一种提取人尿黄体生成素的方法 技术领域：
本发明涉及一种提取人尿黄体生成素的方法。
背景技术：
人尿黄体生成素是由垂体分泌的、由α、β两个不同亚基非共价结合成的异二聚体糖蛋白，分子量为29Kda，含有三个糖链。糖链的存在是维持人尿黄体生成素生物效价必需的，其末端唾液酸含量的变化形成了不同的电荷异构体。人尿黄体生成素的α亚基与尿促卵泡素、促甲状腺素、绒促性素具有相同的氨基酸顺序，各自β亚基的不同导致了不同的生物活性。
经研究证明，发达国家约有15～20％的夫妇不能生育，造成不育有多种原因，女性不育的最常见原因是由于促性腺激素缺乏引起排卵功能障碍，男性不育的最常见原因是精子退化或数量太少。人尿黄体生成素对男性和女性的生育功能都极为重要，对男性而言，人尿黄体生成素是精子发生和成熟所必需的，对女性而言，人尿黄体生成素是卵泡成熟、卵细胞分裂、排卵、黄体生成和维持黄体期孕酮分泌必需的促性腺素。
因此，人尿黄体生成素具有治疗价值，可以用于治疗人尿黄体生成素缺乏引起的一系列疾病。而目前人尿黄体生成素是在绝经后尿促性腺素制剂中与尿促卵泡素按固定比例发挥作用，对临床应用造成了很大的限制。
发明内容：
本发明的目的是要提供一种提取人尿黄体生成素的方法，从绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品中提取出高纯度的人尿黄体生成素，以用于临床治疗。
本发明是这样实现的：以适当效价的从绝经后妇女尿液中提取的绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品为起始原料，其中绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品地生物效价从每毫克1国际单位至300国际单位不等，采用适当的离子交换层析方法，包括阴离子交换介质层析或阳离子交换介质层析，既可使用其中一种层析方法，又可二种层析方法同时使用，且前后顺序可以互换，对起始原料绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品进行初步纯化，阴离子交换层析用介质，活性基团为二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基季胺(Q)、二乙基羟丙基季胺(QAE)等，载体是为(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)和纤维素(Cellulose)等，以选用Q-Sepharose为优，对阳离子交换层析，层析介质的活性基团为磺酸基(S)、磺酸丙基(SP)、羧甲基(CM)等，载体为琼脂糖(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)和纤维素(Cellulose)等，选用SP-Sepharose为首，层析条件，离子强度为0.01M～0.5MNaCl或KCl，采用0～1M NaCl或KCl线性梯度洗脱、分部收集或分段洗脱，收集或合并含人尿黄体生成素活性部分，阴离子交换层析pH控制在4.0～10.0，阳离子交换层析控制pH在3.8～pH7.5，收集液可以用冷冻干燥或用丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀方法获得适于进一步纯化用的干物质，也可以用超滤等方法浓缩脱盐，直接用于后续工艺，以乙醇沉淀方法为优，沉淀时乙醇的终浓度为70～90％，以80％为优，以上述中获得的干物质或浓缩液为原料，进行疏水层析作进一步纯化，层析介质为Phenyl Sepharose或OctylSepharose或Butyl Sepharose，选用Phenyl Sepharose为优，吸附条件为pH4-8，溶液含0.5-2M NaCl或(NH4)2SO4，以NaCl为优，洗脱用降低盐浓度的方法作梯度洗脱或分段洗脱，分部收集含人尿黄体生成素的部分，用冷冻干燥或用丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀方法获得适于进一步纯化用的干物质，也可以用超滤等方法浓缩脱盐，直接用于后续工艺，以乙醇沉淀方法为优，沉淀时乙醇的终浓度为70～90％，以80％为优，从上述获得的干物质或浓缩液，用分子筛凝胶过滤方法将人尿黄体生成素与残存的杂蛋白分开。本步按无热原操作，分子筛凝胶为G-75或G-100，凝胶骨架为Sephadex或Superdex，也可以是Sephacryl S-100，以SephadexG-100首先，层析条件为pH4～8，缓冲液含0～0.5M NaCl，紫外检测流出，分部收集，用FPLC检测纯度，合并含人尿黄体生成素活性且FPLC为单一成分的部分，超滤脱盐、浓缩，冷冻干燥，也可以加入无水乙醇至终浓度为70～90％沉淀蛋白质，沉淀以80％为优，本步干燥以冻干为优，最终获得的蛋白质，可以按照已知的方法指标成冻干制剂，制剂含有适当的赋形剂，可以是甘露醇、乳糖、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖或它们的混合物，也可含有适当的保护剂，如人血白蛋白。
由于本发明采用了离子交换层析、疏水层析及分子筛凝胶层析方法、因而，才得以从绝经期尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品中提取出高纯度的人尿黄体生成素，其生物效价在每毫克5000～15000国际单位，人尿黄体生成素与尿促卵泡素生物活性的比例大于100∶1。
具体实施方式：
以下将详细说明依据本发明提出的一种提取人尿黄体生成素的方法的细节。
本发明为一种提取人尿黄体生成素的方法，即从人尿黄体生成素粗品中提取出高纯度的人尿黄体生成素的方法，其实施步骤如下：
一、采集绝经后5～20年的55岁～70岁健康妇女尿液后经过高岭土吸附、乙醇抽提、硅酸滤吸附后制备人尿黄体生成素粗品(LH活性208IU/mg)
二、进行阴离子交换层析方法对粗品进行初步纯化，先经过Q-Sepharose FF(Amersham-Pharmacia公司产品)层析，层析条件选为0.01M Tris缓冲液，pH9.5，0～1M NaCl线性梯度洗脱，收集含人尿黄体生成素组分，超滤脱盐；
三、进行阳离子交换层析方法对粗品进一步纯化，然后使用SP-Sepharose FF(Amersham-Pharmacia公司产品)层析，层析条件选为0.01M NaAc，pH5.2，0～1M NaCl线性梯度洗脱，收集含人尿黄体生成素组分，超滤脱盐；
四、进行疏水层析方法进一步纯化，再使用phenyl-SepharoseFF(Amersham-Pharmacia公司产品)进行纯化，层析条件选为0.01M Tris缓冲液，1M NaCl，pH7.2，用1M～0M NaCl线性梯度洗脱，收集含人尿黄体生成素组分，超滤浓缩；
五、进行分子筛凝胶层析方法将人尿黄体生成素与残存的杂蛋白分开，最后使用Sephadex G-100凝胶过滤，流动相为0.02M NH4Ac，pH7.0。收集含人尿黄体生成素的活性组分，冷冻干燥得到高纯度人尿黄体生成素。
产品采用中国药典2000版附录的人尿黄体生成素生物测定法(幼大鼠精囊增重法)测定人尿黄体生成素效价，效价为9300IU/mg，采用尿促卵泡素生物检定法(幼大鼠卵巢增重法)测定尿促卵泡素效价，小于90IU/mg。人尿黄体生成素与尿促卵泡素之比大于100比1。