单糖苷化类黄酮的制备 本发明涉及通过酶促水解芸香糖苷制备单糖苷化类黄酮的方法。在此操作过程中，酶促断裂芸香糖苷的鼠李糖基。
为了本发明的目的，芸香糖苷被认为是含有通过糖苷键与式(I)基团连接的苷元成分的化合物。例如，芸香糖苷可以是含有式(I)所示二糖苷单位的类黄酮。从芸香糖苷可以得到鼠李糖和/或相应的吡喃葡糖苷。由于含有与苷元成分键合的式(I*)基团而非式(I)的基团，这些吡喃葡糖苷来源于芸香糖苷。例如，从芸香苷可以获得鼠李糖和异栎精。
鼠李糖是天然存在于许多地方的一种单糖，但大多数情况下其仅以小量存在。鼠李糖的重要来源包括例如天然类黄酮如芸香苷的糖苷基团，通过除去糖苷可以从其中获得鼠李糖。鼠李糖是极有价值的，例如可以作为制备非天然芳香物质如furaneol的起始物。
异栎精是具有如下结构式(II)的单糖苷化类黄酮所谓类黄酮(flavonoids)(拉丁语：flavu＝黄)，其是广泛分布在植物中的染料，是指例如黄酮的糖苷，类黄酮与黄酮具有共同的黄酮母体结构(2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)。
类黄酮的苷元成分是所谓的糖苷配基。例如，异栎精是糖苷配基栎精(2-(3，4-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)(其与黄酮不同之处在于存在5个羟基基团)地糖苷。在异栎精中，碳水化合物基团葡萄糖与栎精第3位的羟基键合。例如，异栎精被命名为栎精-3-O-β-D-吡喃葡糖苷或2-(3，4-二羟基苯基)-3-(β-D-吡喃葡糖基氧基)-5，7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。然而，其又以例如商品名Hirsutrin出现。
类黄酮或类黄酮混合物被用于例如食品和化妆品工业，其中它们的重要性正在日益增加。尤其是，单糖苷化的类黄酮如异栎精以可以被人体良好地吸收为特征。
具有二糖苷单位的天然类黄酮的例子是芸香苷，其具有如下结构式(III)：
与异栎精一样，芸香苷同样是糖苷配基栎精的糖苷，其中碳水化合物基团芸香糖与栎精第3位的羟基连接。芸香苷中的碳水化合物基团包含在第1和6位进行连接的葡萄糖单位和结合在末端的鼠李糖或6-脱氧甘露糖单位。例如，芸香苷被称作栎精-3-O-β-D-芸香糖苷或2-(3，4-二羟基苯基)-3-{[6-O-(6-脱氧-α-吡喃甘露糖基)-β-D-吡喃葡糖基]氧基}-5，7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。但它也被称作例如槐苷、birutan、rutabion、taurutin、芸香素、melin或芦丁(rutoside)。
芸香苷与三分子结晶水形成浅黄至绿色的针状物。无水芸香苷具有弱酸性质，在125℃下变为棕色并在214-215℃分解。芸香苷存在于许多植物物种中--常常作为维生素C的伴随物-例如在柑橘属的种中、在黄色杂种堇菜、连翘属和金合欢属的种、各种茄属和烟草属的种、山柑属、来檬花、金丝桃属、茶等植物中，在1842年它从芸香(Ruta graveolens)中被分离到。芸香苷还可以从荞麦属和东亚染料药物Wie-Fa(槐树，豆科)的叶获得，它们含有13-27％的芸香苷。
可能期望从天然原料如从含有二糖苷单位的类黄酮制备鼠李糖和单糖苷化类黄酮。例如，在本上下文中，将芸香糖苷裂解为鼠李糖和相应的吡喃葡糖苷是有意义的。
文献中公开有鼠李糖的酶促制备。例如EP-A0,317,033描述了制备L-鼠李糖的方法，其中通过酶学方式水解含有结合在末端位置的鼠李糖的糖苷的鼠李糖苷键。此裂解作用于通常在含水介质中以悬浮物存在的底物。然而，这些反应的选择性极差。例如，芸香苷中的碳水化合物基团的二糖苷结构常常导致两种单糖即葡萄糖和鼠李糖的混合物。而且，通常会形成大部分的糖苷配基栎精和其它不期望的副产物。
而且，芸香苷的酶促裂解也已描述在JP-A0,121,3293中，然而，在含水介质中进行这些反应同样常具有很差的选择性。
上述这些方法使用溶液中的酶，即天然物质形式的酶。这些方法涉及将酶直接加入反应溶液中。尽管这些方法可以在实验室规模上进行，但不可能进行工业应用，因为该酶不能从反应溶液中重新回收再利用。然而，仅仅使用这些昂贵的酶一次在工业规模上是不经济的。
已知当将酶与支持物结合后即可将它们用于工业应用。该方法被称作“固定化”。按照欧洲生物技术联盟(1983)的定义，术语“结合(或固定化)酶”包括，“以允许对其进行再利用的状态存在的”所有酶(HelmutUhlig，Technische Enzyme and ihre Anwendung，Carl Hanser Verlag，Munich/Vienna 1991，第198页)。尽管有此优点，但固定化对所有的酶促过程并不都适合，由此仅在有限的范围内采用。具体地，仅两种结合酶在商业规模上使用：用于葡萄糖异构化的固定化葡萄糖异构酶和用于裂解青霉素G的固定化青霉素酰胺酶。通常结合酶方法并不能替代游离酶或化学方法。常常是酶或反应条件不适合进行固定化。因此，不存在通用的固定化方法，对每个酶都必须作单独考虑。
例如，当芸香糖苷用作酶水解的底物时，对于酶的适用性而言重要的含水系统会引起溶解性问题。因此该反应优选使用过饱和底物溶液，即悬浮物形式的芸香糖苷进行。然而，其中底物以固体存在的过饱和溶液阻止了固定化方法的使用。在原材料、产物颗粒和固定酶之间缺少选择性。
