靶向人工基因导入 发明背景1.发明领域
本发明提供了用于针对靶细胞的细胞特异性基因导入的改良载体。根据本发明，所述载体包括一个重组核心和一个包绕该核心的人工重建表面，所述重组核心含有将被导入的遗传物质。所述表面使载体的定位和细胞融合都更加容易，同时还为载体提供了免疫保护功能。本发明还公开了制备这些载体、以及应用这些载体转染真核细胞的方法。2.相关技术描述
基因治疗得到广泛关注的原因是它有潜力为多种人类疾病提供有效治疗，这些疾病包括少见的遗传性缺陷以及常见病，如肿瘤、艾滋病、高血压、动脉硬化和糖尿病。迄今为止，充分发挥基因治疗巨大潜力的障碍是缺乏高效的载体系统体内或活体外将基因构建物导入细胞。
对于传统药物的靶向导入，基因治疗的一个目标是在基因导入的局部发挥最大疗效，同时使潜在的系统性副作用最小化。为了达到这个目标，理想的基因导入载体应该具有几个特征。首先，载体应该能够到达有机体内的靶位点，优选能够识别特异性细胞类型。这需要载体具有较低的免疫原性，并具有较好的定位特征。其次，载体应该能够跨越宿主细胞的膜屏障，将其治疗性基因物质导入细胞内。在绝大多数情况下，现有载体系统足够大，可以调节所需基因构建物的导入。第三，一旦进入细胞，载体必须能够卸载其基因负荷，并允许有效基因表达。表达优选是细胞特异性的，并在整体水平没有害处。在绝大多数申请中，载体不应具有自主复制其自身DNA的能力。第四，在需要时，载体应该在较长时期内提供可以控制的持续基因表达。第五，载体应该可以大规模商业生产，并以药用、浓缩形式流通。
目前可以获得地用于基因治疗的载体系统中，没有一种满足上述所有特征。因此，基因治疗的进展在很大程度上有赖于新型改良基因载体系统的开发。
目前，体内治疗性基因导入最常用的方法是病毒导入系统和阳离子聚合物或基于脂质的系统。在基于病毒的系统中，在操作性用于导入治疗性基因的遗传修饰病毒中，保留病毒渗透细胞的天然能力。在聚合物或基于脂质的系统中，应用一种或多种阳离子聚合物和/或阳离子脂质浓缩治疗性DNA，然后利用携带副电荷的细胞和携带正电荷的基因导入颗粒之间的吸引力，进行细胞导入。在当前大多数申请中，还没有实现特异性细胞类型的定向。
病毒载体作为一类，具有几个显著劣势，如不能有效逃逸宿主免疫系统的攻击，局限于能被感染的细胞类型，难以制备高滴度载体，包装大型DNA或RNA分子的能力有限，并可能整合进入宿主基因组，这有利于稳定表达，但可能在基因组功能位点产生有限的不欲插入，虽然机会较小。应用装载到其他物质，如聚合物或脂质中的核酸进行基因转移具有体外转染广谱宿主细胞的能力，但在体内导入过程中仍然面临很多问题，如不能逃逸免疫系统，缺乏细胞特异性，由于缺乏进入机制使其进入细胞的效率很低，一旦进入细胞，载体的卸载效率也很低。
联合应用病毒和非病毒元件可以增加基因转移到细胞的效率。例如，Fasbender et al(J.Biol.Chem.272：6479-6489(1997))指出，为了增强装载DNA的导入效率，可以将腺病毒溶酶体降解逃逸功能与人工包装的DNA制剂相结合。另一个联合应用病毒与非病毒元件的示例是应用包括腺相关病毒(AAV)反转末端重复(ITR)序列的质粒与阳离子脂质体，基因转移后，白细胞介素-2(IL-2)的基因表达水平比没有ITRs的质粒高3-10倍。Viewet et al.，Cancer Research 55：2366-2372(1995))。在另一个实施例中，应用腺病毒衣壳蛋白或腺病毒纤维蛋白与脂质体联合，使报道基因的转染效率提高。Hong et al.，Chinese Medical J.108：332-337(1995)。
尽管最近在这些方面有了发展，但现存的靶基因导入方法中没有一种同时满足以下条件，免疫原性低，载体稳定性高，靶序列多功能性充分，以及基因表达效率高。因此，本发明的一个目标是克服本领域现存的这些难点，提供靶基因导入和表达的多功能载体。
发明简述
因此，本发明的一个目标是提供一种改良的非天然基因治疗载体，用于将核酸细胞特异性导入到靶细胞中。
本发明的另一个目标是通过给患者应用治疗有效剂量的所述载体，提供治疗患者疾病的方法。
为达成这些以及其他目标，根据本发明的一个方面，提供了非天然基因治疗载体，该载体包括一个重组核心和一个非天然表面功能等分，所述核心包括一个核酸分子，所述载体的至少一个表达产物是治疗性核酸、肽或蛋白，所述表面功能等分包括至少一个功能元件，该功能元件选自免疫保护元件、靶元件和细胞进入元件，并且所述载体能够与靶细胞特异性结合，并能将核心导入靶细胞。
根据本发明的一个实施方案，核心还包括至少一个病毒衣壳蛋白。在另一个实施方案中，表面功能等分包括一个免疫保护元件。在另一个实施方案中，表面功能等分包括一个靶元件。在另一个实施方案中，表面功能等分包括一个细胞进入元件。在另一个实施方案中，表面功能等分包括一个免疫保护元件、靶元件和细胞进入元件。
根据本发明的一个方面，免疫保护元件可以是合成聚合物等分。该合成聚合物组分可以包括聚(乙二醇)。该合成聚合物组分还可以包括谷氨酸与亮氨酸的共聚物。
根据本发明的另一个方面，靶等分与受体结合，该受体在病态细胞中的表达较正常细胞高。所述靶等分可以是细胞表面受体的肽配体或拟肽配体。
根据本发明的另一个方面，细胞进入元件是膜去稳定等分。该膜去稳定等分可以包括一个两亲性的α螺旋。该两亲性α螺旋可以来自病毒env蛋白的C末端功能区。在一个特定实施方案中，该C末端功能区是Moloney白血病病毒env蛋白的C末端功能区。该C末端功能区可以包括Moloney白血病病毒env蛋白的598-616氨基酸。在另一个实施方案中，膜去稳定等分包括一个谷氨酸与亮氨酸的共聚物。
