发酵法生产脂肪酶的方法 【技术领域】
本发明涉及一种发酵生产脂肪酶的方法，更确切地说是涉及一种采用酵母菌作为菌种的发酵生产脂肪酶的方法。
背景技术
酶是一种作用范围广、反应条件温和、催化效率高、立体选择性及底物专一性强的生物催化剂，在医药工业、农业、环保、精细化工及食品工业等方面均有着较为广泛的应用。而在应用于工业生产的酶中，无论从市场价值还是从应用的范围来说，脂肪酶都是最为重要的酶之一。
脂肪酶除可以催化酯化反应外，还可以催化多种反应。脂肪酶(三酰基甘油酯水解酶)广泛存在于高等动物、微生物和植物中，现在用来生产工业脂肪酶酶制剂的微生物主要有假单胞杆菌(Pseudomonas)、毛霉菌(Mucor)、地霉菌(Geotrochum)、根霉(Rhizopus)、念珠菌(Candida)等，其中皱褶假丝酵母(Candida rugosa)就是广泛应用于工业生产的脂肪酶产生菌之一。
尽管皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶的生化、结构和催化特性已经有文献报道，但是关于控制脂肪酶合成和分泌因素及条件的报道较少。另外遗传研究证实在皱褶假丝酵母中有七种基因编码不同的脂肪酶，Lotti等研究表明，编码各种同功酶基因的表达可能存在不同的控制机制，所以培养基的组成就影响着所产生的脂肪酶中同功酶种类及比例。Gordillo等通过实验表明在发酵过程中采用不同的操作条件也影响所产生的同功酶种类及比例。所以在用发酵法生产皱褶假丝酵母脂肪酶过程中，为了保证发酵结果具有确定性和可重复性，选择合适的培养条件特别是培养基组成是非常重要的。
现有技术中，利用微生物生产酶制剂所采用的培养基中主要成分为碳源和氮源。由于氮元素是构成微生物细胞蛋白质的重要成分，亦是构成细胞内核酸的重要成分，同时也是细胞合成蛋白质、酶和氨基酸等重要代谢物的成分，因此，在酶制剂工业中，氮源是不可缺少的重要原料。
当前酶制剂工业生产中常用地氮源可分为无机氮源和有机氮源。前者有硫酸铵、硝酸铵和尿素，而常用的有机氮源大多为酵母膏和胨类。从文献报道来看，应用于皱褶假丝酵母脂肪酶生产的氮源主要是无机氮源如硫酸铵和尿素，而尚未有采用油料饼粕特别是黄豆饼粉作为氮源的报道。在国内，宋庆训等以尿素作为唯一氮源进行发酵实验，发酵水平为19.5U/ml；吴国平等采用有机氮源鱼胨和酵母膏进行发酵实验，每毫升发酵液酶活力为4.2U。在国外，Laksmi等和Obradors等用尿素作为氮源进行发酵生产脂肪酶，发酵水平分别为4.43U/ml和8.0U/ml。Rao等同样以尿素作为唯一氮源进行固态发酵实验，发酵水平为24.4U/克米糠。但是Montesinos等在用油酸和尿素进行连续发酵生产中发现尿素与油酸之间在培养基中存在乳化现象。由于酵母细胞无法正常的吸收氮源，导致细胞合成蛋白质的能力降低，同时脂肪酶的生产也受到抑制，所以在发酵生产中尿素逐渐被硫酸铵所取代。Gordillo等和Dalmau等均以硫酸铵作为唯一氮源进行发酵实验，发酵水平分别为12.1U/ml和5.3U/ml。最近，等利用有机氮源酵母膏结合蛋白胨进行发酵实验，发酵水平达5.58U/ml。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种发酵生产脂肪酶的方法，
本发明是这样实现的。本发明的发酵生产脂肪酶的方法主要包括以皱褶假丝酵母为菌种，经过斜面培养和发酵培养，培养后的发酵液离心后取得离心液即包含所需的脂肪酶，所述的在发酵培养时，以油料饼粕作为培养基唯一氮源。
本发明方法所述的发酵培养基是：
油酸 1～3g/L，
磷酸二氢钾 2～7g/L，
硫酸镁MgSO4·7H2O 0.1～1.2g/L，
氯化铁FeCl3·6H2O 5～15mg/L，
肌醇 2～6mg/L，
生物素 0.005～0.012mg/L，
维生素 0.1～0.4mg/L，
油料饼粕 16～90g/L。
所述的油料饼粕是以花生、大豆、油菜籽、棉籽、葵花籽、芝麻以及红花为原料的油料饼粕，较佳的油料饼粕是以大豆、芝麻为原料的油料饼粕。发酵培养时的培养条件是在28～32℃下培养48～50小时，培养时摇床转速可以控制在180～240转/分钟。
