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1、10申请公布号CN104160996A43申请公布日20141126CN104160996A21申请号201410427139422申请日20140827A01K61/0020060171申请人青岛海弘达生物科技有限公司地址266101山东省青岛市崂山区株洲路153号1号楼西翼170272发明人王春德孙奎府马斌74专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人张中南54发明名称紫墨杂交扇贝保持系的构建方法与应用57摘要本发明涉及一种紫墨杂交扇贝保持系的构建方法及应用。该保持系是能使相应的紫墨杂交扇贝的雄性不育系后代仍具有雄性不育且卵子可育特性的墨西哥湾扇贝品系，其中紫墨杂交扇贝是紫。
2、扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代。其构建方法是首先构建大量的紫墨杂交扇贝子一代家系，从中找到雄性不育的个体用于雄性不育系的选育；然后用父本墨西哥湾扇贝的精子连续回交，分别选育后代全部为雄性不育个体的雄性不育系保持系组合；最后用雄性不育系与保持系杂交生产雄性不育系亲贝，后者用于生产紫墨杂交扇贝商品苗种。本发明首次在动物中建立了扇贝的保持系，有效克服了雌雄同体扇贝杂交中自体受精的障碍。51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104160996ACN104160996A1/1页21一种紫墨杂交扇贝的保持系，其。
3、特征在于，该保持系是能使相应的紫墨杂交扇贝的雄性不育系后代仍具有雄性不育且卵子可育特性的墨西哥湾扇贝品系，其中紫墨杂交扇贝是紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代。2权利要求1的紫墨杂交扇贝保持系的构建方法，其特征在于1紫墨杂交扇贝雄性不育个体的筛选及其父本的繁育首先构建20个以上紫墨杂交扇贝子一代家系用于筛选雄性不育个体，同时建立供精的父本墨西哥湾扇贝自交家系，用于下述保持系的选育；2紫墨杂交扇贝保持系的选育第二年从上述紫墨杂交扇贝子一代家系中选择50个雄性不育个体，促熟后刺激其排卵，用该雄性不育个体的父本墨西哥湾扇贝自交家系中优良个体的精子受精，收集正常发育的受精卵建立回交家系20个以上，。
4、同时将供精的父本墨西哥湾扇贝自体受精建立自交家系；翌年选择回交家系中仍为雄性不育的个体50个促熟并刺激产卵后，用该雄性不育个体的父本墨西哥湾扇贝自交后代的精子继续回交，建立20个以上回交家系，同时仍将供精的父本墨西哥湾扇贝继续自交建立自交家系；以后每年按照同样的方法连续回交选育，直到回交后代全部为雄性不育且卵子可育的个体，即获得紫墨杂交扇贝雄性不育系；再将上述能使雄性不育系后代继续保持雄性不育特性的墨西哥湾扇贝自交家系用常规的扇贝育苗方法自交扩繁，即获得该紫墨杂交扇贝雄性不育系的保持系。3上述权利要求1和权利要求2的紫墨杂交扇贝保持系应用于规模化生产紫墨杂交扇贝雄性不育系种贝，即用紫墨杂交扇贝。
5、保持系与相应的雄性不育系杂交，以规模化繁育雄性不育且卵子可育的下一代紫墨杂交扇贝雄性不育系种贝。4权利要求2建立的紫墨杂交扇贝保持系的构建方法也应用于以下的各杂交扇贝的育种1用墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的墨紫杂交扇贝；2用紫扇贝卵子与海湾扇贝精子受精培育的紫海杂交扇贝；3用海湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的海紫杂交扇贝。5权利要求3建立的紫墨杂交扇贝保持系的应用方法也应用于以下的各杂交扇贝的育种1用墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的墨紫杂交扇贝；2用紫扇贝卵子与海湾扇贝精子受精培育的紫海杂交扇贝；3用海湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精培育的海紫杂交扇贝。6权利要求2建立的紫墨杂交扇贝保。
