《嵌合的双链核酸.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《嵌合的双链核酸.pdf（78页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104126010A43申请公布日20141029CN104126010A21申请号201280062110X22申请日20121217201127548820111216JPC12N15/11200601C12N15/113200601A61K31/71320060171申请人国立大学法人东京医科齿科大学地址日本东京都申请人国立大学法人大阪大学72发明人横田隆德仁科一隆小比贺聪水泽英洋74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人胡志君黄革生54发明名称嵌合的双链核酸57摘要本发明公开了借助反义作用抑制靶基因表达的双链核酸复合物，和使用该双链核酸复合物的方法。一种用于。
2、减少细胞中转录产物水平的方法包括使组合物与细胞接触，所述组合物包含双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，并且III第一核酸链与转录产物杂交；和第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014061686PCT国际申请的申请数据PCT/JP2012/0831802012121787PCT国际申请的公布数据WO2013/089283EN20130。
3、62051INTCL权利要求书4页说明书36页序列表15页附图22页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书36页序列表15页附图22页10申请公布号CN104126010ACN104126010A1/4页21减少细胞中转录产物水平的方法，包括使组合物与细胞接触，所述组合物包含双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和任选地核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，并且III第一核酸链与转录产物杂交；和第二。
4、核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。2根据权利要求1所述的方法，其中第二核酸链包含IRNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或IIDNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或IIIPNA核苷酸。3权利要求1或权利要求2所述的方法，其中转录产物是编码蛋白质的MRNA转录产物。4权利要求1或权利要求2所述的方法，其中转录产物是不编码蛋白质的转录产物。5权利要求14中任一项所述的方法，其中第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数和第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是相同的。6权利要求14中任一项所述的方法，其中第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数和第二。
5、核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是不同的。7权利要求6所述的方法，其中第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数大于第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数。8权利要求17中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含范围为10至35个核苷酸的核苷酸总数。9权利要求18中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含位于RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸的5和/或3的一个或多个核苷酸类似物。10权利要求19中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含位于RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸5的一个或多个核苷酸类似物的5翼区和/或位于RNA酶H识别的至少4个。
