，在35至38摄氏度，转速为100至200转每分钟的振荡培养箱中培养至菌液完全浑浊【培养时间肉眼观察浑浊或根据需要可以根据菌体密度OD600值大小判断，一般在
0.5至1.0较好】，完全浑浊后结束培养；
第五步，从培养液中取出10至50毫升，离心后取上清液体，然后，从上清液体里取7至
10毫升用作离子色谱测定分析液；第六步，剩下的培养液，根据全氟有机化合物的性质选择极性相似的有机溶剂进行萃
取，分别收集有机层和水层，再采用旋转蒸发仪对有机相和水相进行旋干；第七步，水相旋干瓶内加入氘代乙醇或重水进行H1NMR和19FNMR检测分析；第八步，有机旋干瓶内加入等体积的三氟乙酸乙酯标准溶液作为内标【浓度已知】和
DMSO-d，进行H1
NMR和
19FNMR检测分析；根据
19FNMR测试结果中氟信号强度比，计算出
全氟化合物大致的降解率。
[0034]采用本发明的降解菌基因对全氟化合物进行降解，其降解率可达到75%左右；本发明对利用微生物降解技术来实现全氟化合物工业污染的治理具有重要的理论指导及实际应用价值。
附图说明
[0035]图1为PFOA降解菌的菌落形态。
[0036]图2为PFOA降解菌的革兰氏染色，油镜观察放大倍数10×100。
[0037]图3为PFOA降解菌的电子透射电子显微镜（TEM）。
[0038]图4为PFOA降解菌的基因组DNA片段凝胶电泳检测结果。
[0039]图5为PFOA降解菌PCR扩增的凝胶电泳检测。
[0040]图6为PFOA降解菌系统发育树的构建。
[0041]图7为培养基pH值对菌株生长的影响。(4,0.492)、(5,0.512)、(6,0.513)、
(7,0.522)、(8,0.527)、(9,0.522)、(10,0.465)。
[0042] 图8为接菌体积数对菌株生长的影响。(2%,0.58) (5%,0.62) (10%,0.65)(15%,0.71) (20%,0.69)
图9为菌株对PFOA浓度的耐力实验。(100mg/L,0.57)、(200mg/L,0.98)、(500mg/L,1.01)、(1500mg/L,0.99)、(2000mg/L,0.83)、(5000mg/L,0.19)。
[0043]图10为通氧量对菌株生长的影响。(30mL/250mL,0.39)、(60mL/250mL,0.48)、(90mL/250mL,0.61)、(120mL/250mL,0.68)、(150m/250mL,0.61)、(180m/250mL,0.54)。[0044]图11为原料PFOA的F19NMR谱。
[0045] 图12为PFOA降解后的19FNMR谱。[0046] 图13为PFOA降解产物的离子色谱。[0047] 图14为用氟化钾配制氟标准色谱。
[0048]图15为PFOA降解产物离子色谱实验数据。
[0049]图16为LB培养基中PFOS降解产物的离子色谱。
[0050]图17为无机盐培养基（MSN）中PFOS降解产物的离子色谱。
[0051]图18为PFOS在两种培养基中降解的离子色谱的实验数据。
具体实施方式
[0052] 以下以PFOA为例，说明发明的具体实施方法一、降解菌的富集筛选
实施例一：配制质量分数为1%的土壤溶液，在37摄氏度和一定转速的振荡培养箱中培养一定时间。充分静置后，上清液作为初始接种菌液。首先，在100毫升筛选培养基中添加PFOA作为菌株生长诱变因子，使其初始浓度约为100毫克/每升，再添加10毫升土壤上清液于筛选培养基中，在37摄氏度、一定转速的恒温振荡培养箱中培养至菌液浑浊；其次，以