6、持系的构建方法也应用于其他雌雄同体型扇贝，例如ARGOPECTEN属和PECTEN属扇贝的种间杂交育种。7权利要求3建立的紫墨杂交扇贝保持系应用方法也应用于其他雌雄同体型扇贝，例如ARGOPECTEN属和PECTEN属扇贝的种间杂交育种。8权利要求2建立的紫墨杂交扇贝保持系的基本构建方法也应用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。9权利要求3建立的紫墨杂交扇贝保持系的应用方法也应用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。权利要求书CN104160996A1/5页3紫墨杂交扇贝保持系的构建方法与应用技术领域0001本发明属于贝类育种技术杂交扇贝商品苗种培育方法，尤其是涉及紫墨杂交扇贝紫扇贝。
7、卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代保持系的构建及应用。背景技术0002墨西哥湾扇贝ARGOPECTENIRRADIANSCONCENTRICUS原产于美国墨西哥湾沿岸，于上个世纪九十年代引入我国。墨西哥湾扇贝生长速度快，温度适应范围广，尤其是比较适合高温海区，抗逆性强，非常适合我国南方海域的养殖，目前是南方海域的主要扇贝养殖品种之一。但是由于引进后长期近交，墨西哥湾扇贝在养殖过程中种质退化严重，表现为商品贝规格越来越小，育苗养殖过程中死亡率较高，因此扇贝养殖业迫切需要对墨西哥湾扇贝进行遗传改良，其中杂交育种是最有效的种质改良方法之一。0003为此，发明人自2007年首次从秘鲁引进了紫扇贝ARGO。
8、PECTENPURPURATUS。紫扇贝是原产于南太平洋的一种速生型中型扇贝，与墨西哥湾扇贝都属于ARGOPECTEN属，染色体数相同，且都是雌雄同体，但二者在个体大小、生长和温度适应性等方面性状互补。因此发明人又通过将紫扇贝与墨西哥湾扇贝进行种间杂交，培养出正交紫扇贝卵子和墨西哥湾扇贝精子受精和反交墨西哥湾扇贝卵子和紫扇贝精子受精两种杂交子一代。杂交子一代的个体重比同期培育的墨西哥湾扇贝提高7285，显示出巨大的产业潜力南乐红等，2012紫扇贝和墨西哥湾扇贝种间杂交的初步研究。中国农学通报，28131135。0004上述杂交子一代虽然可以产生较大的杂种优势，但是要大面积推广仍存在着较大的困难。
9、，这是因为墨西哥湾扇贝和紫扇贝都是雌雄同体的扇贝，繁殖时同时排放精子和卵子，排放的卵子容易受到同种精子的污染，难以大量获得未受精卵用于种间杂交，从而导致所获得的商品苗种中真正的杂交后代比例大大降低，因而使其产量的提高幅度大大受限。0005研究发现，上述两种ARGOPECTEN扇贝的雌雄同体特性与许多农作物的雌雄同株特性相似。在雌雄同株的农作物育种中也存在着同花授粉的问题，需要人工去雄，这一点与紫扇贝与墨西哥湾扇贝杂交过程中遇到的自体受精问题相似。农业上解决这个问题的关键依赖于雄性不育植株的发现，利用雄性不育株与其父本连续回交，就可以选育出雄性不育系、保持系和恢复系，以此来构建农作物育种中的三系。
10、配套育种体系，实现杂交种的大规模生产，从而解决杂交制种难题。迄今为止，国内外已经在众多的农作物中建立了三系配套育种体系，并广泛应用于杂交种的生产中，成为大幅度提高农作物产量的主要途径。0006但是在动物育种中，国内外迄今为止尚无发现雄性不育且雌性可育个体的报道，因而也无法建立类似于农作物的雄性不育系、保持系和恢复系，用于杂交育种。显然，如果在动物育种中能够构建起类似的包括雄性不育系、保持系和恢复系的三系配套育种体系，也就可以实现雌雄同体型动物的低成本、规模化种间杂交，提高杂交效率，提高育种动物的抗逆性和产量，从而实现动物育种技术的重大突破。发明内容说明书CN104160996A2/5页4000。
11、7本发明的目的是实现在动物育种中，具体地说是在雌雄同体型扇贝中首次构建紫墨杂交扇贝保持系，以克服现有杂交扇贝育种技术的不足。0008本发明的另一目的是利用上述保持系与雄性不育系杂交，建立规模化生产紫墨杂交扇贝雄性不育系种贝的应用方法。0009上述的雄性不育系是雄性性腺发育不正常，不能产生有功能的精子，但其卵子发育正常，能接受正常精子而受精，并能将其雄性不育特性遗传给后代的品系。显然雄性不育系是三系配套体系中的核心品系，其主要作用是在杂交苗种商业化生产中提供大量的未受精卵子，同时其繁育依赖于相应的保持系。雄性不育系是利用偶然发现的雄性不育且卵子可育的个体与其父本连续回交建立回交家系，当回交家系的。