6、连续核苷酸3的一个或多个核苷酸类似物的3翼区。11权利要求10所述的方法，其中第一核酸链包含5翼区和3翼区，并且其中5翼区包含至少2个核苷酸类似物和3翼区包含至少2个核苷酸类似物。12权利要求11所述的方法，其中5翼区和3翼区独立地包含2至10个核苷酸类似物。13权利要求12所述的方法，其中5翼区和3翼区独立地包含2至3个核苷酸类似物。14权利要求113中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含至少一个核苷酸，所述核苷酸包含2OCH3基团或2OCH2CH2OCH3MOE基团。15权利要求114中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含至少一个核苷酸类似物，所述核苷酸类似物是桥连核苷酸。16权利要求15。
7、所述的方法，其中第一核酸链包含独立地选自LNA、CETBNA、酰胺BNAAMNA和CMOEBNA的桥连核苷酸。17权利要求15所述的方法，其中第一核酸链包含桥连核苷酸，所述桥连核苷酸独权利要求书CN104126010A2/4页3立地选自其中2位置处的碳原子和4位置处的碳原子由4CH2PO2、4CH2PS2、4CH2POCO2、4CH2NNR3OCH2M2桥连的核糖核苷酸，其中P、M和N分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数，并且R3代表氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官能团或胞内或核内定位信号肽。18权利要求117。
8、中任一项所述的方法，其中第一核酸链中的至少一个核苷酸是硫代磷酸酯化的。19权利要求118中任一项所述的方法，其中第一核酸链中的至少一个核苷酸类似物是硫代磷酸酯化的。20权利要求119中任一项所述的方法，其中第一核酸链包括当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的420个连续核苷酸。21权利要求20所述的方法，其中当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的420个连续核苷酸的至少一个核苷酸是DNA核苷酸。22权利要求1021中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含5翼区和3翼区，并且其中I5翼区的核苷酸类似物是桥连核苷酸；II3翼区的核苷酸类似物是桥连核苷酸；并且III当第一核酸链与转录产。
9、物杂交时由RNA酶H识别的连续核苷酸是DNA核苷酸。23权利要求122中任一项所述的方法，其中第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数是12至25个核苷酸。24权利要求223中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含RNA核苷酸并任选地包含核苷酸类似物，以及任选地包含DNA核苷酸。25权利要求24所述的方法，其中第二核酸链包含当第二核酸链与第一核酸链复性时被RNA酶H切割的至少4个连续核苷酸。26权利要求25所述的方法，其中第二核酸链包含位于至少4个连续核苷酸的5和/或3的一个或多个硫代磷酸酯化核苷酸。27权利要求25或26所述的方法，其中第二核酸链包含位于至少4个连续核苷酸的5和/或3的一个或多个。
10、核苷酸类似物。28权利要求26或27所述的方法，其中第二核酸链包含位于至少4个连续核苷酸5的一个或多个核苷酸类似物的5翼区和/或位于至少4个连续核苷酸3的一个或多个核苷酸类似物的3翼区。29权利要求28所述的方法，其中第二核酸链包含5翼区和3翼区，并且其中5翼区包含至少2个核苷酸类似物，并且第一链的3翼区包含至少2个核苷酸类似物。30权利要求29所述的方法，其中5翼区和3翼区独立地包含2至10个核苷酸类似物。31权利要求30所述的方法，其中5翼区和3翼区独立地包含23个核苷酸类似物。32权利要求2431中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含至少一个RNA核苷酸，所述RNA核苷酸包含2OCH3基。
11、团或2OCH2CH2OCH3MOE基团。33权利要求2432中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含至少一个核苷酸，所述核苷酸是桥连核苷酸。权利要求书CN104126010A3/4页434权利要求33所述的方法，其中第二核酸链包含独立地选自LNA、CETBNA、酰胺BNAAMNA和CMOEBNA的桥连核苷酸。35权利要求33所述的方法，其中第二核酸链包含桥连核苷酸，所述桥连核苷酸独立地选自其中2位置处的碳原子和4位置处的碳原子由4CH2PO2、4CH2PS2、4CH2POCO2、4CH2NNR3OCH2M2桥连的核糖核苷酸，其中P、M和N分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数，并且R3。
12、代表氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官能团或胞内或核内定位信号肽。36权利要求2835中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含5翼区和3翼区，并且其中I5翼区的核苷酸类似物是桥连核苷酸；II3翼区的核苷酸类似物是桥连核苷酸；并且III当第二核酸链与第一核酸链复性时被RNA酶H切割的连续核苷酸是RNA核苷酸。37权利要求36所述的方法，其中第二核酸链的至少一个RNA核苷酸和/或至少一个核苷酸类似物是硫代磷酸酯化的。38权利要求223中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含PNA核苷酸。39权利要求2438中任一项所述的方法，其中第。