在以下详细描述中可以清晰了解本发明的其他目标、特征和优势。但是，应该理解，详细描述和特定实施例虽然指示了本发明优选实施例，但是仅以一种举例说明的方式给出，因为对于本领域技术人员来说，基于该详细描述，可以在本发明主旨和范围内，轻易进行多种变化和改良。
附图简述
图1是TAGD颗粒表面的示意图，该表面包括一个免疫保护元件(PEG)，成融元件(膜去稳定肽)和细胞结合元件(靶肽)。
图2显示了两种将配体整合到表面以产生TAGD颗粒的不同方法。
图3显示了将病毒颗粒与含有DSPE-PEG-若丹明的微胶粒孵育后，与病毒颗粒相关的DSPE-PEG-若丹明(红色荧光)。
图4显示了能够与人类黑色素瘤D10细胞结合的化学修饰病毒MoMuLV，而未经修饰病毒无法与该细胞结合。所述修饰病毒包括一个含有α-MSH拟肽配体的多功能、多价接头。
优选实施方案详述
本发明为基因治疗提供了新型改良组合物和方法。特别是提供了靶向人工基因导入(”TAGD”)载体，包括包绕重组病毒颗粒(核壳体)或重组核心的多功能人工表面等分。
该功能表面包括的分子元件使该载体能够逃逸宿主免疫系统，识别特定靶细胞并与之结合，并可与靶细胞有效融合，将核心基因复合体编码的转基因导入靶细胞中。该表面分子元件可以包括，例如，多个肽分子和免疫保护元件。本发明还提供了应用新型组合物和方法治疗遗传性疾病的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了多种载体，其中重组病毒的现存脂质包膜等分经过修饰，来增强或提供病毒颗粒的所需特征。例如，病毒表面可以操作性增加免疫保护元件，例如聚合物基团，如聚(乙二醇)(PEG)，该元件可以减弱病毒颗粒的免疫原性，并增加载体在血循环中的稳定性。该表面还可通过添加靶配体来修饰，增强病毒的细胞特异性。例如，应用下面将详细描述的方法，对表面进行工程修饰，使之包括一个配体分子，该配体可以与靶细胞表面的所选受体特异性相互作用。
在另一个实施例中，表面经修饰，包括能够增强载体细胞进入特征的元件。特别是可以应用成融肽、蛋白或聚合物，来增强载体进入靶细胞的能力。成融等分促进载体与靶细胞细胞膜的融合，使病毒核心进入细胞质更加容易。成融等分可以是天然的融合基因，如病毒成融肽，也可以是工程(非天然)等分，如含有膜活性两亲性α螺旋或其他构型特征的肽，这些肽可以使膜去稳定。此外，成融等分还可以是一种使膜去稳定的聚合物。
在每一个实施方案中，对基因导入颗粒现存表面的修饰可以是非共价修饰，其中通过化学结合修饰包括功能等分的脂质被整合到含有颗粒的核心表面上。该整合过程可以通过，例如微胶粒的形成来完成，所述微胶粒包括所需修饰等分，并且可以应用本领域熟知的方法，使微胶粒自发地与颗粒表面融合。非共价修饰还可通过静电和/或疏水(van derWaals)作用，将功能组分吸附到颗粒表面上。
此外，修饰还可以是对基因导入颗粒的表面组分进行共价修饰。因此，例如，对于有包膜的病毒，病毒表面的膜脂质可以与化学激活的接头进行连接，随后可以共价附加修饰基团。膜糖蛋白上的糖基可以应用本领域众所周知的方法进行化学氧化，产生反应性醛基，该基团允许应用，例如，含有游离氨基的聚合物质或肽进行共价修饰。其他共价修饰膜组分的方法是本领域众所周知的。
在另一个实施例中，现存病毒表面可以通过与活化的化合物反应，来对脂质和/或蛋白组分进行化学修饰。活化的接头化合物包括但不限于高反应性化学基团的结合，例如修饰氨基的硫酰卤化物和/或多种活性羧酸酯；修饰碳水化合物的酰肼；修饰巯基的马来酰亚胺基或反应性烷基卤化物；以及本领域熟知的光敏性基团。经验丰富的技术人员应该理解，应用其他化学活性基团也属于本发明范畴。
此外，基因导入颗粒表面的功能基团还可应用本领域众所周知的方法进行化学修饰，以产生反应性和/或化学选择性基团，这些基团允许应用，例如含有游离氨基的聚合物质或肽进行共价修饰。一个特定实施例就是应用2-iminothiolane(Traut’s试剂)对病毒表面进行修饰，该试剂将病毒表面易接近的氨基转变为巯基。通过应用结合的巯基选择性方法，可以增强修饰的选择性。应用Traut’s试剂修饰病毒表面还提供了一种非常方便的评估多种病毒化学修饰最佳有效水平的手段。如果化学修饰水平太低，病毒表面特征就不会按预期发生变化，而修饰水平太高，则可能使病毒没有活性。本发明的发明人员发现，即使是非常不稳定的Moloney白血病病毒，也可以在不显著功能性丧失病毒滴度的情况下，在其表面携带高负荷的化学物质。化学修饰后检测病毒滴度的方法是本领域熟知的。
在另一个实施方案中，欲引入载体的功能基团，如PEG或靶肽或成融肽，首先与一个激活的接头结合。该接头优选拥有疏水位点，可以更好地与基因导入颗粒的表面亲和。例如，可以应用谷氨酸与亮氨酸的共聚物(将在下面给予更加详尽的描述)。接头还可以携带正电荷，是其能够与细胞表面更好地亲和。可以保留(或重新创建)部分活性基团，用于将接头共价附加于颗粒表面上。例如，该接头可以在不将脆弱的病毒暴露于过度化学处理的情况下，以多种方式修饰病毒表面。图1是TAGD颗粒表面的示意图，该表面包括一个免疫保护元件(PEG)，成融元件(膜去稳定肽)和细胞结合元件(靶肽)。图2显示了两种将配体整合到病毒表面的不同方法。
在另一个实施方案中，提供的载体包括一个位于表面内的重组核心，该表面是重新制备的。该实施方案适用于病毒核心颗粒，无论该颗粒是否包括现存的膜。因此，例如，一个缺乏外膜层的重组病毒颗粒可以装载到人工生成的脂质膜中。含有外膜层的重组病毒颗粒可以通过下述方式进行修饰，如(i)化学方法，(ii)装载到新的膜中，或(iii)置换现有膜，这样，重组病毒颗粒就包括重新合成的表面元件。因此，所得颗粒的表面可以工程修饰，包括如上所述的免疫保护剂，成融剂和细胞特异性增强剂。此外，该膜还可以包括增强载体在宿主循环中稳定性的组分，进而增加载体到达预期靶目标的机会，并为载体长时程发挥作用提供机会。