因此，本发明的目的是提供制备可以用于工业规模的单糖苷化酶的方法，以避免高的酶损耗同时实现高度的自动化、高的时空产量和高生产力和选择性。
该目的通过酶促水解芸香糖苷制备单糖苷化类黄酮的方法得以实现，其中用于酶促水解的酶是已经被固定在支持物上的酶。
我们惊奇地发现，尽管芸香糖苷的溶解轻微，但使用固定酶进行酶促水解也是可能的。固定化使得可以连续地或分批地实施该方法，与使用天然酶进行的反应相比这具有高效性。本发明方法尤其不同的地方在于它使得整个程序的高度自动化成为可能，包括溶剂的回料和酶活性的监测。
图1示例了异栎精自芸香苷的连续制备，作为本发明方法的例子。
用于本发明方法的适当芸香糖苷是含有作为苷元成分或糖苷配基的如下母体物质的那些，所述母体物质包含2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，其在第3位携带式(I)基团并且其苯基(除了第3位外)可以被-OH或-O(CH2)n-H进行单或多取代，其中n从1至8。n优选表示1。
-OH和/或-O(CH2)n-H对母体物质2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的取代优选发生在第5、7、3’和/或4’位上。特别优选的是使用式(A)的芸香糖苷：其中R代表H、OH、或OCH3。
其中R代表H的化合物被称作莰非醇芸香糖苷；其中R代表OCH3的的芸香糖苷被称作异鼠季亭芸香糖苷。其中R是OH的化合物称作芸香苷。因此，本发明的方法可以从莰非醇芸香糖苷产生鼠李糖和莰非醇糖苷、从芸香苷产生鼠李糖和异栎精、从异鼠季亭芸香糖苷产生鼠李糖和异鼠季亭糖苷。
尤其优选使用芸香糖苷芸香苷。
用于本发明方法的起始物可以是纯的芸香糖苷或芸香糖苷的混合物。该芸香糖苷也可以混有不负面影响反应的其它类黄酮或来自芸香糖苷生产的残渣。
用于酶促水解芸香糖苷的酶可以是能够从芸香糖苷中裂解出鼠李糖基团的常规水解酶。优选使用获自Penicillium decumbens菌株的水解酶。尤其优选使用α-L-鼠李糖苷酶，因为它们对鼠李糖基的水解表现出高度的选择性。适当的α-L-鼠李糖苷酶有例如桔皮苷酶、柚皮苷酶、和描述在Kurosawa等(1973)J.Biochem.，第73卷：31-37中的那些。极为优选使用桔皮苷酶。
用于本发明方法的芸香糖苷和酶均可以以商品形式获得。也可以通过熟知方法分离或制备该起始物和酶。
将该酶固定在适当支持物上。为此目的，可以使用常规支持物，例如硅胶如商业球形硅胶或商业碎硅胶，如Lichrosorb、Lichroprep、Lichrospher、和Trisoperl，和商业多聚支持物，如Eupergit、Fractogel，尤其是Fractogel epoxy和Fractoprep。硅胶可以被认为是优选的支持物材料。
或者，可以使用磁性颗粒作为支持物。优选地这些是具有磁性核心的支持材料。该核心通常以无机氧化物包封。该无机氧化物优选是硅胶。这些磁性支持物的例子包括MagneSilTM(Promega Corp.，Madison，Wisconsin，US)、MagPrepTM(Merck)和AGOWAmagTM(AGOWA GmbH，Berlin，DE)。或者，所用磁性支持物可以是磁性玻璃颗粒悬浮物(例如，MPG(CPG Inc.，Lincoln Park，New Jersey，USA))以及含有磁铁矿的颜料(例如Microna Matte，Mica Black，Colorona Blackstar(均来自Merck))。尤其适合的是无孔磁性颗粒(例如MagPrep)，因为它们不会引起孔堵塞而导致酶活性受到剧烈破坏。
酶支持物通常具有以下特征：支持物的颗粒大小优选从0.005至1mm，更优选从0.01至0.5mm。孔直径通常从10至4000nm，尤其优选30至100nm的孔直径。足够大的孔直径将保证该酶可以加载至支持物上而不损失活性。颗粒表面面积优选从40至100m2/g，而且孔体积优选选自0.5至3mL/g的范围。在某些情况下，从2至20μm的极大孔直径可能是适当的。
酶可以通过共价键或吸附进行结合。一般地，优选共价键合。共价偶联的例子包括环氧化、碳二亚胺法、硅烷化、溴化氰法、戊二醛交联或二甲苯基氯法(参见生物转化和酶反应，A.S.Bommarius，Biotechnology(第2版)，第3卷，427-465页，G.Stephanopoulos编，VCH Weinheim，德国1993；D.R.Walt等，Trends in Analytical Chemistry，第13卷第10期，1994；N.H.Park，H.N.Chang，J.Ferment.Technol.第57卷(4)，310-316，1979；M.Puri等，Enz.Microb.Technol.，18，281-285，1996；和H.-Y.Tsen，J.Ferment.Technol.62(3)，263-267，1984)。为了实施本方法，必须用适当的官能团对支持物作表面修饰。可以通过使用功能性单体共聚合或通过类聚合物转化将官能团加至支持物上。尤其优选使用氨基、醛基、或环氧环或二醇来进行表面修饰。然后可以将酶和这些基团共价键合。