12、所有个体均为雄性不育且卵子可育时所获得的杂交扇贝品系。0010保持系又称雄性不育系保持系，当作为父本与雄性不育系杂交时，能使子一代保持雄性不育特性，保持系的主要作用是提供雄性不育系繁育所必须的精子。保持系是能够正常繁育的雌雄同体品系，可以通过自交繁育下一代保持系。0011本发明基于以下构思和实践1发明人研究发现了紫墨杂交扇贝紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代子一代中存在58的雄性不育个体，这些个体不产生有活性的精子，但其卵子可以被墨西哥湾扇贝的精子受精，且所获得的受精卵能够正常发育，即获得了回交扇贝；2研究进一步发现，由此获得的回交扇贝性腺成熟后约有8的个体仍为雄性不育且其卵子可被墨西哥湾。
13、扇贝精子受精，因此只要将上述雄性不育个体的卵子与父本墨西哥湾扇贝自交后代的精子连续多代回交，就能选育出后代全部为雄性不育且卵子可育的雄性不育系母本墨西哥湾扇贝父本组合，该组合中的墨西哥湾扇贝品系具有使相应的雄性不育系的后代仍保持雄性不育特性的能力，即获得紫墨杂交扇贝的雄性不育系和该雄性不育系的保持系；3应用紫墨杂交扇贝保持系与其相应的雄性不育系种贝杂交可以大规模生产雄性不育且卵子可育的种贝。0012本发明的紫墨杂交扇贝保持系的构建方法如下00131紫墨杂交扇贝雄性不育个体的筛选及其父本的繁育选择优良的紫扇贝与墨西哥湾扇贝个体同步促熟后，用常规的墨西哥湾扇贝阴干和温度刺激方法诱导紫扇贝和墨西哥湾。
14、扇贝产卵，并分别收集紫扇贝和墨西哥湾扇贝的卵子，同时诱导墨西哥湾扇贝排精，并用500目筛绢过滤获得墨西哥湾扇贝精子，然后向紫扇贝的卵子中加入适量的墨西哥湾扇贝精子，受精卵正常发育后即获得紫墨杂交扇贝紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子受精子一代家系，待用于选择雄性不育个体，同时将墨西哥湾扇贝的卵子用自体的精子受精，建立该墨西哥湾扇贝的自交家系。由于杂交子一代中雄性不育个体存在的比例很低，因此需要构建大量的杂交子一代家系，从而找到雄性不育的个体用于保持系的选育。00142紫墨杂交扇贝保持系的选育选择上述紫墨杂交扇贝子一代家系中的雄性不育个体，与父本墨西哥湾扇贝自交家系中的优良个体同步促熟，性腺成熟后用常。
15、规的墨西哥湾扇贝阴干和温度刺激的方法诱导上述杂交子一代扇贝排卵并收集卵子，同时诱导墨西哥湾扇贝排精，并用500目筛绢过滤获得墨西哥湾扇贝精子，将上述获得的杂交子一代的卵子与墨西哥湾扇贝精子受精，收集受精且发育正常的受精卵建立回交家系，同时将供精的墨西哥湾扇贝自体受精建立自交家系；翌年将回交家系及其父本墨西哥湾扇贝自交家系促熟，选择回交家系中仍为雄性不育的个体用常规的墨西哥湾扇贝产卵诱导方法刺激产卵说明书CN104160996A3/5页5后，用其父本墨西哥湾扇贝自交后代的精子继续回交，同时仍将供精的墨西哥湾扇贝继续自交建立自交家系；以后每年按照同样的方法连续回交选育，直到回交后代全部为雄性不育且。
16、卵子可育的个体，该回交家系即成为紫墨杂交扇贝雄性不育系，将上述能使雄性不育系后代继续保持雄性不育特性的墨西哥湾扇贝自交家系用常规的墨西哥湾扇贝育苗方法自交扩繁，即获得该雄性不育系的保持系。保持系的主要作用是提供雄性不育系繁育所必须的精子，它是雄性不育系传代所必需的父本品系。00153紫墨杂交扇贝保持系的应用将紫墨杂交扇贝保持系与相应的雄性不育系种贝杂交，即可规模化繁育雄性不育且卵子可育的紫墨杂交扇贝雄性不育扇贝，并用于紫墨杂交扇贝商品苗种生产。0016本发明的保持系构建方法也应用于墨紫杂交扇贝墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代、紫海杂交扇贝紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代和海紫杂交扇贝海。