病毒核心
载体的病毒核心等分可以是适用于基因治疗的任何重组病毒核心。应用本领域众所周知的方法，可以制备大量适用的病毒核心，这些病毒核心可以用作TAGD载体的内部组分。用于基因治疗的病毒示例见Jain，“Textbook of Gene Therapy”，Chapter 4，pp.35-66(Hogrefe & Huber，1998)。适宜的病毒核心包括重组病毒，例如复制缺陷性慢病毒，如HIV，或其他逆转录病毒，例如鼠白血病病毒(MLV)如Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)或Friend MLV，腺病毒，腺相关病毒(AVV)，I型单纯疱疹病毒(HSV-1)，牛痘病毒，EB病毒，狂犬病和假狂犬病病毒，Sindbis病毒，SV40，以及巨细胞病毒，流感病毒，杆状病毒，Semliki森林病毒(SFV)，以及疱疹性口炎病毒(VSV)等。如果需要，这些病毒可以工程修饰，使之缺乏功能性env基因。通过重组方法去除env基因可以降低病毒的免疫原性，并可在细胞培养过程中增加病毒颗粒的生产水平。除去env基因的病毒缺乏与靶细胞结合并融合的天然能力。因此，这些能力必须由TAGD载体提供。
制备每一种含有适用于基因治疗的外源性基因的病毒核心的方法，以及为增加安全性，去除或取代天然病毒基因组中较大片段的方法，都是本领域众所周知的。见，例如Jain，supra，Anderson，Nature，392(6679Suppl)：25-30(1998)；Verma et al.，Nature，389：239-42(1997)；WO91/19798；WO 97/12622；WO 98/12314；以及美国专利号5,665,577和5,686,279。还见，Fields et al.，“Virology”(Lippincott-Raven，1996)。
经验丰富的技术人员应该认识到，本文描述的方法和组合物还可能适用于将来应用病毒核心类似物(核酸)研发核心。
免疫保护元件
在本发明上下文中，免疫保护元件是存在于载体表面并进而降低载体免疫原性的分子或分子集合。也就是说，当载体用于患者时，该元件可以降低载体与患者血清组分的相互作用，因此可以避免免疫系统的激活，降低载体在患者中的体内清除率。
免疫保护策略的示例包括降低药物导入颗粒的电荷和/或其分子量，以及通过糖基化降低颗粒的亲水性。最常应用的方法是在颗粒的表面附加“免疫诱导”元件，降低血清中调理素对颗粒的识别，进而延迟或避免免疫系统的完全激活。将诱导聚合物附加到药物导入载体上的一种方法是通过聚合物与脂质的结合。最常用于此目的的聚合物是聚(乙二醇)(PEG)(Papahadjopoulos et al.，Proc Natl Acad Sci USA 15：11460-4(1991))。用于同一目的的其他元件是：硅酸GM1聚二醇(Schauer，TIBSSept.1985：357，Yamanauchi et al.，J.Controlled Release 113：141(1995))；聚唑啉-DSPE(二硬脂酰磷脂酰氨基乙醇)衍生物(Zalipsky et al.，J PharmSci.85：133-7(1996))，基于聚合物的“stealth”方法(Torchilin et al.，JPharm Sci.84：1049(1995))，磷脂酰聚二醇(Maruyama et al.，BiochimBiophys Acta.1234：74-80(1995))，fleximer聚合物(Papisov.Adv.DrugDelivery Review 32，119-138(1998)；Torchilin J.Microencapsulation 15；1-19(1998))。其他免疫保护元件包括但不限于聚谷氨酸，聚乳酸，聚羟基乙酸，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲丙烯酰胺，聚乙基唑啉，聚甲基唑啉，以及聚乙烯乙醇。如上所述，与PEG相似，如果必要，每种亲水聚合物都可通过反应性化学基团与载体共价结合。本发明还提供了一种基于谷氨酸和亮氨酸共聚物的新型结合接头，可用来在颗粒表面引入所需功能，并具有免疫保护功能。本领域经验丰富的技术人员应该认识到，谷氨酸含有一个亲水的羧基侧链，而亮氨酸则含有一个疏水侧链。每种组分都可应用具有相同功能特征的其他组分取代。因此，谷氨酸可被，例如天门冬氨酸取代，亮氨酸可被，例如丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和其他疏水氨基酸取代。可以应用天然氨基酸，也可应用非天然氨基酸。此外，疏水功能可以谷氨酸酯或氨基衍生物的形式引入。应该指出，随机共聚物和/或阻断共聚物可用于类似目的。
当PEG用作免疫保护元件时，优选PEG分子量大约为1,000-5,000道尔顿。优选地，分子量大约为2,000道尔顿的PEG可以用来获得免疫保护。为了将含有反应性功能基团的PEG链定位于含有药物导入载体的膜表面，PEG可以与磷脂结合，例如二硬脂酰磷脂酰氨基乙醇(DSPE)。技术人员应该清楚，应用其他脂质也属于本发明范畴。含有可以进一步修饰的PEG的适宜DSPE-PEG分子是本领域众所周知的，也可从，例如Shearwater Polymers(Huntsville，AL)处购买。