10%转接量、吸取10毫升新鲜菌液转接至另一瓶100毫升的新鲜筛选培养基中，此时，PFOA浓度增加至150毫克每升，在同样条件下振荡培养至菌液浑浊；每隔1天左右转接一次，梯度增加PFOA浓度至340毫克每升。然后，对最后一次新鲜菌液进行固体平皿稀释涂布，置于37摄氏度生化培养箱中培养，获得能够在含有PFOA浓度为340毫克每升的培养基中正常生长的微生物。
[0053]实施例二：本实施例与实施例基本相同，所不同的是将土壤溶液的浓度配制成质量分数为10%，PFOA的初始浓度为1000mg/L。
[0054]实施例三：本实施例与实施例基本相同，所不同的是将土壤溶液的浓度配制成质量分数为30%的土壤溶液，PFOA的初始浓度为10000mg/L。
[0055]实施例四：本实施例与实施例基本相同，所不同的是将土壤溶液的浓度配制成质量分数为50%，PFOA的初始浓度为100000mg/L。
[0056]对上述筛选获得的纯菌株的形状、大小和颜色等形态进行观察。具体操作是：首先，在37摄氏度和一定转速下的恒温振荡培养箱中，发酵培养3毫升新鲜菌液；其次，吸取
100微升新鲜发酵液用无菌水进行10-1至10-10梯度稀释；最后，从10-10稀释菌液内吸取100微升涂布于固体平皿中，在37摄氏度恒温生化培养箱中培养至出现菌落；然后，进行菌落形态的观察并记录结果。PFOA降解菌的菌落形态见图1，由图可知：该菌落呈黄色、圆形、边缘整齐、表面光滑而饱满、中间凸起且易挑取。
[0057] 对上述b筛选获得的纯菌株的光学显微镜观察（通常采用革兰氏染色法进行显微镜观察时样品的制备）的具体实施步骤如下：首先，取一定数量已擦干的载玻片，分别在火焰上烤一下用笔标记的涂菌部位以便除去油脂；第二、分别滴一滴无菌水在各个载玻片上，再从刚培养出菌落的固体培养基上分别挑取少量菌体涂在载玻片上，尽量使菌体涂布的薄而均匀；第三、晾干各个载玻片后，分别使各个载玻片通过火焰2或3次以便固定菌膜；第四、滴加草酸铵结晶紫液于各个载玻片上的涂菌部位进行染色，然后分别用水冲洗涂片；第五、分别滴加1滴碘液于各个载玻片上进行染色，再分别用水冲洗涂片；第六、对每个载玻片连续滴加乙醇（95%）进行脱色；最后、分别对每个载玻片滴加蕃红复染数分钟，再水洗至流出的水无颜色后在光学显微镜下用油镜进行观察（放大一定倍数）。PFOA的光学显微镜观察结果见图2。
[0058]对获得的筛选获得的纯菌株进行透射电子显微镜（TEM）表征。其具体实施步骤如下：首先，在固体培养基平皿中培养出要进行透射电子显微镜表征的降解菌落，培养时尽量保证出现单个菌落，且刚出现菌落时就结束培养；然后，在真空条件下，用电子散射能力强
的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成较强的反差，而没有喷镀的部分成为了样品的投影，根据投影可以观察细菌的鞭毛。PFOA降解菌的透射电子显微镜观察结果见图3，由图可知该降解菌不含鞭毛且呈椭圆形。
[0059] 二、降解菌株基因组DNA（脱氧核糖核酸）片段的提取；
在37摄氏度和一定转速下只需要发酵培养3毫升至5毫升新鲜菌液；其次，再采用基因组试剂盒(NamedEZ-10SpinColumnBacterialGenomicDNAMiniPrepsKit）快速提取方法对全氟有机化合物的降解菌进行基因组DNA（脱氧核糖核酸）快速提取。