该酶促水解在适当的反应器中进行。商用塔尤其适合本发明方法的连续进行。当以小规模工作时，可以使用例如用于制备性HPLC的塔。反应器，尤其是塔应表现出高水压效率。这可以通过理论板的数量来量化。因此有利的是保证固定物表面和原料溶液有紧密接触以便有效地利用酶和获得高生产力。上述制备性HPLC柱满足这些要求，还可以给其装备适当的技术工具和外围设备(泵、阀、控制工具)。而且有利的是已经开发出用于此目的的检测手段如UV或RI检测手段，以致如果期望时可以自动测量和控制反应达到的转化度。
如果连续操作模式使用磁性支持材料，则通常使用设计使磁性颗粒保持稳定悬浮物形式的管状反应器，例如在流动管中产生磁通量的磁力线与流动方向平行的基本均一磁场(赫尔姆霍茨磁场)的电磁线圈。在此磁稳定的流化床反应器(磁稳定流化床(MSFB))中，比在常规流化床或流化床柱(也适用于这些目的)中可以得到实质上较高的流速。该技术也可以用于促进粘性反应介质中的催化反应。
当本方法按分批方式进行时，常规容器，优选配有搅拌器的常规容器是适合的。因此，小规模时可以使用配有搅拌器的圆底烧瓶，大规模时可以使用搅拌罐。
在反应前按常规方式将固定物装入反应器中。
将待转化的芸香糖苷通常以溶液或悬浮物的形式加入反应器，例如柱或塔，如固定床柱。如果所用反应器是固定床反应器，则该芸香糖苷溶液应完全不含有固体物质。有利的是在罐中将芸香糖苷预先溶解在溶剂中，优选通过搅拌和/或加热来实现，以便获得最佳的溶解度。如果必需的话，还可以预过滤溶液以便除去任何固体物质。溶剂优选是含水系统以便保证酶活性和预防可能的变性。为了保证芸香糖苷的溶解，可以加入其它溶剂。优选地本发明的方法在水和至少一种有机溶剂的溶剂混合物中进行。
补充的有机溶剂包括可与水混溶的和与水不能混溶的有机溶剂。
用于本发明方法的适当溶剂有腈类如乙腈，酰胺类如二甲基甲酰胺，酯类如乙酸酯，尤其是乙酸甲酯或乙酸乙酯，醇类如甲醇或乙醇，醚类如四氢呋喃或甲基叔丁基醚，和烃如甲苯。
本发明方法优选在一或多种有机溶剂如乙酸乙酯、甲醇、乙醇、甲基叔丁基醚或甲苯存在时进行。本发明方法极为优选在一种或多种乙酯尤其是乙酸甲酯以及水存在下进行。
对于本发明方法，水和有机溶剂的适当比例为1∶99至99∶1的体积比。本发明方法优选使用20∶80至80∶20的水和有机溶剂体积比，尤其是50∶50至70∶30的体积比来进行。
本发明方法中存在于溶剂或溶剂混合物中的芸香糖苷量由芸香糖苷在该溶剂或溶剂混合物中的溶解度来控制。当芸香糖苷容易溶解时，本发明方法可以得到最佳实施。为此原因，优选使用过饱和溶液进行操作。通常溶剂或溶剂混合物中芸香糖苷的量从0.001至5g/L，优选从0.05至2g/L，更优选从0.1至1.5g/L。
芸香糖苷与固定物或酶的比例取决于该酶在塔或柱中的寿命和固定化形式时它的活性。
反应通常在15℃至80℃的温度下进行。优选从30℃至60℃的温度，40℃至50℃的温度尤其有利于避免对酶的任何可能破坏同时又保证芸香糖苷的高溶解度。
当反应温度过低时，降低的酶活性会造成反应以不适当的缓慢反应速度进行。此外，芸香糖苷的溶解度也会降低至一定程度，以致需要不必要的大量溶剂。另一方面，如果反应温度过高，酶作为蛋白质会发生变性并因此失活。
当本发明方法在高温下进行时，可以给反应器配备温度控制装置。常用温度控制装置含有加热旋管系统或双层夹套。而且，有利的是对待转化的芸香糖苷、尤其是芸香糖苷溶液在进入反应器前进行温度控制。为此目的，通常从保持在反应所需温度下的温度受控塔中取出芸香糖苷溶液。或者，可以使待添加的溶液通过加热的挠性管以便使其在进入反应器前温度达到期望值。所述加热还可以防止芸香糖苷结晶。
用于本发明方法的适当pH为pH3至8。优选地，本发明方法在pH3至7、尤其是pH3至6下进行。然而，优选的pH可以根据所用酶在特定的限度内变化。例如，当使用桔皮苷酶时，极为优选3.8至4.3的pH。
优选地，本方法以使用缓冲系统调节pH的方式进行。理论上，适合于设置上述pH的所有常用缓冲系统均是可用的。然而，优选使用含水柠檬酸缓冲盐。
将可以以溶液或悬浮物形式存在的芸香糖苷混合物放入含有固定物的反应器，以便进行酶促水解。该反应可以连续地或分批地进行。
如果反应按分批方式进行，则通常将芸香糖苷悬浮物放入反应器中。转化度由芸香糖苷和固定物的量来决定。通常，芸香糖苷与固定物的比例为100∶1至1∶1000，优选从10∶1至1∶100，更优选从1∶1至1∶20。固定物与悬浮物总体积的比例通常为1∶1000至1∶1，优选从1∶100至1∶2、更优选从1∶50至1∶5。反应器中的停留时间正常为1小时至10天，优选8小时至4天，更优选1至2天。
当反应连续进行时，通常通过适当的泵将芸香糖苷溶液恒定地运输通过反应器，尤其塔或MSFB反应器。通过适当地设置流速，可以得到任何期望的转化度。正常情况下，基于塔或柱的空管截面，所用流速为0.001至1mm/s。
在该系统中酶的活性被发现随着时间降低。因此，必须定期完全或部分地更换固定物。为了弥补酶活性的损失，有利的是通过UV或RI检测评价转化度，以便当组成发生改变时可以通过泵出控制以对此进行消除。
在反应溶液离开反应器后，可以对所获产物进行分离。反应完成时，反应混合物主要由溶剂、未转化的芸香糖苷、鼠李糖、期望的单糖苷化类黄酮和可能的其它的添加剂如缓冲物质组成。通常单糖苷化类黄酮在达到溶解度限度时发生沉淀并逐渐地聚集为固体。
在使用磁性支持材料进行批操作的情况下，可以在反应完成后借助磁性分离装置以简单的方式从产物悬浮物中分离出结合酶。在实验室规模上，板状形式的强永久磁铁可以用于此目的。然而，现有开发用于极为多样的工业应用的较大分离器，它们大多数按HGMS原则(高梯度磁性分离)操作。该设备可以由例如含有细不锈钢金属丝束的垂直流动管组成。适当放置的电磁线圈沿着这些金属丝产生高磁通量梯度，借此方式可以极为有效地分离甚至纳米数量级的极小颗粒。如果磁性颗粒是超顺磁的，即在没有外部磁场存在时不表现剩余磁化强度，则在关闭磁场后通过用水反复洗涤可以将它们容易地和完全地从分离器中除去。