可以通过微胶粒形成将免疫保护元件整合到基因导入载体的表面中，所述基因导入载体如膜包绕的病毒核心。见，例如Uster et al.，Febs Lett.386：243(1996)。DSPE-PEG分子是两亲性分子，可自发形成热力学不稳定的微胶粒，并与病毒颗粒的较大膜表面融合。以该方式进行的成功插入可以通过下述方法进行检验。应用同位素标记的颗粒还可监测免疫保护元件的整合对颗粒在血中清除率的影响。
对于靶基因导入来说，多价多功能接头有很多优势。如下所述，基于激活的酸性、疏水性氨基酸共聚物，如谷氨酸和亮氨酸，及其功能等价物，本发明提供了一种新型多价多功能接头。这种接头的激活可以在第三种胺存在的情况下，通过聚合物与二-五氟苯基碳酸盐的反应进行。经验丰富的技术人员应该清楚，应用其他激活手段，如N，N-二环己基碳二酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺，BOP试剂，以及应用其他肽化学领域已知的浓缩试剂也属于本发明范畴。然后可以将所需功能基团如PEG或靶肽或成融肽结合到激活接头上。该接头拥有疏水位点，可以更好地与病毒膜亲和，并保留一些正电荷，以更好地与细胞表面亲和。可以保留(或重新创建)活性基团的一些部分，用来把接头共价附加到载体上。该接头可以在不将脆弱的病毒暴露于过度化学处理的情况下，以多种方式修饰病毒表面。
靶元件
靶元件具有将载体高度特异性附加到靶细胞膜上的潜力。例如，靶元件可以是包括一个结合区的靶肽，该结合区可以与靶细胞表面的受体或配体结合。靶元件可以选自抗体或其片段，受体配体，完全蛋白，肽，受体，作为配体的非肽有机分子，维生素，以及细胞表面蛋白的无机辅因子。优选地，靶元件可以与所需宿主细胞上高度表达的受体结合，所述宿主细胞是基因治疗的靶细胞，例如肿瘤细胞。
适宜的配体包括但不限于，靶细胞是内皮细胞的血管内皮细胞生长因子，靶细胞是血管的FGF2，靶细胞是表达整合素细胞的层粘连蛋白和RGD肽。其他实施例包括(i)叶酸，其中组合物欲用来治疗具有细胞表面叶酸受体的肿瘤细胞；(ii)pyridoxyl，其中组合物欲用来治疗病毒感染的CD4+淋巴细胞；或(iii)唾液酸-Lewis0X，其中组合物欲用来治疗炎症区域。在一个优选实施方案中，靶等分是拟肽。见，例如，Kieber-Emmonset al.，Current Opinion in Biotechnology 8，435-441；Haubner et al.Angew.Chem.Int.Ed.Engl 36，1374-1389(1997)；Pauletti et al.，Adv.DrugDelivery Reriew.27，235-256(1997)；Boxus et al.，Bioorganic and MedicinalChemistry.6，1577-1595(1998)；Schoepfer，Bioorg.Med.8，2865-2870(1998)。
在一个优选实施方案中，拟肽指向肿瘤细胞上的受体或其他靶目标。例如，α-促黑激素抑制素拟肽类似物，([Nle4，D-Phe7]-α-MSH)，可以用来治疗黑色素瘤，其中黑色素瘤细胞过量表达α-MSH受体。本领域其他肿瘤相关性拟肽也是已知的，属于本发明范畴。见，例如Kieber-Emmons et al.，1997，supra；Haubner et al.，supra。业已有描述认为，神经紧张素和纤维蛋白溶酶原激活因子的受体结合部位是肿瘤相关配体(Schnierle and Groner，Gene Ther.3：1069-73(1996))。其他靶配体在美国专利号5,916,803中有描述，该专利在此全文引入，作为参考。
在本发明另一个实施方案中，可以应用本领域众所周知的噬菌体显示法选择适宜的肽配体。适宜的方法在，例如美国专利号5,780,221中有所描述，该专利在此全文引入，作为参考。简而言之，编码随机序列肽和预选长度肽的短核酸序列丈库与编码丝状噬菌体表面蛋白的基因框架融合，所得肽在噬菌体表面表达(显示)。然后在适宜条件下，筛选噬菌体与靶分子的结合能力，如固定在固体支持物上的细胞表面受体。可以应用大型噬菌体文库，这样可以同时筛选大量肽序列的结合特性。分离具有所需结合特性的噬菌体，测定编码相应肽配体的核酸序列。这些肽可以作为配体直接用于本发明的方法，或者可以作为模板，用来设计、合成用作靶元件的拟肽。
TAGD载体表面靶等分的数量可以根据以下因素而有差异，所述因素如配体受体相互作用的强度，靶细胞表面受体的相对充裕度，以及靶细胞的相对充裕度。但是，可以预见，每个载体表面必须至少存在20-100个靶分子，才能适宜增强细胞定向。可以应用多种方法将靶等分整合到TAGD载体表面中，例如，通过热动力学不稳定微胶粒作为媒介，以后将给予详细描述。此外，靶等分还可应用多接头来添加，与上述将PEG添加到载体表面的方式相同。在一个实施方案中，靶等分通过标准接头化学与表面结合。见例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques(PierceChemical Company/Academic Press，San Diego，p785(1996))。
例如，对于含有脂质结合聚合物的表面，靶等分可以通过“献者-受者”反应类型，与脂质聚合物结合物发生化学结合。因此，在一个实施例中，设计的靶等分携带一个游离巯基(献者)，该巯基可以与脂质结合聚合物上存在的马来酰亚胺基(受者)发生反应。反应的进展可以通过应用Ellman’s试剂，在300nm处观察UV吸收的减少来监测，吸收减少是由于发色基团马来酰亚胺的丧失以及游离巯基的丧失。还可应用本领域已知的其他结合方法，例如，应用亲核胺基(献者)与激活的羧基，如N-羟基琥珀酰亚胺基酯(受者)结合。经验丰富的技术人员应该理解，献者等分可以存在于颗粒表面，受者存在于靶等分，如果需要，反之亦然。同样，靶等分可以与TAGD载体的脂质膜直接结合，或者与载体的脂质聚合物结合物组分直接结合，或者与存在于载体上的任何其他适宜表面等分直接结合。