[0060] 具体实施步骤如下：（1）吸取1.5mL新鲜菌液于1.5mL离心管内，在转速为
10000rpm的离心机内离心30s；(2)离心结束后去上清，再加入180μLDigestion消化液，这时需要把离心管地底部沉淀用移液枪吹打均匀；（3）再加入20μL10mg/mL蛋白酶K，混均匀后在56℃水浴锅内消化30~60min至完全透明；（4）消化完全后，再加入20μLRNase酶，室温消化5min；（5）加入20μLBDBuffer混均，在70℃水浴锅内消化10min；（6）加入20μL无水乙醇混均，这时所有液体移入专用柱内，在转速为12000rpm的离心机内离心3min；（7）舍弃管内液体，加入50μLPWSolution，在转速为10000rpm下离心1min，离心后弃下液；重复此步骤一次；（8）专用柱子在转速为10000rpm下离心2min；（9）柱子移入干净的1.5mL离心管内，在吸附膜正中央加入50μLElutionBuffer(被加入前需在65℃~80℃下预热)，在60℃水浴锅内水浴5min；（10）水浴结束后，在转速为10000rpm下离心1min即得到50μL基因组提取液；最后，通过琼脂凝胶电泳检测技术对提取的基因组DNA片段进行提取效果的分析。PFOA降解菌的基因组DNA片段凝胶电泳检测结果见图4。
[0061] 三、降解菌基因组DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）；聚合酶链式反应的反应体系(1×50微升)设置如下：10×PCR缓冲液(1×5)微
升、上下游引物各(1×1)微升、TaqDNA聚合酶(1×0.25)微升、dNTP混合液(1×4)微升、无菌去离子水(1×37.75)微升，基因组DNA1微升。PFOA降解菌基因组DAN片段的聚合酶链式反应结果的凝胶电泳检测结果见图5，其中，上下游引物设计如下：(5-ACACATGCAAGTCGAGCGGT-3′)和(5-TCATGAATCACAAAGTGGTAAGCG-3′)。
[0062]PFOA降解菌的聚合酶链式反应扩增后产物经切胶回收、纯化后，连同设计的特定引物(5-ACACATGCAAGTCGAGCGGT-3′)和(5-TCATGAATCACAAAGTGGTAAGCG-3′)送到上海生物科技公司进行核糖核酸序列测定。利用DNAstar软件对上下游引物分别测序的结果进行分析，最终得到长度为1433kb（是1433kb）的序列。
[0063] 四、降解菌系统发育树的构建
根据PFOA降解菌的核糖核酸序列测序结果，进入美国国家生物技术信息中心(NationalCenterForBiotechnologyInformation)，通过与已知细菌进行核糖核酸序列比对(Blast)，把与其同源性最接近的25个已知序列用以构建系统发育树，表示种属间的亲近关系，结果见图6：
五、降解菌的碳源、氮源利用和生理生化特性的鉴定
对PFOA降解菌进行生理生化特性的鉴定，主要包括PFOA降解菌对碳源、氮源利用率、产酶特性及代谢产物等几方面，具体鉴定指标的选择需要根据PFOA降解菌的16SrDNA核糖核酸序列测定分析结果，再参考《伯杰氏系统细菌学手册》（第八版）进行选择。PFOA降解菌的生理生化特性鉴定结果见下表1：
表1PFOA降解菌的生理生化特性鉴定
实验名称
实验结果