通过涉及常规检查装置的常用方法分离期望的反应产物。
优选地，通过浓缩沉淀产物。如果溶剂包含含有至少一种有机溶剂的溶剂混合物，则优选通过在减压下蒸馏去除该有机溶剂。结晶的单糖苷化类黄酮通常通过固液相分离方法，如在减压下虹吸或过滤，或通过对沉淀的晶体离心，从剩余的反应混合物中分离出来。然后，优选用水洗涤该固体，然后干燥。
或者，可以首先滤出整个反应器内容物。然后用产物可在其中溶解的溶剂或缓冲溶剂混合物处理含有产物的滤饼。在此操作过程中从滤饼中抽提出反应产物。
在批操作中，剩下在此混合物中不溶的催化剂，即固定物。对于溶剂或缓冲溶剂混合物必要的是对该酶不具有破坏作用。已经发现结合酶例如柚皮苷酶或桔皮苷酶在某些缓冲溶剂混合物中或在弱碱性条件下不再具有活性或仅具有部分原始活性，但如果之后在pH4至6的缓冲溶液中仔细洗涤该酶，该活性实际上可以得到完全的恢复；因此，此处的活性丧失仅仅是暂时的，并不等价于酶的不可逆变性。
对于此方法，尤其是在稍高的温度下实施该方法时，极为适合的抽提剂是四氢呋喃缓冲混合物，优选具有10-25％含量的四氢呋喃的那些。其它适当的抽提成分有例如1-丙醇、2-丙醇、1，4-二噁烷、和乙酸甲酯。产物可以通过减压下蒸馏除去溶剂然后将含有产物的含水溶液冷却至0℃-10℃极为容易地从抽提物中回收得到。该反应产物自母液中以极高纯度结晶。
作为溶剂/缓冲液混合物的替代，可以使用稀氨水或苏打溶液作为抽提剂，因为反应产物具有可在弱碱性介质中去质子化的酚羟基；阴离子反应产物表现出相当好的溶解度，但它也极为易于氧化，这显而易见地表现为抽提物自黄色向棕色的逐渐变色。因此，这种变化的方法必须极为快速地进行操作，即应当在10分钟至6小时，优选20分钟至2小时的时间内完成此抽提。此操作优选在保护性气体层下进行。
此外，使用弱碱性抽提剂如乙酸、草酸、柠檬酸、磷酸、硼酸、或碳酸的碱金属或铵盐的含水溶液，或烷基胺类、哌啶或吡啶的含水溶液进行处理不会造成酶活性的丧失。反应产物可以通过酸化抽提物并冷却至0-10℃进行再次沉淀。
当使用纯的芸香糖苷时，所获单糖苷化类黄酮的纯度通常为94％以上。为了进行进一步纯化，可以例如从适当的溶剂中，例如从水或包含甲苯和甲醇、或水和乙酸甲酯的溶剂混合物中重结晶终产物。
为了保持本发明方法的经济价值，优选回收反应后的剩余溶剂。此再循环通常以连续和自动的方式进行。具有适当控制装置的商业蒸发装置可以用于此目的。如果所用溶剂是水和至少一种有机溶剂的溶剂混合物，则通常立即将蒸馏物再次用于本方法是不可能的，因为溶剂的比例会因有机溶剂的蒸馏而改变。利用自动质量控制和校正，可以通过适当地重新循环溶剂再次确立期望的溶剂比例。
而且，浓缩可以包括膜处理或纳过滤。在这些方法中可以分离出溶剂混合物而不改变其组成。
以下实施例旨在举例说明本发明。然而，它们决不构成限制。实施例1在硅胶支持物上固定桔皮苷酶
1)固定前支持物表面的调节
1.1)支持材料的性质
硅胶LiChrospher
直径＝15-40μm
孔直径＝300
颗粒表面积＝80m2/g
孔体积＝0.73mL/g
密度＝2g/mL
1.2)硅胶的活化
将250g硅胶和充足的HCl(7％)在容量为1L的烧瓶中混合，放置过夜以便润湿硅胶。
然后用软化水洗涤硅胶悬浮物直到不再含有氯化物。为此，必须在每次洗涤后用硝酸和硝酸银测试上清液。由于硅胶颗粒的性质，洗涤在具有约24scm直径的陶瓷漏斗中进行。
1.3)用氨基进行表面修饰
在容量2L并配有回流冷凝器和滴液漏斗的三颈烧瓶中，将酸处理的硅胶和充足的水混合以达到可搅拌的程度。室温下彻底混合后，向硅胶悬浮物以约每秒5滴的速度滴加包含3-氨基丙基三甲氧基硅烷的1mmol/g支持物(250g硅胶需要135mL溶液)。然后90℃搅拌悬浮物2小时。然后用冰冷却此悬浮物。
必须通过读取pH检查上清液中可能残余的3-氨基丙基三甲氧基硅烷。用软化水洗涤悬浮物颗粒直到pH保持恒定。
1.4)用戊二醛包被
按1mmol/g支持物的浓度向所获硅胶悬浮物中加入戊二醛(GDA)(250g支持物需要13mL 50％GDA浓溶液)。在容量1L的烧瓶中于室温下摇动此悬浮物(加上小量水)2小时。开始时悬浮物变为黄色，程序结束时其为暗红色。
用二硝基苯肼通过沉淀反应，对每次洗涤后获得的上清液进行残余戊二醛检测。仔细洗涤悬浮物直到测试结果为阴性。
2)固定
2.1)桔皮苷酶
蛋白质的第一种添加
在500mL柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合物(pH6.0)中搅拌3.8g桔皮苷酶。为了增加溶解，加入300μl表面活性剂(Tween20)。然后过滤该酶溶液。
在容量1L的烧瓶中，将约230g按1.4)所述获得的硅胶悬浮物与该酶溶液混合。然后室温下摇动酶支持物悬浮物约40小时。
蛋白质的第二种添加
在含有60μl表面活性剂的120mL柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合物(pH6.0)中搅拌约0.76g桔皮苷酶(Amano)，随后过滤。
将此酶溶液倾入上述容量1L的烧瓶中，室温下摇动该酶溶液。
2.2)BSA(用于分离检测)