一旦以这种方式结合，还需确保靶等分依然保留与所需靶细胞结合的能力。这一点可以通过应用本领域已知的方法进行。例如，可以比较非结合靶等分与其同类受体的结合能力，以及结合等分的结合能力。这一比较可以应用已经装配的TAGD载体进行，但在整合到TAGD载体前比较结合与非结合等分会更加方便。在靶等分与装配或部分装配的载体的一个或多个组分直接结合的情况下，可以通过进行模型反应完成该比较，在模型反应中，靶等分与载体的一个或多个组分结合，然后将获得的模型化合物与未结合靶等分进行比较。
本发明提供了一个间接结合法实施例，通过考虑促黑激素抑制素(α-MSH)化合物，检验了结合靶等分依然保留了与其靶目标结合的能力。因此，可以合成具有马来酰亚胺功能的α-MSH，能够与含有巯基(SH)的DSPE、PEG结合物结合。然后，以相同的纳摩尔浓度，比较α-MSH、DSPE-PEG-SH和DSPE-PEG-α-MSH结合物在黑色素瘤B16细胞中诱导黑色素形成的能力。结果发现，结合肽与非结合α-MSH肽具有相似的能力。
如上所述，利用微胶粒与较大膜表面融合的能力，可以将结合物整合到TAGD载体中。适宜的方法在Kirpotin et al.(FEBS Lett.388：115-8(1996))中有所描述。还见Uster，supra。例如，可以应用脂质-PEG-125Iα-MSH结合物与MoMuLV病毒颗粒共同孵育。获得的病毒颗粒首先通过阶梯蔗糖梯度离心纯化，然后应用不连续梯度离心纯化。结果发现，同位素计数高与含有病毒颗粒的片段相关。在另一个实施例中，应用相同类型的微胶粒可以将红色荧光物质DSPE-PEG-若丹明等分整合到病毒颗粒中。MoMuLV与DSPE-PEG-若丹明共同孵育，然后与鼠或人细胞结合。然后将细胞与抗MoMuLV env抗体共同孵育，随后加入FITC标记的二抗(绿色荧光)。获得的细胞可以应用FACS分析。结果发现，在含有病毒受体的鼠细胞上可以特异性探测到这里作为追踪剂的若丹明信号，而在缺乏鼠病毒结合受体的人类细胞上则探测不到非特异性信号。
为了显示将靶等分整合到TAGD载体后可以改变载体的细胞结合特异性，如上所述，可以将DSPE-PEG-α-MSH结合物与MoMuLV病毒颗粒共同孵育，然后检测其与人类黑色素瘤D10细胞结合的能力。使修饰和未修饰的MoMuLV颗粒与D10细胞结合，然后应用上述方法检测Moloney env特异性FITC信号的存在。结果发现，自身不能与人类细胞结合的鼠病毒MoMuLV，在经过脂质-PEG-α-MSH结合物预处理后，可以与人D10细胞结合。但是，表面不含DSPE-PEG-α-MSH的MoMuLV，却没有检测到结合。这些结果显示，应用适宜的结合等分，可以改变TAGD颗粒的结合特性。本领域技术人员应该认识到，该实施例只是举例说明，并应理解，这一结果具有广泛的适用性。
细胞进入元件
细胞进入元件通过提供膜活性组分，在TAGD载体和靶细胞之间形成融合，进而帮助TAGD载体进入宿主或靶细胞。因为在靶药物导入中效率的主要限制因素是跨越靶细胞膜，因此具有功能性细胞进入元件的TAGD载体能够进入靶细胞，并高效导入治疗性化合物。
优选地，细胞进入元件是成融等分，如肽，即具有膜去稳定能力的肽。成融肽的存在可以通过破坏膜磷脂的有序包装而诱导细胞膜上孔的形成。一些成融肽可以促进脂质紊乱，并以该方式增加位置邻近的膜的合并或融合机会，所述位置邻近的膜可以是两个膜包裹的多种性质的颗粒(如细胞，有包膜病毒，脂质体)。其他成融肽可以同时粘附到两个膜上，导致膜的合并，并促使它们合而为一。成融肽的示例包括来自病毒包膜蛋白外功能区的融合肽，来自病毒胞浆尾包膜蛋白膜邻近功能区的膜去稳定肽。
其他成融肽通常还包括一个两亲性区。含有两亲性区的肽的示例包括：蜂毒素，爪蟾抗菌肽，HIV1 gp41的胞浆尾，微生物和爬行动物的细胞毒肽，如bomolitin 1，pardaxin，肥大脱粒肽，crabrolin，杀菌肽，内阿米巴属和葡萄球菌的α毒素；来自下述区域的病毒融合肽，(1)病毒包膜蛋白跨膜(TM)功能区的N末端区域，如HIV-1，SIV，流感病毒，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒和柯萨奇病毒；(2)TM外功能区的内部区域，如semliki森林病毒，sindbis病毒，轮状病毒，风疹病毒和来自精子蛋白PH-30的融合肽；(3)邻近病毒包膜蛋白胞浆侧的膜区域，如禽白血病增生病毒(ALV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)，以及脾坏死病毒(SNV)。
在有疏水表面如膜存在的情况下，这些成融肽通常会倾向形成两亲性α-螺旋结构。技术人员应该理解，两亲性肽就是这样一种肽，其一侧为疏水端，另一侧为亲水端。一方面，成融肽序列取自病毒包膜蛋白的一部分，是包膜蛋白跨膜部分的5’越膜片段。
在天然病毒中，感兴趣两亲性片段位于包膜蛋白跨膜部分越膜片段疏水区之后，长度通常大约为20个氨基酸。本发明成融肽的长度通常多种多样。在一个实施方案中，这些肽包括一个两亲性氨基酸序列，大约有12-35个氨基酸残基。疏水的越膜片段通常在其近胞浆端包括一个甘氨酸或脯氨酸，一般与转折结构相关。这些近膜片段的两亲性可以通过计算它们的疏水力矩来鉴定。这些近膜两亲性片段的示例见附录2。