17、湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代等ARGOPECTEN属杂交扇贝的育种实践，并且应用于建立这些杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。0017本发明的方法也应用于其他雌雄同体型扇贝的种间杂交育种，例如PECTEN属扇贝的种间杂交，本发明的基本方法也适用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。0018本发明构建的紫墨杂交扇贝保持系是首次在动物界中建立的保持系，应属于动物育种技术的重大突破。本发明有效克服了雌雄同体扇贝杂交过程中自体受精的障碍，使低成本、规模化生产完全的杂交后代成为可能。具体实施方式0019本发明构建了紫墨杂交扇贝的保持系，并建立了用保持系规模化生产紫墨杂交扇贝雄性不育系种贝的方法，具。
18、体步骤如下0020实施例100211紫墨杂交扇贝雄性不育个体的筛选及其父本的繁育第一年选择50个性腺发育成熟的紫扇贝和50个墨西哥湾扇贝，阴干刺激30分钟后将每个扇贝放在预先加入23海水的单独的容器中使其产卵、排精，单独收集每个紫扇贝的卵子和每个墨西哥湾扇贝的精子和卵子，向每个紫扇贝的卵子悬浮液中加入少量来自单个墨西哥湾扇贝的精液，搅拌使精卵混合均匀，显微镜下观察使每个卵子周围有56个精子，并将受精卵置于黑暗环境下孵化，即获得紫墨杂交子一代家系。用上述方法建立至少20个这样的杂交家系，同时将供精的墨西哥湾扇贝精卵混合受精，建立相应数量的墨西哥湾扇贝自交家系，按照常规的扇贝育苗方法进行幼虫培育、。
19、保苗和养成后，用于雄性不育个体的筛选。00222紫墨杂交扇贝保持系的选育第二年春季将紫墨杂交子一代家系促熟后，选择50个性状优良的雄性不育个体，用常规的墨西哥湾扇贝产卵诱导方法刺激产卵，分别用其父本墨西哥湾扇贝的精子受精，收集正常受精、发育的受精卵建立回交家系，收集正常受精、发育的受精卵建立回交家系，同时将提供精子的墨西哥湾扇贝自繁建立自交家系，建立至少20个回交家系和相应的墨西哥湾扇贝自交家系并按照常规的墨西哥湾扇贝育苗方法进行幼虫培育、保苗、养成；第三年春季，将回交家系和墨西哥湾扇贝自交家系促熟后，选择50个性状优良的回交家系中的雄性不育个体，用其父本墨西哥湾扇贝的自交后代精子回交，收集正。
20、常受精、发育的受精卵继续建立回交家系，同时继续繁育墨西哥湾扇贝的自交家说明书CN104160996A4/5页6系，选择建立20个以上性状优良的回交家系及其相应的墨西哥湾扇贝自交家系；以后每年按照同样的方法选择性状优良的雄性不育扇贝与其父本墨西哥湾扇贝的自交家系回交，直到回交后代的所有个体均表现为性状优良、雄性不育且卵子可育，即获得紫墨杂交扇贝雄性不育系；再将上述能使雄性不育系个体的回交后代所有个体均表现为性状优良、雄性不育且卵子可育的父本墨西哥湾扇贝按照常规的墨西哥湾扇贝育苗方法大量自交繁育，即获得该紫墨杂交扇贝雄性不育系的保持系。00233用保持系生产紫墨杂交扇贝雄性不育系种贝的方法每年用上。
21、述保持系种贝与相应的雄性不育系杂交，即获得雄性不育且卵子可育的紫墨杂交扇贝雄性不育系种贝，以用于紫墨杂交扇贝商品苗种的规模化生产。0024实施例200252011年利用引进的紫扇贝和取自广东湛江的墨西哥湾扇贝，共培育种间杂交子一代正交和反交家系各1个。经实测，紫墨杂交扇贝紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子杂交的平均壳高为5238毫米，体重为2740克，柱重246克，而同期养殖的墨西哥湾扇贝平均壳高为4202毫米，体重为1480克，柱重为113克。紫墨杂交子一代比同期的墨西哥湾扇贝壳高提高247，体重提高约851,柱重提高1177。2012年春天，将上述杂交子一代扇贝促熟后从中选择个体大且仅雌区发育的。
22、扇贝，阴干30分钟后将扇贝置于盛有23度海水的容器中刺激产卵，用单个墨西哥湾扇贝的精子授精，培育出紫墨杂交扇贝子一代与墨西哥湾扇贝的回交家系2个。2013年春季促熟后发现一个家系全部表现为雌雄同体，另一个家系中大部分个体表现为雄性不育。0026继续将上述雄性不育的个体用其父本墨西哥湾扇贝自交后代的精子回交，经过一代至多代选育就可获得后代全部为雄性不育且卵子可育的雄性不育系母本保持系父本组合，从而分别获得雄性不育系和保持系。性腺促熟后用常规墨西哥湾扇贝产卵诱导方法催产雄性不育系扇贝可获得大量未受精的卵子，将其用保持系的精子受精，即可大规模获得用于紫墨杂交扇贝商品苗种生产的雄性不育系种贝。0027。