在100mL柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合物(pH6.0)中搅拌0.3BiomexBSA(牛血清白蛋白粉末)。在容量0.5L的烧瓶中，将约20g按1.4)所述获得的硅胶悬浮物与此蛋白质溶液混合，并加入60μl ProClin300。
3)测定蛋白质的量和活性
3.1)蛋白质的量(每mL的蛋白质mg数)
通过Bradford测试法测量溶液中蛋白质的含量。进行标准测定。这是通过将20μl样品混合在1mL Bradford染料试剂(1∶5稀释的)中、然后15分钟后595nm读取光度值进行的。
极小的蛋白质浓度需要使用微量测定法。这包括将0.8mL样品混合在0.2mL Bradford染料试剂(浓缩的)中，然后15分钟后595nm读取光度值。
3.2)活性
通过溶液与替代底物的反应，测量溶液的活性。
对于每一份样品，使用：
88μl 柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合物(pH＝4.0)
100μl 样品
20μl 样品
20μl 替代底物：对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷(鼠李糖
苷酶活性)
对硝基苯基-α-L-葡萄糖苷(葡萄糖苷酶活性)
将此1mL溶液在Eppendorf反应管中混合。烧瓶中40℃分别温育2分钟和5分钟后，将每100μl反应混合物与1mL 1M苏打溶液混合。然后在400nm通过光度计测量对硝基苯酚的浓度。从每单位时间对硝基苯酚浓度的改变计算活性。
酶活性表示为单位(U)(＝每分钟转化的底物的μmol数)
4)结果
蛋白质含量和活性值
(游离的桔皮苷酶) 样品1 蛋白质的量 (标准测定) 活性 (替代底物) mg mg/ml样品 U U/ml样品 U/mg蛋白 Hesp0 740 1.48 4800 96 65 1 15 0.03 7 0.014 0.47 2 20 0.04 4 0.008 0.2 Hesp1 326 2.72 11400 95 35 3 56 0.09 1450 2.33 26 4 28 0.045 361 0.58 13 5 22 0.035 95 0.15 4.3 6 20.5 0.033 11 0.018 0.541Hsp0：蛋白质的第一种添加Hsp1：蛋白质的第二种添加样品1-6：上清液
蛋白质含量和活性值
(固定的桔皮苷酶)*支持物的蛋白质含量≈1,045g结合的蛋白质*位于支持物上的为4.7mg蛋白质/g支持物*2％加入的蛋白质没有结合实施例2使用固定物通过酶促水解从芸香苷产生异栎精
在容量4.5m3的加热搅拌罐中(1)放入3200L软化水和800L 1-丙醇。通过蒸汽入口(2)将混合物加热至约50-60℃。剧烈搅拌下向溶液中加入8000g芸香苷，DAB。搅拌混合物直到芸香苷完全溶解。然后通过循环泵和在线pH仪(3a)监测pH，并在必要时将pH设定在4.0-4.5(使用H3PO4和NaOH)。可以通过手动阀(4)采取样品用于检查目的和浓度的测量。
通过袋滤器(5)和管滤器(6)向活塞式定量给料泵(7)添加此溶液，以起始反应。袋滤器负责阻止绝大部分的未溶解成分，而管滤器滤净该溶液至0.2μm细度。
活塞式定量给料泵(7)通过可加入的软管运输溶液，其通过温度计将进入柱子时的溶液温度调节至40℃，流入柱子(9)(100×400mm)的速率为1L/min。柱子含有1.5kg固定物。由于电加热的软管不能使溶液冷却，因此将搅拌罐(1)中的温度设置到一定值，以便在最大的泵递送速度下流向泵的沿途过程中发生的冷却造成不超过40℃的温度。
在溶液渗滤通过柱子后可以通过手动阀(10)从溶液中采取样品，借此手段可以离线测量温度和反应达到的转化度。如果测量的转化度低于要求，则适当地降低泵的输出。
在溶液通过柱子后反应完全结束，以致可以将该溶液传递至收集管(11)。在那里溶液通过冷凝器(12)体积降低约10-20％。通过此方式，丙醇的含量相当大地降低，这意味着异栎精的溶解度也陡然下降。随后的冷却使得溶解度进一步下降以致产物沉淀并可以在袋滤器(13)中分离。从此，将产物传递至干燥箱(14)进行脱水。母液和经蒸馏的冷凝物一起再循环重新在搅拌罐(1)中使用。实施例31.使用醛基修饰硅胶颗粒和在此颗粒上固定柚皮苷酶
在能够密封的容器中将400mL 10％浓HCl倾倒至250g硅胶(例如LiChrosper Si300，Merck，Darmstadt)上，之后通过超声使此容器脱气10分钟，并置于室温24小时。然后滤出硅胶并用几升软化水洗涤直到pH大于4.5并且在滤液中不再能够检测到氯离子(使用AgNO3的乙酸溶液进行斑点反应)。
将酸处理的润湿硅胶置于容量4L并配有旋进玻璃搅拌器、回流冷凝器和100ml滴液漏斗的三颈烧瓶中，在其中和3L软化水一起搅拌成浆。搅拌下经15分钟通过滴液漏斗加入100mL氨基丙基三甲氧基硅烷(ABCR，Karlsruhe)。然后加热悬浮物并在90℃搅拌90分钟。过滤冷却的悬浮物并每次使用1L软化水洗涤8次。
在容量4L并配有旋进玻璃搅拌器和100ml滴液漏斗的三颈烧瓶中，将氨基活化的硅胶悬浮在通过超声已经脱气的3L水中；加入几滴2M乙酸将pH降低至8.0。然后经1小时滴加100ml 50％戊二醛浓溶液(Merck，Darmstadt)，室温再搅拌该悬浮物2.5小时。再次过滤活化的硅胶，并用冰冷的软化水洗涤直到在洗水中不再能够检测到戊二醛(使用2，4-二硝基苯肼的硫酸溶液进行斑点反应)。