在另一个实施方案中，成融肽包括一个衍生自上述氨基酸序列与上述氨基酸序列类似的氨基酸序列。衍生或类似的氨基酸序列相较于上述氨基酸序列，至少有一个氨基酸残基的取代。在一个实施方案中，成融肽包括一个来自上述包膜蛋白胞浆部分的氨基酸序列，并进一步包括至少一部分跨膜蛋白。
表1给出了来自病毒的代表性成融肽示例。表1中，负数指病毒包膜蛋白预期跨膜区C末端区域的氨基酸残基，正数指肽中病毒包膜胞浆尾从N末端开始的残基数量。跨膜功能区和胞浆功能区的交界是在病毒包膜蛋白外功能区N末端延展大约20个疏水氨基酸后的第一个亲水氨基酸。因此，例如，一个标记为“-2/14”的肽提示，分离的肽包括(以N末端到C末端的方向)，如N末端的最先两个氨基酸残基，预期跨膜部分的两个C末端氨基酸，以及最后14个氨基酸残基是预期胞浆尾的N末端14个氨基酸。表1列出了在很多病毒包膜蛋白中，最具有两亲性特性的近膜片段的位置。
表1还应用了下述缩写：ALV-禽白细胞增生病毒；BLV-牛白血病病毒；EIA-马感染性贫血；FIV-猫免疫缺陷病毒；HEP C-丙型肝炎；HIV-人类免疫缺陷病毒；HTLV-人类T细胞白血病病毒；hRSV-人类呼吸道合胞病毒；infM2-流感M2病毒；INF-流感；MMTV-鼠乳腺肿瘤病毒；MPMV-Mason Pfizer猴病毒；RSV-Rous肉瘤病毒；PINF-副流感；SNV-脾坏死病毒；VSV-疱疹性口炎病毒；SimSrcV-HLB-猿肉瘤病毒；MoMuLV-Moloney鼠白血病病毒。
表1 病毒 片段 病毒 片段 ALV -2/14 INFA1 -2/11 BLV -2/17 MoMuLV -3/14 EIA 1/52 MMTV -6/13 FIV -6/10 MPMV 1/22 HEP C 1/17 RSV -9/8 HIV1 -3/11 PINF 1/17 HIV 25YR 11/25 SIV239 -5/13 HTLV2 1/12 SNV -2/16 HRSV 1/21 VSV -2/13 InfM2 1/16 SimSrcV-HLB -9/8
在一个优选实施方案中，成融肽是MoMuLV包膜蛋白(env)的近膜胞浆功能区。该功能区在多种病毒中结构特征保守，并包括一个膜诱导α-螺旋。该肽在共同未决的申请序列号09/112,544中有所描述，该申请在此全文引入，作为参考。
在另一个实施方案中，使用谷氨酸与亮氨酸的共聚物作为成融元件。这些共聚物是强有力的pH依赖性亲水/疏水构象载体，可以用来将多种物质导入细胞。见WO 97/40854，在此全文引入，作为参考。但是，这些共聚物业已显示的膜跨越和膜干扰特性在本发明背景中却用于不同的目的。与基因导入颗粒表面粘附的共聚物，不是将物质导入细胞，而是作为pH依赖性成融因子和/或多价、多功能载体发挥其他所需功能(成融，免疫保护，靶功能等)。依赖于谷氨酸和亮氨酸或其他疏水(天然或非天然)氨基酸的共聚物的pH依赖性接头的成融特征，可以通过应用上述成融肽而得到进一步增强。
体外装配载体
一种装配TAGD载体的方法是通过应用微胶粒制剂，所述微胶粒制剂包括欲添加到载体上的元件。因此，例如，如上所述，可以将靶配体和成融元件共价连接于聚合物脂质化合物上，然后应用获得的结合分子制备微胶粒。将这些微胶粒添加到核心等分制剂中，这样结合体就会插入到核心等分的表面中。相似的“扩散交换”法在例如美国专利号5,631,018中有所描述，该专利在此全文引入，作为参考。
其他可用来装配TAGD的方法在本领域已知。例如，一种修饰天然病毒包膜的方法是通过双重去污剂透析，如美国专利号5,766,625所述，该专利内容在此全文引入，作为参考。病毒包膜的脂质可以通过应用下述制剂来修饰，所述制剂如可以部分溶解包膜的脂质和/或免疫保护聚合物以及去污剂，如胆酸钠。然后应用磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分透析以去除去污剂，之后再应用脱氧胆酸钠或其他适宜去污剂通过部分微胶粒形成插入成融等分和/或靶等分。随后再次通过充分透析去除去污剂。
术语“部分微胶粒形成”是指“软化”的病毒膜，这样可以整合添加的免疫保护脂质或聚合物组分，但是病毒膜还没有溶解(微胶粒化)到丧失双层结构的程度。部分微胶粒形成过程可以通过应用激光散射装置监测囊泡的光散射来控制。将充足的去污剂引入囊泡散射系统以维持光散射信号。光散射信号的消失提示完全溶解，双层结构丧失。在一个实施方案中，部分微胶粒形成后，可以通过测定病毒滴度来检验TAGD颗粒的完整性。
有用的去污剂对于本领域技术人员来说是众所周知的，包括但不限于胆盐(胆酸钠，去氧胆酸，牛磺胆酸)，CHAPSO，辛基配糖物，TRITON-X衍生物等。这些去污剂可以是两性离子的，如CHAPSO，或非离子的，如辛基配糖物和Triton-X。优选非离子去污剂，因为它们不太容易导致TAGD颗粒完整性的丧失。在决定选择去污剂的时候，应该考虑特定去污剂与插入表面蛋白之间的兼容性。
在一个实施方案中，装配TAGD载体的另一种方法是将一个或多个免疫保护元件、靶元件和细胞进入元件共价连接到病毒颗粒表面存在的病毒蛋白上。因此，例如，制备的添加元件可以携带活性羧基，这样可以与病毒蛋白赖氨酸分子的侧链游离氨基发生反应。将分子连接于蛋白的其他方法是本领域众所周知的。例如，表面赖氨酸分子的侧链可以与2-iminothiolane(Traut’s试剂)发生反应，产生游离巯基。然后，这些基团可以与携带马来酰亚胺基的一个或多个免疫保护元件、靶元件和细胞进入元件发生反应。