硝酸盐还原
阳性

过氧化氢接触酶
阳性

甲基红
阳性

乙酰甲基甲醇
阳性

尿素分解
阳性

柠檬酸盐利用
阳性

苯丙氨酸脱氨酶
阴性

六、降解菌生长条件的单因素变量；
为了提高降解菌对PFOA的降解效果，对PFOA降解菌的外界环境因素进行单因素变量考查。主要包括以下四方面：培养基pH值（4至10），见图7；接种量体积百分数(2%至
20%)，见图8；PFOA浓度（100毫克每升至5000毫克每升），见图9；通氧量体积百分数(12%至72%)，见图10；所有单因素变量考查实验均在37摄氏度和一定转速下的恒温振荡培养箱中培养一定时间。结束培养后，用721型分光光度计在600nm处测量培养液的菌体密度大小（OD600值）。
[0064]具体过程如下：第一步，根据附图9中的最适通氧量，在250毫升的锥形瓶内配制
120毫升的LB液体培养基，并且培养基pH值按附图7调节为最适值8.0，在121摄氏度的高压灭菌锅里高压灭菌20分钟；灭菌结束后，在温度适宜的烘箱内烘干；烘干后，对培养瓶内培养液进行紫外灭菌30分钟；
第二步，按附图10中最佳接菌体积分数为15%，取出权利要求1已经获得的菌液加入到第一步的液体培养基；
第三步，再在第二步的液体培养基中加入全氟有机化合物，其初始浓度为附图8中的最适浓度，即500毫克每升；
第四步，在37摄氏度，转速为180转每分钟的振荡培养箱中培养24小时；实验结束培养后，从中取出10至50毫升，离心后取上清液体，然后，从上清液体里取7
至10毫升用作离子色谱测定分析液，用氟化钾配制氟标准色谱见附图14；剩下的培养液，根据全氟有机化合物的性质选择极性相似的有机溶剂进行萃取，分别收集有机层，再采用
19
旋转蒸发仪对有机相进行旋干；再往瓶内加入等体积的三氟乙酸乙酯和DMSO-d6，进行 F
NMR检测分析，见附图12、图13；
在37摄氏度、180转每分钟的转速下，根据单因素变量实验结果，采用最适宜的条件进行PFOA的降解实验，即PFOA最适浓度为500mg/L，培养基最适pH值为8.0，最适接菌量为
15%时，PFOA的降解效果较好，降解率大约为75%。分析离子色谱的检测结果，即在降解液里检测到了F-离子的存在，得出结论碳-氟键发生了断裂。
[0065] 计算PFOA的降解率：在37摄氏度、一定转速下的恒温振荡箱中培养含PFOA浓度为500毫克每升的120毫升LB液体培养基，培养时间为一天。结束培养后，以体积比1:2分别用EA和乙醚萃取培养液，实际操作是用100毫升（乙酸乙酯或乙醚）分别萃取50毫升的培养液。然后，回收有机相，在旋转蒸发仪上蒸干有机相；再采用内标法进行定量分析，标准内标配置如下：用25毫升容量瓶配置1x10-5摩尔每升三氟乙酸乙酯标准溶液；1毫升DMSO溶剂和制备的三氟乙酸乙酯标准液以体积比1:1加到核磁管内，即加入量都为300微
升；然后，进行19FNMR谱检测，根据谱图中三氟乙酸乙酯的信号高度和PFOA中-CF
的高度
比定量计算降解后PFOA的剩余量，从而计算出降解产率约为75%。见图11和图12：七、降解产物的测定：在恒温振荡培养箱中培养PFOA浓度为500毫克每升的降解培养
液120毫升，然后接种纯菌株，按15%体积分数接菌于培养基中。结束培养后，离心全部菌液，取上清液，进行氟负离子检测。检测条件如下：离子色谱IC1100(戴安公司)，阴离子交换柱，流动相是碳酸钠(4.5毫摩尔每升)和碳酸氢钠(1.4毫摩尔每升)，流速为1.2毫升每分钟，注射体积为10微升。降解菌对PFOA降解后产物离子色谱见图13：与标准氟负离子标准图谱进行对比得出，在降解产物中检测到浓度为3.23403毫克每升的氟负离子，浓度为7.130267毫克每升的甲酸根负离子以及浓度为1.164432毫克每升的草酸根负离子，见附图15。这三种离子的确认对理解降解菌对PFOA的降解机理具有重要的意义。
[0066] 对全氟辛基磺酰胺（PFOS）的降解实验过程如下：补充内容如下：
第一步，在250毫升的锥形瓶内，分别配制100毫升的液体无机盐培养基（MSN）和LB培养基，在121摄氏度的高压灭菌锅里高压灭菌20分钟；灭菌结束后，取出培养瓶在烘箱内烘干；烘干后，对培养瓶进行30分钟的紫外灭菌；
第二步，按体积百分比为百分之十，取出权利要求1已经获得的菌液加入到两个液体培养瓶内；
第三步，再在第二步的液体培养基中加入全氟辛基磺酰胺（PFOS），初始浓度为1290毫克每升；
第四步，在37摄氏度，转速为180转每分钟的振荡培养箱中培养30小时。结束培养后，分别从LB培养液和无机盐培养液（MSN）中取出10至50毫升，离心后取上清液体，然
后，从上清液里分别取7毫升用作离子色谱测定分析液；结果分别见附图16、图17；氟负离子的具体浓度及信号强度见附图18。
序列表
<110> 上海大学
<120> 全氟化合物降解菌基因、及其合成方法及应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1436
<212> DNA
<213> 基因序列
<400> 1
TCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAA 60
CCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCA 120
TTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCC 180
GGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATAT 240
GCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCC 300
ACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAAC 360
AAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGAC 420
GACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGT 479
TCTGTGGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTC 539
CACCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCC 599
CAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAA 659
TCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT 719
CGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGAT 779
CTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTG 838
CCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGAC 897
CGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCG 957
CGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGACGAGGTT 1017
ATTAACCTTAACGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCAC 1077
ACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTC 1137
CCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCT 1197
AGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACAT 1257
CTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGC 1317
TACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTC 1377
CGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGACTTGCATGTATA 1433