在容量4L的烧瓶中使用旋进玻璃搅拌器搅拌将醛基修饰的硅胶悬浮在500ml软化水中。将13g柚皮苷酶(Sigma，Deisenhofen)溶解在2.5L0.25M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中。向硅胶悬浮物加入此酶溶液，并室温搅拌96小时。然后滤出固定物并首先用0.2M氯化钠溶液然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)洗涤数次。通过Kurasawa法使用对硝基苯基-L-α-吡喃鼠李糖苷(Sigma，Deisenhofen)作为底物测定固定物的鼠李糖苷酶活性。2.将桔皮苷酶固定在EupergitTMC上
在具有螺旋盖的500ml玻璃瓶中将50g Eupergit(Rohm，Weiterstadt)与300mL 0.8M磷酸钾缓冲液(pH8.5)混合，并放置30分钟。然后加入5.0g桔皮苷酶(Amano)，室温下在旋转混合器上搅拌此批物质120小时。通过烧结玻璃滤器滤出Eupergit，并首先用0.2M氯化钠溶液洗涤数次，之后用每次1L的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)洗涤两次。通过Kurasawa法使用对硝基苯基-L-α-吡喃鼠李糖苷(Sigma，Deisenhofen)作为底物测定固定物的鼠李糖苷酶活性；基于干固定物其为15U/g，或基于润湿的固定物为4.2U/g。3.在搅拌罐反应器中使用固定在Eupergit上的桔皮苷酶将芸香苷转化为异栎精，随后使用四氢呋喃/缓冲液混合物抽提产物
在容量2000ml的圆底烧瓶中，40℃使用旋进玻璃搅拌器一起搅拌1000ml 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)、100g(湿重)固定在Eupergit上的活性4.2U/g的柚皮苷酶、和10g芸香苷(Merck，Darmstadt)；通过HPLC分析连续测定转化度。总共96小时后，通过Buchner滤器滤出反应器内容物。将滤饼重新装入该圆底烧瓶中，在400ml 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)和100ml四氢呋喃的混合物中40℃搅拌30分钟，在此操作过程中绝大部分异栎精溶解。热过滤此混合物并用500mL缓冲液/四氢呋喃混合物再次抽提滤饼30分钟。过滤后，将两次异栎精抽提物和第一次滤液合并，然后借助旋转蒸发器除去四氢呋喃。为了完全沉淀该产物，将此含水异栎精溶液冷却至4℃。过滤并在干燥器中干燥后获得5.8g产物产量，其由98％异栎精和2％芸香苷组成。
用冷四氢呋喃缓冲液混合物洗涤此润湿的Eupergit一次，然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)重复洗涤，直到仅仅可微弱地分辨到四氢呋喃的气味。酶活性仍有3.6U/g，这等于损失了14％的活性。4.在搅拌罐反应器中使用固定在Eupergit上的桔皮苷酶将芸香苷转化为异栎精，随后使用碱性缓冲液抽提产物
在容量2000ml的圆底烧瓶中，40℃使用旋进玻璃搅拌器一起搅拌1000ml 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)、100g(湿重)固定在Eupergit上的活性4.2U/g的柚皮苷酶、和10g芸香苷(Merck，Darmstadt)；通过HPLC分析连续测定转化度。总共96小时后，通过Buchner滤器滤出反应器内容物。将湿的滤饼重新装入该圆底烧瓶中，在300ml 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH10.0)中室温搅拌5分钟，在此操作过程中部分异栎精溶解产生深黄色。过滤悬浮物并立即用碳酸盐缓冲液再次抽提此滤饼。总共7个抽提循环后，Eupergit基本上无颜色而且异栎精实际上得以完全溶解。将抽提物合并，仔细用稀释的盐酸酸化直到pH接近3，然后将混合物冷却至4℃。过滤和在干燥器中干燥后，获得产量4.9g的产物，其包含98％异栎精和2％芸香苷。
用50mM柠檬酸盐缓冲液洗涤此润湿的Eupergit两次，然后即可再次用于其它反应。酶活性仍有3.9U/g，这等于损失了7％的活性。实施例41.使用醛基修饰磁性二氧化硅颗粒并将柚皮苷酶固定在此颗粒上
在容量1L并配有旋进玻璃搅拌器、滴液漏斗和回流冷凝器的三颈烧瓶中，放入30g磁性二氧化硅颗粒(MagPrep，Merck，Darmstadt)在600mL水中的悬浮物。在搅拌下经30分钟滴加20mL氨基丙基三乙氧基硅烷(ABCR，Karlsruhe)和20ml异丙醇的混合物。然后将混合物加热至85℃并在此温度下搅拌1小时。冷却后，将悬浮物置于烧杯中，通过强永久磁铁使颗粒聚集在容器底部，然后将上清液轻轻倾出。使用软化水重复洗涤这些颗粒直到洗液的pH保持恒定。然后将这些颗粒重新悬浮在600ml水中，并加入几滴乙酸将pH值调节至约8；加入24ml 50％戊二醛浓溶液后，室温下搅拌悬浮物4小时，然后用软化水洗涤颗粒直到在洗液中不再能够检测到戊二醛(使用2，4-二硝基苯肼的硫酸溶液进行斑点反应)。