制备含有新功能元件表面的TAGD载体的方法包括在添加脂质存在的情况下，超声波降解或旋转包膜病毒，这样添加的脂质就会引入到已有脂质膜中(见，例如Huang et al.，Biochemistry.8：344-52(1969)描述的方法)。含有所需新功能组分的TAGD载体还可在包括颗粒核心存在的情况下，通过脂质体形成来制备。这些方法包括应用去污剂透析的脂质形成(见Kagawa et al.J.Biol.Chem.246：5477-5487(1971))；冻融法(见Mayer et al.Biochimica et Biophysica Acta 817：193-6，(1985)and Bally etal in：Liposomes as drug carriers，edited by Gregoriadis，G.Chichester-NY-Brisbaine-Toronto-Singapore：John Wiley & Sons，pp.841-854(1988))；反向蒸发(见Szoka et al.Biochimica et Biophysica Acta 601：559-571(1980))。最后，亮氨酸和谷氨酸的阻滞共聚物显示，可以象脂质一样发挥作用，形成膜。见Minoura，Langmuir，14：2145-2147(1998)。因此，可以应用上述方法，利用这些阻滞共聚物作为膜元件用于TAGD载体。
当TAGD核心是逆转录病毒载体时，可以应用美国专利号4,661,022描述的方法进行大量生产和纯化，该专利在此全文引入，作为参考。
载体的给药方法
TAGD载体的给药方法是本领域众所周知的。载体优选胃肠外给药，更优选静脉内或动脉内给药。
体外检测载体
体外检测本发明载体的方法是本领域众所周知的。例如，载体可能包括一个报导基因或选择标记，可以用来追踪载体在靶细胞的成功插入和表达。例如，载体可以工程修饰包括一个报导基因，如β-半乳糖苷酶(β-gal)，氯霉素酰基转移酶(CAT)，荧光素酶(luc)或绿色荧光蛋白(GFP)。然后将载体应用于靶细胞群，检测报导基因产物的表达水平。为了对照，该表达还应与另一载体表达水平进行比较，所述载体或者缺乏靶配体或细胞进入元件之一，或者缺乏全部靶配体与细胞进入元件，以及一个或所有免疫保护元件。此外，载体还可包括一个耐药标记，如新霉素耐药基因。在将载体用于靶细胞之后，检测细胞的耐药性。
体内检测载体效果
体外检测本发明载体效率的方法是本领域众所周知的。例如，当载体用于治疗哺乳动物某种疾病时，载体的效果可以通过研究该病一种或多种症状的改善得以确定。优选地，可以应用已经界定的临床终点来确定体内效果，所述临床终点是某种疾病的进展或程度特征。可以应用基因疗法治疗的疾病是本领域众所周知的。见，例如Verma et al.，Nature 389：239(1997)，以及该文引用文献。
因此，通过参考下述实施例将更容易地理解概括描述的本发明，这里提供的实施例只是为了举例说明，无意于限制本发明。
实施例
下述实施例显示，合成的功能等分可以插入到含有颗粒的核心表面。特别是，可以通过非基因手段功能修饰逆转录载体，使它在其表面上包括α-MSH拟肽配体。定向携带该配体的TAGD载体可以用于黑色素瘤的基因治疗。此外，实验还描述了逆转录颗粒的包装。
有三种方法用来完成这些步骤：(1)颗粒表面的直接修饰；(2)应用微胶粒媒介完成表面插入；以及(3)应用多功能多价接头。这些方法利用的方法，以前曾用于制备脂质体结合体，以及将小型肽直接化学粘附于生活有机体表面。见Kashkin et al.，Immunologija N6，37-40(1987)and Author’s certificate USSR N 145085.A-61 K39/39(1988)。
载体分子与靶配体的结合
通过将马来酰亚胺基衍生物与靶配体上存在的巯基发生反应，可以获得载体分子的结合。应用本领域众所周知的方法，可以将PEG与磷脂酰乙醇胺结合，然后应用标准技术将之转化为马来酰亚胺衍生物(马来酰亚胺基-PEG-PE)。获得的化合物需要进一步与作为靶配体肽的半胱氨酸598-616肽(ILNRLVQFVKDRISVVQAL)结合。该结合反应可以利用马来酰亚胺基基团在300nm处的吸收特性来监测。(Hermanson，supra)。脂质(即DSPE)-PEG-SH与α-MSH maleinidoylated类似物以及其他肽的结合也可以获得类似结果，所述α-MSH类似物以及其他肽包括α-MSHNLD，一种MSH的拟肽类似物([Nle4，D-Phe7]-α-MSH，购自NovaBiochem，San Diego，CA)。
结合过程中肽的转化水平可以根据马来酰亚胺基基团的摩尔吸收值(630M/cm-1)来计算。反应的完全性可以应用Ellmann’s试剂，通过监测未结合巯基来确定。结合还可通过质谱分析(ES/MS and MALDI-TOF)来确定结合体中不包括未结合肽，所述未结合肽可能干扰进一步实验的结果。制备好的结合体以微胶粒的形式，在质子惰性媒介中，通过凝胶过滤和透析进行纯化。见Karnoup et al.，J.Peptide Res.49：232-239(1997)。
通过在黑色素瘤B16细胞中黑色素形成实验检测发现，获得的脂质-PEG-α-MSH结合体保留了生物活性。因此，在相同纳摩尔浓度下，检测了α-MSH，DSPE-PEG-SH和DSPE-PEG-α-MSH。α-MSH结合体诱导黑色素形成的效率与未结合α-MSH肽相似。
结合体与病毒颗粒的整合及细胞靶向
在构建TAGD载体的下一步中，利用了热力学不稳定微胶粒与较大膜表面融合的能力。该方法可以用于脂质聚合物靶配体结合体与脂质体(见Kirpotin，supra)或病毒颗粒(见下)膜表面的整合。