13、二核酸链还包含具有功能的功能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能。40根据权利要求1至4和6至33中任一项所述的方法，其中双链核酸复合物还包含与第二核酸链复性的第三核酸链。41根据权利要求40所述的方法，其中第三核酸链与第一核酸链相同。42根据权利要求40所述的方法，其中第三链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，II包含当第三核酸链与第二转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，III第三核酸链中核苷酸和任选地核苷酸类似物的总数是8至100，并且IV第三核酸链与第二转录产物杂交。43根据权利要求40所述的方法，其中第三核酸链包含PNA核苷酸。44根据权利要求4043中任。
14、一项所述的方法，其中第三核酸链还包含具有功能的功能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能。45根据权利要求39或44所述的方法，其中所述功能性部分是选自脂质、肽和蛋白质的分子。46根据权利要求45所述的方法，其中功能性部分与核酸链的3末端核苷酸或5末端核苷酸连接。47根据权利要求法45或46所述的方法，其中功能性部分是脂质。48根据权利要求47所述的方法，其中脂质选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。49根据权利要求47所述的方法，其中功能性部分是选自胆固醇、生育酚和生育三烯酚的脂质。50根据权利要求45或46所述的方法，其中功能分子是选自受体配体和抗体的肽或蛋白质。5。
15、1减少哺乳动物中基因表达水平的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的药物组权利要求书CN104126010A4/4页5合物的步骤，所述组合物包含A双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和任选地核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与所述基因的转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，并且III第一核酸链与转录产物杂交；和第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物；和B可药用载体。52权利要求48所述的方法，其中施用途径是经肠途径。53权利要求48所述的方法，其中施用途径是肠胃。
16、外途径。54权利要求5153中任一项所述的方法，其中剂量是0001MG/KG/日至50MG/KG/日的双链核酸复合物。55权利要求5154中任一项所述的方法，其中哺乳动物是人。56纯化的或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，III包含至少一个非天然核苷酸，并且IV第一核酸链与转录产物杂交；并且第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。57根据权利要求56所述的纯化或分离的双链核酸复合物，其中第二核酸。
17、链包含IRNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或IIDNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或IIIPNA核苷酸。58用于治疗哺乳动物的药物组合物，包含权利要求56或57所述的双链核酸复合物和可药用载体，其中转录产物是哺乳动物转录产物。59权利要求56或57所述的双链核酸复合物的用途，用于制备减少哺乳动物中基因表达的药物。60权利要求56或57所述的双链核酸复合物的用途，用于减少哺乳动物中基因的表达。权利要求书CN104126010A1/36页6嵌合的双链核酸技术领域0001本申请涉及具有借助反义作用抑制靶基因表达的活性的双链核酸，并且更具体地，涉及包含反义核酸和与所述反义核酸互补。
18、的核酸的双链核酸，所述反义核酸与靶基因的转录产物互补并含有包含4个或更多个连续碱基的区域。背景技术0002近年来，寡核苷酸已经成为正在开发的称作核酸药物的药物产品中的目的主题，并且特别地，从靶基因的高度选择性和低毒性的观点看，利用反义方法开发核酸药物正在活跃进行中。反义方法是通过引入与靶基因的MRNA有义链的部分序列互补的寡核苷酸反义寡核苷酸ASO至细胞中，选择性抑制靶基因编码的蛋白质表达的方法。0003如图1上半部分中所示，将包含RNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，ASO与靶基因的转录产物MRNA结合，并且形成部分的双链。已知这种双链发挥覆盖物的作用以防止核糖体翻译，并且因此抑制靶基因编码。