在容量1L的圆底烧瓶中将醛基衍生的颗粒重新悬浮在600mL 0.2M磷酸钾缓冲液(pH9)中。加入1g柚皮苷酶(Sigma，Deisenhofen)的100mL50mM氯化钠溶液后，使用旋进玻璃搅拌器室温搅拌混合物2天。然后借助永久磁铁分离颗粒并首先用0.2M氯化钠溶液然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)重复洗涤。通过Kurasawa法(Kurosawa，Ikeda，Egami，J.Biochem.73，31-37(1973)：角蝾螺(Turbo eornutus)肝脏和Aspergillusniger(黑曲霉)的α-L-鼠李糖苷酶)使用对硝基苯基-L-α-吡喃鼠李糖苷(Sigma，Deisenhofen)作为底物测定固定物的鼠李糖苷酶活性；其为162U/g。2.使用环氧环修饰磁性二氧化硅颗粒并在此颗粒上固定柚皮苷酶
在容量1L并配有旋进玻璃搅拌器、滴液漏斗和回流冷凝器的三颈烧瓶中，放入30g磁性二氧化硅颗粒(MagPrep，Merck，Darmstadt)在600mL50mM乙酸钠溶液中的悬浮物。搅拌下经30分钟滴加20mL(3-环氧丙氧丙基)三甲氧基硅烷(ABCR，Karlsruhe)和20ml异丙醇的混合物。然后将混合物加热至85℃并在此温度下搅拌1小时。冷却后，将悬浮物置于烧杯中，通过强永久磁铁使颗粒聚集在容器底部，然后将上清液轻轻倾出。使用软化水重复洗涤这些颗粒直到洗液的pH保持恒定。为了测定环氧环的量，用甲醇重复洗涤具有约0.5g该材料的样品，然后在干燥箱中约70℃将其干燥至恒重。通过Pribyl法(Pribyl，Fresenius Z.Anal.Chem.303，113-116(1980)：Bestimmung of Epoxydendgruppen in modifiziertenchromatographischen Sorbentien and Gelen)测量该环氧环，得到250μmol/g的值。
在容量1L的圆底烧瓶中将150ml 20％(w/v)环氧化物衍生的磁性颗粒的浓悬浮物与350mL 1M磷酸钾缓冲液(pH9.0)混合。加入1.5g柚皮苷酶(Sigma，Deisenhofen)的15mL 50mM氯化钠溶液后，使用旋进玻璃搅拌器40℃搅拌混合物16小时。然后借助永久磁铁分离颗粒，并首先用0.2M氯化钠溶液然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)重复洗涤。通过Kurasawa法使用对硝基苯基-L-α-吡喃鼠李糖苷(Sigma，Deisenhofen)作为底物测定固定物的鼠李糖苷酶活性；其为102U/g。3.使用羧基修饰磁性二氧化硅颗粒并在此颗粒上固定柚皮苷酶
在容量1L并配有旋进玻璃搅拌器、滴液漏斗和回流冷凝器的三颈烧瓶中，放入30g磁性二氧化硅颗粒(MagPrep，Merck，Darmstadt)在600mL水中的悬浮物。在搅拌下经30分钟滴加28mL 3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酐(ABCR，Karlsruhe)和28ml异丙醇的混合物，然后通过滴加10％氢氧化钠浓溶液将反应混合物的pH调节至9.0。然后将混合物加热至80℃并在此温度下搅拌2小时。在此操作过程中每隔一定时间控制该pH并在需要时通过加入碱进行校正。冷却后，将悬浮物置于烧杯中，通过强永久磁铁使颗粒聚集在容器底部，然后将上清液轻轻倾出。使用软化水洗涤这些颗粒三次，使用2M乙酸溶液洗涤一次、然后使用软化水重复洗涤直到洗液的pH保持恒定。
在容量1L的圆底烧瓶中将150ml 20％(w/v)羧基衍生的磁性颗粒的浓悬浮物与300mL 0.4M磷酸钾缓冲液(pH5.0)、和1.5g柚皮苷酶(Sigma，Deisenhofen)的150mL 50mM氯化钠溶液混合。加入8ml EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，Merck，Darmstadt)在水中的1％浓溶液后，室温搅拌此混合物20小时。然后借助永久磁铁分离颗粒并首先用0.2M氯化钠溶液然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)重复洗涤。通过Kurasawa法使用对硝基苯基-L-α-吡喃鼠李糖苷(Sigma，Deisenhofen)作为底物测定固定物的鼠李糖苷酶活性；其为71U/g。4.使用醛基修饰磁性云母颜料并在这些颗粒上固定桔皮苷酶
在容量1L并配有旋进玻璃搅拌器、滴液漏斗和回流冷凝器的三颈烧瓶中，放入30g磁性云母颜料(“Colorona Blackstar Green”，Merck，darmstadt)在300mL水中的悬浮物。在搅拌下经30分钟滴加20mL氨基丙基三乙氧基硅烷(ABCR，Karlsruhe)和20ml异丙醇的混合物。然后将混合物加热至852并在此温度下搅拌1小时。冷却后，将悬浮物置于烧杯中，通过强永久磁铁使颗粒聚集在容器底部，然后将上清液轻轻倾出。使用软化水重复洗涤这些颗粒直到洗液的pH保持恒定。然后将这些颗粒重新悬浮在300ml水中，并加入几滴乙酸将pH值调节至约8；加入25ml 50％戊二醛浓溶液后，室温下搅拌悬浮物4小时，然后用软化水洗涤颗粒直到在洗液中不再能够检测到戊二醛(使用2，4-二硝基苯肼的硫酸溶液进行斑点反应)。