本发明方法所述的斜面培养基是：蛋白胨0.2～0.5g，琼脂1.5～4g，然后加入麦芽浸出液至100mL。斜面培养条件是在28～30℃下培养24～26小时。
本发明的发酵生产脂肪酶的方法针对现有培养基的发酵水平不高的情况，以油料饼粕作为氮源，如黄豆饼粉。黄豆饼粉含有粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和灰分等微生物生长所必需的营养成分。当以黄豆饼粉作为发酵培养基唯一氮源与硫酸铵、硝酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和玉米蛋白等氮源相比，皱褶假丝酵母发酵水平有了大幅度的提高，最高可达94U/mL，远远高于国内外文献所报道的皱褶假丝酵母发酵水平，同时，还进一步降低了皱褶假丝酵母发酵生产脂肪酶的成本。
【具体实施方式】
下面将针对对本发明方法的具体实施例的详细描述来进一步说明本发明，但实施例不是对本发明的限制。
实施例1：
①菌种：皱褶假丝酵母(Candida rugosa)。
②斜面培养基：蛋白胨0.3g，琼脂2.5g，加麦芽浸出液至100mL。
③发酵培养基：油酸2.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g/L，氯化铁(FeCl3·6H2O)10mg/L，肌醇4mg/L，生物素0.008mg/L，维生素B1 0.2mg/L，大豆饼粉16g/L。
④接种与培养条件：首先取皱褶假丝酵母(Candida rugosa)菌种在斜面上划线，28℃培养24小时；然后挑取菌体两环接种到50mL发酵培养基(种子培养基)，30℃培养12小时，摇床转速为220转/分钟；取1mL种子培养基接种到50mL发酵培养基，30℃培养48小时，摇床转速为220转/分钟。培养结束后，发酵液离心取得离心液即包含所需的脂肪酶。
测定脂肪酶酶活力：发酵液在4℃、3000倍的重力加速度下离心15分钟后测定脂肪酶酶活力，测得脂肪酶酶活力是33.33U/mL。
实施例2：
①菌种：皱褶假丝酵母(Candida rugosa)。
②斜面培养基：蛋白胨0.2g，琼脂1.5g，加麦芽浸出液至100mL。
③发酵培养基：油酸1.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1g/L，氯化铁(FeCl3·6H2O)5mg/L，肌醇2mg/L，生物素0.005mg/L，维生素B1 0.1mg/L，花生饼粕75g/L。
④接种与培养条件：首先取皱褶假丝酵母(Candida rugosa)菌种在斜面上划线，28℃培养24小时；然后挑取菌体两环接种到50mL发酵培养基(种子培养基)，30℃培养12小时，摇床转速为220转/分钟；取1mL种子培养基接种到50mL发酵培养基，28℃培养48小时，摇床转速为220转/分钟。培养结束后，发酵液离心取得离心液即包含所需的脂肪酶，测得脂肪酶酶活力是73U/mL。
实施例3：
①菌种：皱褶假丝酵母(Candida rugosa)。
②斜面培养基：蛋白胨0.5g，琼脂4.0g，加麦芽浸出液至100mL。
③发酵培养基：油酸3.0g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.2g/L，氯化铁(FeCl3·6H2O)15mg/L，肌醇6mg/L，生物素0.012mg/L，维生素B1 0.4mg/L，大豆饼粉90g/L。
④接种与培养条件：首先取皱褶假丝酵母(Candida rugosa)菌种在斜面上划线，28℃培养24小时；然后挑取菌体两环接种到50mL发酵培养基(种子培养基)，30℃培养12小时，摇床转速为220转/分钟；取1mL种子培养基接种到50mL发酵培养基，28℃培养48小时，摇床转速为220转/分钟。培养结束后，发酵液离心取得离心液即包含所需的脂肪酶，测得脂肪酶酶活力是94U/mL。
实施例4：
除油料饼粕是以芝麻为原料的油料饼粕，发酵培养基内加入量为40g/L外，其余同实施例1，分析离心液，其脂肪酶酶活力是35U/mL。