19、的蛋白质的表达。0004在另一方面，将包含DNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，形成部分的DNARNA异双链体。由于RNA酶H识别这种结构，靶基因的MRNA因而分解，抑制靶基因编码的蛋白质的表达。图1，下半部分。另外，还已经发现在许多情况下，与使用RNA时相比，基因表达抑制效应在使用DNA作为ASORNA酶H依赖性途径时更高。0005在利用寡核苷酸作为核酸药物的情况下，已经在考虑增强对靶RNA的结合亲和力、体内稳定性等时开发多种核酸类似物如锁核酸LNA注册商标、其他桥连的核酸等。0006如图2中所示，由于天然核酸RNA或DNA的糖部分具有含4个碳原子和1个氧原子的五元环，所以糖部分具有两种构象。
20、N型和S型。已知这些构象从一种形式转变成另一种形式，并且因而核酸的螺旋结构也采取不同形式A型和B型。由于充当前述ASO的靶的MRNA采取A型螺旋结构，糖部分主要处于N型，因此从增加对RNA的亲和力的观点看，ASO的糖部分采取N型是重要的。已经在这种概念下开发的产品是修饰的核酸，如LNA2O,4C亚甲基桥连的核酸2,4BNA。例如，在LNA中，由于2位置处的氧和4位置处的碳由亚甲基桥连，所以构象固定成N型，并且不存在构象之间的波动。因此，与采用常规天然核酸合成的寡核苷酸相比，通过掺入几个LNA单元所合成的寡核苷酸具有针对RNA的非常高的亲和力和非常高的序列特异性，并且还显示出优异的耐热性和核酸酶。
21、抗性见PTL1。由于其他人工核酸也具有这类特征，更多注意力投向与利用反义方法等有关的人工核酸见PTL1至7。0007另外，将寡核苷酸应用至药物时，重要的是相关寡核苷酸可以以高特异性和高效率递送至靶部位。此外，作为用于递送寡核苷酸的方法，已经开发了一种利用脂质如胆固醇和维生素E的方法NPL1和2、一种利用受体特异性肽如RVG9R的方法NPL3和一种利用对靶部位特异的抗体的方法NPL4。0008引文目录0009专利文献说明书CN104126010A2/36页70010PTL1JP10304889A0011PTL2WO2005/0215700012PTL3JP10195098A0013PTL4JP2。
22、002521310W0014PTL5WO2007/1433150015PTL6WO2008/0437530016PTL7WO2008/0296190017非专利文献0018NPL1KAZUTAKANISHINA等人,MOLECULARTHERAPY,第16卷,73474020080019NPL2JURGENSOUTSCHECK等人,NATURE,第432卷,17317820040020NPL3KAZUTAKANISHINA等人,MOLECULARTHERAPY,第16卷,73474020080021NPL4DANPEER等人,SCIENCE,第319卷,62763020080022发明概述00。
23、23技术问题0024在某些实施方案中，双链核酸复合物包含抑制靶基因表达或更广义地抑制RNA转录产物水平的反义核酸。本发明的又一个目的是双链核酸复合物以高特异性和高效率递送反义核酸链至靶部位。0025解决问题的方案0026出于研究怎样增强ASO稳定性、抑制靶基因体内表达的活性反义作用和在反义方法中递送ASO至靶部位的特异性和效率递送特性的目的，发明人制备了与脂质胆固醇直接结合的包含LNA和DNALNA/DNA缺口聚体的ASO，并且通过静脉内施用这种ASO至小鼠，发明人评价了递送特性和反义作用。作为结果，发现当胆固醇与ASO结合时，ASO至肝脏的递送特性增强，然而，反义作用丧失。0027因而，发明。
24、人进行了彻底研究，目的是开发在增加ASO递送特性的同时，具有高反义作用的核酸，并且作为结果，发明人在一个实施方案中构思了通过使LNA/DNA缺口聚体GAPMER与RNA链复性所产生的新双链核酸复合物，其中所述RNA链与缺口聚体互补，并且首次评价反义作用。作为结果，发现双链核酸的反义作用总体上好于单链LNA/DNA缺口聚体，并且取决于所用ASO的链长度，大大增强。发明人还产生了其中生育酚与包含RNA的互补链结合的双链核酸，将该双链核酸静脉内施用至小鼠，并评价其反义作用。作为结果，发现含有与生育酚结合的互补链的双链核酸具有非常高的反义作用。此外，发明人还发现通过与包含PNA肽核酸而非RNA的互补链。
25、复性产生的LNA/DNA缺口聚体的反义作用至少相似于或好于单链LNA/DNA缺口聚体，并且另外，PNA提供了使ASO与能指导递送ASO至特定位点的肽、蛋白质或抗体间接结合的方式。0028即，本申请涉及具有借助反义作用抑制靶基因表达的活性的双链核酸。0029在某些实施方案中，提供了以下内容。00301具有借助反义作用抑制靶基因表达的活性的双链核酸，该双链核酸包含以下项A和B的核酸0031A反义核酸，其与靶基因的转录产物互补并且含有包含4个或更多个连续碱基的DNA的区域，和说明书CN104126010A3/36页80032B与A的核酸互补的核酸。00332项1中所述的双链核酸，其中A的核酸还含有包。