在容量1L的圆底烧瓶中将30g醛基衍生的云母颜料“ColoronaBlackstar Green”重新悬浮在300mL 0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.5)中。加入1g桔皮苷酶(Amano)的20mL 0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.5)后，使用旋进玻璃搅拌器室温搅拌混合物3天。然后借助永久磁铁分离颗粒并首先用0.2M氯化钠溶液然后用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)重复洗涤。通过Kurasawa法使用对硝基苯基-L-α-吡喃鼠李糖苷(Sigma，Deisenhofen)作为底物测定固定物的鼠李糖苷酶活性；其为10U/g。5.在搅拌罐反应器中使用固定的柚皮苷酶将芸香苷转化为异栎精并使用永久磁铁分离磁性生物催化剂
在容量500mL的复壁搅拌反应器中，40℃一起搅拌400mL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)、20g固定在磁性二氧化硅颗粒上的活性102U/g的柚皮苷酶、和10g芸香苷(Merck，Darmstadt)；通过HPLC分析定期测量转化度。24小时后，将反应内容物泵入烧杯中并使用板式磁铁(Bakker，200mT)将催化剂收集在容器底部。立即在真空中借助泵滤出上清液，然后使用每次100mL的缓冲液洗涤这些磁性颗粒数次，以便清洗掉最后残余的粘性固体异栎精。过滤收集的异栎精，并用小量冰水洗涤数次，然后在干燥器中干燥。产量为6.5g。HPLC分析给出96％异栎精、2％栎精和2％芸香苷的组成。固定物的活性在转化后仍有92U/g。这等于损失了10％的活性。6.在搅拌罐反应器中使用固定的柚皮苷酶将芸香苷转化为异栎精并使用电磁分离器分离磁性生物催化剂(图1)
在容量500mL的复壁搅拌反应器中，40℃一起搅拌300mL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)、10g固定在磁性二氧化硅颗粒上的活性102U/g的柚皮苷酶、和5g芸香苷(Merck，Darmstadt)；通过HPLC分析连续测量转化度。24小时后，借助蠕动泵产生25mL/min的流速使反应器内容物通过电磁HGMS装置，借此方式将磁性颗粒完全分离到金属丝基体上(分离装置的技术数据：玻璃管内直径20mm、长200mm、容量65mL，SS合金金属丝束重量15g，4个串联的线圈，电流强度6A，Helmholtz场的磁场强度25mT)。激活磁场并两次将每次100mL量的柠檬酸盐缓冲液泵过柱子，以便洗涤磁性颗粒。过滤合并的产物悬浮物，并用冰水洗涤异栎精然后在干燥器中干燥。产量3.1g。HPLC分析给出97％异栎精、2％栎精和1％芸香苷的组成。
为了回收催化剂，使磁场失活并以100mL/min的流速将100mL柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)循环泵过此分离装置10分钟，其中改变流动方向数次。然后将催化剂悬浮物泵回搅拌罐中并再次使用每次100mL的柠檬酸盐缓冲液两次洗脱仍存在于沉淀器中的剩余量催化剂。转化后固定物的活性还有94U/g。这等于损失8％活性。7.在搅拌罐反应器中使用固定在云母颗粒上的桔皮苷酶将芸香苷转化为异栎精并使用板式磁铁分离磁性生物催化剂
在容量500mL的复壁搅拌反应器中，40℃一起搅拌400mL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)、30g固定在“Colorona Blackstar”上的活性10U/g的桔皮苷酶、和5g芸香苷(Merck，Darmstadt)；通过HPLC分析连续测量转化度。24小时后，将反应器内容物泵入烧杯中并使用板式磁铁(Bakker，200mT)将催化剂收集在容器底部。立即在真空中借助泵滤出上清液，然后使用每次100mL的缓冲液洗涤这些磁性颗粒数次，以便清洗掉最后残余的粘性固体异栎精。过滤收集的异栎精，并用小量冰水洗涤数次，然后在干燥器中干燥。产量为3.3g。HPLC分析给出96％异栎精和4％芸香苷的组成。固定物的活性在转化后仍有9.7U/g。这等于损失了3％的活性。8.在MSFB反应器中使用固定在磁性硅胶颗粒上的柚皮苷酶将芸香苷转化为异栎精
在收集瓶中40℃搅拌5g芸香苷、900mL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)和100mL乙酸甲酯的混合物，直到获得不含显著凝聚物的近均一悬浮物。该反应器装配了温度控制装置。加入乙酸甲酯以便增加室温下的溶解度和再溶解的速度，并防止形成栎精。同时，将6g固定在磁性二氧化硅颗粒上的活性162U/g的柚皮苷酶在60mL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中的悬浮物泵入磁场失活的MSFB反应器的管中。将磁场设定在20mT，然后首先借助设计用于精确计量的活塞泵以5mL/min流速向上引入新鲜的柠檬酸盐缓冲液，直到颗粒在此磁场中达到稳定状态。然后室温经3.5小时将芸香苷悬浮物泵过MSFB反应器。首先在旋转薄膜蒸发器中从产物混合物中除去乙酸甲酯，然后滤出产物，用冰水洗涤数次，然后在干燥器中干燥。产物产量2.9g；产物包含86％异栎精和14％芸香苷。