23、实施例300282014年，利用引进的紫扇贝与墨西哥湾扇贝共建立了紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交子一代家系14个，并建立了供精墨西哥湾扇贝的自交家系，按照实施例1的方法，可在13年内选育出紫墨杂交扇贝的雄性不育系家系及其相应的保持系和恢复系，实现紫墨杂交扇贝苗种的商业化生产。0029实施例40030本发明用于墨紫杂交扇贝保持系的构建及应用0031本发明建立的保持系的构建方法也应用于墨紫杂交扇贝墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代育种实践，并且应用于建立墨紫杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。0032首先选择紫扇贝和墨西哥湾扇贝同步促熟并刺激同时产卵、排精，分别收集墨西哥湾扇贝的卵子以及紫扇。
24、贝的精子和卵子，将墨西哥湾扇贝的卵子与紫扇贝的精子受精建立墨紫杂交子一代家系，用于选择雄性不育个体，同时将紫扇贝的精子和卵子混合受精，建立紫扇贝自交家系；第二年从墨紫杂交子一代家系中选择雄性不育的个体，用紫扇贝的精子与其受精，若受精卵正常发育则建立回交家系，用于继续选育雄性不育家系，同时将父本说明书CN104160996A5/5页7紫扇贝自体受精建立自交家系；这样经过一代至多代选择，当回交后代全部表现为雄性不育时，就获得了墨紫杂交扇贝的雄性不育系及其相应的保持系。0033用上述墨紫杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产墨紫杂交扇贝雄性不育种贝。0034实施例。
25、50035本发明用于紫海杂交扇贝保持系的构建及应用0036本发明建立的保持系的构建方法也应用于紫海杂交扇贝紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代育种，并且应用于建立紫海杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。0037首先选择紫扇贝和海湾扇贝同步促熟并刺激同时产卵、排精，分别收集紫扇贝的卵子以及海湾扇贝的精子和卵子，将紫扇贝的卵子与海湾扇贝的精子受精建立紫海杂交子一代家系，用于选择雄性不育个体，同时将海湾扇贝的精子和卵子混合受精，建立海湾扇贝自交家系；第二年从紫海杂交子一代家系中选择雄性不育的个体，用海湾扇贝的精子与其受精，若受精卵正常发育则建立回交家系，用于继续选育雄性不育家系，同时将父本海湾扇贝自体受。
26、精建立自交家系；这样经过一代至多代选择，当回交后代全部表现为雄性不育时，就获得了紫海杂交扇贝的雄性不育系及相应的保持系。0038用上述紫海杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫海杂交扇贝雄性不育种贝。0039实施例60040本发明用于海紫杂交扇贝保持系的构建及应用0041本发明建立的保持系的构建方法也应用于海紫杂交扇贝海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代育种实践，并且应用于建立海紫杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。0042首先选择海湾扇贝和紫扇贝同步促熟并刺激同时产卵、排精，分别收集海湾扇贝的卵子以及紫扇贝的精子和卵子，将海湾扇贝的卵子与紫扇贝的精子受精建立海紫杂交子一代家系，用于选择雄性不育个体，同时将紫扇贝的精子和卵子混合受精，建立紫扇贝自交家系；第二年从海紫杂交子一代家系中选择雄性不育的个体，用紫扇贝的精子与其受精，若受精卵正常发育则建立回交家系，用于继续选育雄性不育家系，同时将父本紫扇贝自体受精建立自交家系；这样经过一代至多代选择，当回交后代全部表现为雄性不育时，就获得了海紫杂交扇贝的雄性不育系及其相应的保持系。0043用上述海紫杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产海紫杂交扇贝雄性不育种贝。说明书CN104160996A。