26、含修饰核酸的区域，所述区域在包含4个或更多个连续碱基的DNA的区域的5末端侧和3末端侧的至少任一者上布置。00343项2中所述的双链核酸，其中A的核酸的包含修饰核酸的区域是这样的包含修饰核酸的区域，所述修饰核酸在包含4个或更多个连续碱基的DNA的区域的5末端侧和3末端侧上布置，并且修饰核酸是LNA。00354在项1至3的任一项中所述的双链核酸，其中B的核酸是RNA或PNA。00365在项1至3的任一项中所述的双链核酸，其中B的核酸是RNA，与A的核酸的包含修饰核酸的区域互补的区域被修饰，并且该修饰具有抑制由核糖核酸酶RNA酶所致分解的作用。00376在项5中所述的双链核酸，其中修饰是2O甲基化。
27、和/或硫代磷酸酯化。00387在项1至6的任一项中所述的双链核酸，其中功能性部分与B的核酸结合。00398在项1至7的任一项中所述的双链核酸，其中A和B的核酸的链长度是相同的。00409在项1至7的任一项中所述的双链核酸，其中A和B的核酸的链长度是不同的。004110在项9中所述的双链核酸，还包括以下项C的核酸0042C与A和B的核酸之间具有较长链长度的核酸中相对于另一个核酸突出的区域互补的核酸。004311在项10中所述的双链核酸，其中C的核酸是PNA。004412在项10或11中所述的双链核酸，其中功能性部分与C的核酸结合。004513在项7或12中所述的双链核酸，其中功能性部分是具有递送。
28、双链核酸至靶部位的活性的分子。004614借助反义作用抑制靶基因表达的组合物，所述组合物含有在项1至13的任一项中所述的双链核酸作为有效成分。004715一种减少细胞中转录产物水平的方法，包括使组合物与细胞接触，所述组合物包含0048A双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中0049第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和任选地核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，并且III第一核酸链与转录产物杂交；和0050第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。005116一种。
29、减少哺乳动物中基因表达水平的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的药物组合物的步骤，所述组合物包含0052A双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中说明书CN104126010A4/36页90053第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和任选地核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与所述基因的转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，并且III第一核酸链与转录产物杂交；和0054第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物；和B可药用载体。005517纯化的或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其。
30、中0056第一核酸链I包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数是8至100，II包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，III包含至少一个非天然核苷酸，并且III第一核酸链与转录产物杂交；并且0057第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。005818用于治疗哺乳动物的药物组合物，包含项17的双链核酸复合物和可药用载体，其中转录产物是哺乳动物转录产物。0059在本发明的其他实施方案中，提供以下项。0060纯化的或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中0061第一核酸链包含DNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，其。
31、中包含一个或多个抗核酸酶的核苷酸的5翼区位于5末端处和/或包含一个或多个抗核酸酶的核苷酸的3翼区位于3末端处，第一核酸链包含至少4个连续DNA核苷酸，并且第一核酸链中DNA核苷酸和核苷酸类似物的总数是10至100个核苷酸；0062第一核酸链还包含与转录产物的序列的一部分互补的至少10个连续核苷酸的序列；并且0063第二核酸链包含0064IRNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或0065IIDNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或0066IIIPNA核苷酸。0067其中包含一个或多个抗核酸酶的核苷酸的5翼区位于5末端处和/或包含一个或多个抗核酸酶的核苷酸的3翼区位于3末端处，并且其。
32、中第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是10至100个核苷酸。0068项的双链核酸复合物，其中转录产物是编码蛋白质的转录产物。0069项的双链核酸复合物，其中转录产物是不编码蛋白质的转录产物。0070项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链和第二核酸链中的核苷酸的数目是相同的。0071项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链和第二核酸链中的核苷酸的数目是不同的。0072项的双链核酸复合物，其中第二核酸链中核苷酸的数目大于第一核酸链中核苷酸的数目。0073项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链包含范围从10至35个核苷酸的核苷酸总数。说明书CN1041。
33、26010A5/36页100074项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链的核苷酸均是抗核酸酶的核苷酸。0075项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链的5翼区包含一个或多个核苷酸类似物和/或第一核酸链的3翼区包含位于3末端处的一个或多个核苷酸类似物。0076项中任一项的双链核酸复合物，其中第一链包含在5末端的至少2个连续核苷酸类似物的5翼区和在3末端的至少2个连续核苷酸类似物的3翼区。0077项的双链核酸复合物，其中5翼区和3翼区独立地由2至10个核苷酸类似物组成。0078项11的双链核酸复合物，其中5翼区和3翼区独立地由23个核苷酸类似物组成。0079项中任一项的双链核酸复合物，其中第。
34、一核酸链包含至少一个核苷酸类似物，所述核苷酸类似物是桥连核苷酸。0080项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链中所含有的核苷酸类似物是桥连核苷酸。0081项的双链核酸复合物，其中第一核酸链的桥连核苷酸独立地选自LNA、CETBNA、酰胺BNAAMNA和CMOEBNA。0082项的双链核酸复合物，其中第二核酸链的桥连核苷酸选自其中2位置处的碳原子和4位置处的碳原子由4CH2PO2、4CH2PS2、4CH2POCO2、4CH2NNR3OCH2M2桥连的核糖核苷酸，其中P、M和N分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数，并且R3代表氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、。
35、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官能团或胞内或核内定位信号肽。0083项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链中的DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。0084项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链中所含有的核苷酸类似物是硫代磷酸酯化的。0085项中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链包含420个连续DNA核苷酸的区段。0086项中任一项的双链核酸复合物，其中第一链包含I在5末端的至少2个连续核苷酸类似物的5翼区，II在3末端的至少2个连续核苷酸类似物的3翼区，和III至少4个连续DNA核苷酸。0087项中任一项的双链核酸复合物，其中第一链包含I在5末端的至少2个连续核苷酸类似物。
36、的5翼区，II在3末端的至少2个连续核苷酸类似物的3翼区，其中5翼区和3翼区中的所述核苷酸类似物是桥连核苷酸；和III至少4个连续DNA核苷酸；其中所述桥连核苷酸和所述DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。0088项任一项的双链核酸，其中第一核酸链具有1225个核苷酸长度。0089项中任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含RNA核苷酸和/或核苷酸类似物，和任选地DNA核苷酸。0090项的双链核酸复合物，其中第二核酸链的5翼区包含至少一个核苷酸说明书CN104126010A106/36页11类似物，第二核酸链的3翼区包含至少一个核苷酸类似物，并且第二核酸链包含至少4个连续RNA核苷酸。0091项的双。
37、链核酸复合物，其中第二核酸链的5翼区包含至少一个硫代磷酸酯化核苷酸，第二核酸链的3翼区包含至少一个硫代磷酸酯化核苷酸，并且第二核酸链包含至少4个连续RNA核苷酸。0092项或的双链核酸复合物，其中第二核酸链的5翼区和3翼区的全部核苷酸均是硫代磷酸酯化的。0093项任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链的抗核酸酶的核苷酸独立地选自桥连核苷酸和2O甲基RNA。0094项的双链核酸复合物，其中第二核酸链的桥连核苷酸独立地选自LNA、CETBNA、酰胺BNAAMNA和CMOEBNA。0095项的双链核酸复合物，其中第二核酸链的桥连核苷酸选自其中2位置处的碳原子和4位置处的碳原子由4CH2PO2、4CH。
38、2PS2、4CH2POCO2、4CH2NNR3OCH2M2桥连的核糖核苷酸，其中P、M和N分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数，并且R3代表氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官能团或胞内或核内定位信号肽。0096项的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含括I在5末端的至少2个硫代磷酸酯化、2O甲基化的RNA核苷酸，II在3末端的至少2个硫代磷酸酯化、2O甲基化的RNA核苷酸，和III分别任选地硫代磷酸酯化的至少4个连续天然RNA核苷酸。0097项的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含括I在5末端的至少2个硫代磷酸酯化、桥。
39、连的RNA核苷酸，II在3末端的至少2个硫代磷酸酯化、桥连的RNA核苷酸，和III分别任选地硫代磷酸酯化的至少4个连续天然RNA核苷酸。0098项任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含PNA核苷酸。0099项任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链还包含具有功能的功能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能。0100根据项至和至中任一项的双链核酸复合物，其中双链核酸复合物还包含与第二核酸链复性的第三核酸链。0101根据项的双链核酸，其中第三核酸链包含DNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且包含至少4个连续DNA核苷酸，其中核苷酸的总数是10至100个核苷酸，所述第三核酸链还包括与转。
40、录产物的序列的一部分互补的至少10个连续核苷酸的序列。0102根据项的双链核酸复合物，其中第三链包含I在5末端的至少2个连续核苷酸类似物的5翼区，II在3末端的至少2个连续核苷酸类似物的3翼区，其中5翼区和3翼区中的所述核苷酸类似物是桥连核苷酸；和III至少4个连续DNA核苷酸；其中所述桥连核苷酸和所述DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。0103根据项的双链核酸，其中第三核酸链包含PNA核苷酸。0104项任一项的双链核酸复合物，其中第三核酸链还包含具有功能的功能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能。0105根据项33或38的双链核酸复合物，其中所述功能性部分是选自脂质、肽和蛋说明书C。
41、N104126010A117/36页12白质的分子。0106根据项的双链核酸复合物，其中功能性部分与3末端核苷酸或5末端核苷酸连接。0107根据项或的双链核酸复合物，其中功能性部分是脂质。0108根据项的双链核酸复合物，其中功能性部分是选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯的脂质。0109根据项的双链核酸复合物，其中功能性部分是选自胆固醇、生育酚和生育三烯酚的脂质。0110根据项或的双链核酸复合物，其中功能分子是选自受体配体和抗体的肽或蛋白质。0111药物组合物，包含可药用载体和项至任一项的双链核酸复合物。0112项至任一项的双链核酸复合物的用途，用于制备减少哺乳动物中基因表达的药物。。
42、0113项至任一项的双链核酸复合物的用途，用于减少哺乳动物中基因的表达。0114一种减少哺乳动物中基因表达的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的药物组合物的步骤，所述组合物包含0115纯化或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中0116第一核酸链包含DNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，和包括至少4个连续DNA核苷酸，其中第一核酸链中DNA核苷酸和核苷酸类似物的总数是10至100个核苷酸；0117第一核酸链还包含与哺乳动物转录产物的序列的一部分互补的至少10个连续核苷酸的序列；并且0118第二核酸链包含0119IRNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或01。
43、20IIDNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或0121IIIPNA核苷酸。0122其中第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是10至100个核苷酸；和0123可药用载体。0124项的方法，其中施用途径是肠内途径。0125项的方法，其中施用途径是肠胃外途径。0126项任一项的方法，其中剂量是0001MG/KG/日至50MG/KG/日的双链核酸复合物。0127项任一项的方法，其中哺乳动物是人。0128本发明的有益效果0129根据某些实施方案，反义核酸可以在双链复合物中递送并且可以通过反义核酸选择性地和非常有效地抑制靶基因的表达或转录产物的水平。在一些实施方案中，双链复。
44、合物可以通过缔合递送部分与该复合物而以高特异性和高效率递送至靶部位。0130附图简述说明书CN104126010A128/36页130131图1是说明某些反义方法的一般机制的简图。如本图中所示，将与靶基因的MRNA的部分序列互补的寡核苷酸反义寡核苷酸ASO该图中的“DNA”引入细胞时，选择性地抑制由靶基因编码的蛋白质的表达。在划虚线的框中，显示其中RNA酶H在MRNA与ASO杂交的位置处切割该MRNA的降解机制。作为RNA酶H切割的结果，该MRNA通常不翻译，从而不产生功能性基因表达产物。0132图2是说明RNA、DNA和LNA核苷酸的结构的示意图。0133图3AB是说明双链核酸复合物的合适实。
45、施方案的例子的示意图。5LNADNALNA3链是与靶向的转录产物互补的反义核酸。在本图中，“S”表示具有硫代磷酸酯键的核酸；“O”表示具有天然硫代磷酸酯键的核酸；并且“M/S”表示已经硫代磷酸酯化和2O甲基化的RNA。另外，“X”表示功能性部分，并且可以独立地代表脂质例如，胆固醇或生育酚、糖等或蛋白质、肽例如，抗体等。0134图4AB是说明双链核酸复合物的合适实施方案的例子的示意图，所述双链核酸复合物含有三条链具有不同链长度的第一ASO核酸链和第二互补性核酸链以及包含与功能分子如肽、抗体等结合的PNA的第三核酸链。本图中的符号具有与图3中定义的那些符号相同的意思。0135图5AB是说明双链核酸。
46、复合物的合适实施方案的例子的示意图，所述双链核酸复合物具备至少具有不同链长度的第一ASO核酸链和第二互补性核酸链。在这些实施方案中，A核酸还包含与第二核酸链互补的第三核酸链或B第二核酸链还包含通过发夹接头与第二核酸链连接的硫代磷酸酯化DNA的自身互补区。另外，在本图中，“M”表示2O甲基化RNA。其他符号具有与图3中定义的那些符号相同的意思。0136图6A是说明具有结构5LNADNALNA3的核酸的示意图，所述核酸在5末端用荧光染料CY3标记。图6B是说明具有结构5LNADNALNA3的核酸的示意图，所述核酸在5末端用荧光染料CY3标记并且在3末端用胆固醇“CHOL”标记。0137“S”表示硫。
47、代磷酸酯化核酸。0138图7是荧光显微照片，其说明观察已经施用荧光CY3标记的“LNA”根据图6A或荧光CY3标记CHOLLNA”根据图6B的小鼠的肝脏结果。0139图8是说明通过以下方式获得的结果的图向小鼠施用“12聚CY3CHOLLNAAPOB1”根据图6B、“20聚CY3CHOLLNAAPOB1”或“29聚CY3CHOLLNAAPOB1”或“12聚CY3LNAAPOB1”根据图6A，它们均具有与APOB1基因的碱基序列互补的序列，并且通过定量PCR分析这些小鼠的肝脏中APOB1基因的表达量。0140图9是说明双链核酸的某些实施方案的示意图。符号具有与图36中定义的那些符号相同的意思。01。
48、41图10是说明用来评价根据一个实施方案的双链核酸复合物的反义作用的反义链ASO和其互补链CRNAO、CRNAG和CRNAM/S的示意图。符号具有与图36和图9中定义的那些符号相同的意思。0142图11显示说明结果的照片，所述结果通过采用电泳法分析存在或不存在图10中所示的反义链和其互补链的复性来获得。小图A表示在UV照射下拍照的结果，并且小图B显示凝胶的照片。0143图12是在UV照射下拍摄的照片，所述照片说明通过使图10中所示的反义链及其说明书CN104126010A139/36页14互补链复性、用RNA酶H处理所述链并通过电泳法分析反应产物所获得的结果。0144图13是说明结果的图，所述。
49、结果通过将图10中所示的反义链或由该反义链和图10中所示的互补链之一组成的双链核酸复合物以04NM或10NM的浓度引入细胞中获得。通过定量PCR分析细胞中其转录产物由反义链靶向的APOB1基因的表达量。0145图14是说明结果的图，所述结果通过分析其中引入图10中所示的反义链或由该反义链和图10中所示的互补链之一组成的双链核酸复合物的细胞中APOB1基因的表达量获得，所述表达量针对仅引入该反义链的细胞中获得的表达量归一化。0146图15是说明用来评价双链核酸复合物的反义作用的反义链、互补链CRNAG和具有生育酚功能性部分的互补链TOCCRNAG的示意图。“TOC”表示生育酚。其他符号具有与图36、图9和图10中定义的那些符号相同的意思。0147图16是说明结果的图，所述结果通过以下方式获得向小鼠施用图15中所示的反义链或由反义链和图15中所示的互补链之一组成的双链核酸并且分析小鼠中其转录产物由反义链靶向的APOB1基因的表达量。0148图17是说明结果的图，所述结果通过评价双。