脂质-PEG-125Iα-MSH结合体与MoMuLV病毒颗粒共同孵育。经修饰的病毒颗粒首先通过阶梯蔗糖梯度离心纯化，然后应用不连续梯度离心纯化。结果显示，同位素计数高与病毒颗粒沉淀的相同片段有关。
为了进一步显示该方法的效用，应用微胶粒将DSPE-PEG-若丹明(红色荧光)与病毒颗粒相连。从而先将MoMuLV与DSPE-PEG-若丹明孵育，然后与鼠NIH 3T3细胞或人类D10黑色素瘤细胞结合。随后将细胞与抗MoMuLV env抗体孵育，再加入FITC标记的二抗(绿色荧光)。应用FACS分析获得的标记细胞(以及阴性对照细胞)。结果显示(见图3)，通过与微胶粒孵育，仅在病毒颗粒整合了结合体的情况下，在包括病毒受体的鼠细胞中特异性探测到若丹明信号(在右上象限的红色荧光)。因此，与预期的一样，DSPE-PEG-若丹明进入了MoMuLV颗粒，并可在鼠宿主细胞中检测到。
接下来，将DSPE-PEG-α-MSHNLD结合体与MoMuLV病毒颗粒共同孵育，检测结合体改变鼠逆转录病毒颗粒与人黑色素瘤D10细胞结合的能力。允许经修饰和未经修饰的MoMuLV颗粒与D10细胞结合，然后应用抗env一抗和FITC标记的二抗检测这些细胞中Moloney env特异性信号的存在(如上所述)。FACS结果显示，应用脂质-PEG-α-MSH预处理的MoMuLV，与人类D10细胞的结合存在正向漂移。但在阴性对照组中，应用脂质-PEG修饰但缺乏α-MSH的病毒颗粒没有显示与人类细胞结合的相似能力。这些实验显示，鼠逆转录病毒颗粒经α-MSH拟肽结合体表面整合修饰后，可以与人黑色素瘤细胞结合。因此，业已显示，表面修饰颗粒可能使其改变，导向新的特异性宿主细胞。
还检测了相同颗粒转导人类细胞的能力。通过DSPE-PEG将α-MSH结合体连接到重组病毒颗粒表面(来自产eco细胞系GPE86/LNCX)，病毒滴度可达＞102，提示标记基因(neo和β-gal)的成功导入。在应用谷氨酸和亮氨酸共聚物将α-MSH提呈到MoMuLV表面时，病毒滴度可达＞104。在鼠NIH 3T3细胞中，野生型MoMuLV未修饰、未操作的颗粒滴度是10-6。下面将给出共聚物-MSH结合体的制备细节。
另一种创建TAGD载体的方法是应用化学结合，将功能肽、拟肽和聚合物直接或通过新型多功能、多价接头连接于病毒颗粒表面。这些化学结合方法需要应用有机助溶剂，并应用其他反应性有机化合物处理，因此，首先必须建立的是能够保留病毒活力的各种化学修饰试剂的工作浓度。应用多种有机溶剂和结合体处理病毒。结果发现，MoMuLV对有机溶剂的处理令人惊异的稳定，在应用高达5％(v/v)氰化甲烷或DMF处理30分钟后，MoMuLV仍可保留几乎全部感染性。这些结果提示，病毒能够耐受对病毒颗粒进行化学修饰所必需的条件。
结果显示，在应用Traut’s试剂修饰后，MoMuLV还能保留其感染性。这一点提示，可以通过应用Traut’s试剂修饰病毒表面，将结合体共价粘附于病毒颗粒上，然后使修饰病毒与马来酰亚胺基化的化合物发生反应。结果发现修饰的最佳条件是Traut’s试剂大约为1-8mM。
进一步的实验显示，可以应用含90％谷氨酸(w/w)和10％亮氨酸的多功能多价接头，将α-MSH拟肽配体整合到MoMuLV表面上。见，例如Bychkova et al.，Mol.Biol.(MoscoW)14：278-286(1980)。简而言之，将聚合物(100mg)溶解于含300mg二-五氟苯基碳酸盐的2ml DMF中。将二异丙基乙胺(DIPEA)溶解于1ml DMF中，以0.1ml为单位缓慢加入。40分钟后，用乙醚沉淀反应产物，然后用乙醚和戊烷清洗，并干燥。获得的活性接头(10mg)溶解于2ml DMF中。然后加入肽(α-MSHNLD，1mg)，再加入25ul DIPEA。室温下摇动反应过夜，然后储存于-20℃。以该方式加入接头可以确保仍然保留一部分活性五氟苯酯，可以进一步与基因导入载体的表面结合。
然后在与上述DSPE-PEG-MSH相似的条件下，将该接头-MSH结合体与病毒颗粒孵育。修饰后，应用Western印迹分析检测MoMuLV颗粒，确定α-MSH整合到病毒颗粒中的情况。结果发现，α-MSH阳性信号与修饰病毒的env蛋白相关，但在未修饰病毒中没有该信号，所述未修饰病毒作为阴性对照添加了未结合α-MSH。以该方式添加的MSH配体还成功改变了修饰MoMuLV颗粒的结合特异性。因此，含有多功能、多价接头的化学修饰MoMuLV能够与人类黑色素瘤D10细胞结合，而未修饰病毒则不能，所述接头包括α-MSH拟肽配体。还发现，应用多功能接头进行结合，较上述化学修饰要好。这些结果见图4。
将MuLV颗粒再包装到新型功能表面中
该实验显示，基因导入颗粒，如病毒颗粒，可以用新型功能表面再次包装。应用UV灭活的仙台病毒提供这样一个功能性再定向、成融包膜表面，将MoMuLV颗粒的基因物质导入新的宿主。仙台病毒以前业已显示，可以与赤裸的膜表面融合，并已作为成融脂质体组分用于基因导入(综述见Nakanishi et al.，Journal of Controlled Release 54：61-68(1998))。应用UV灭活的仙台病毒与编码绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的MoMuLV融合。把MoMuLV加入培养的Hela细胞中，没有检测到GFP的表达。但是，融合了仙台病毒的MoMuLV却可以使人类Hela细胞(＞50cfu/ml)表达GFP，提示鼠病毒MoMuLV转导了人类细胞系。因此，这些结果显示，应用包括融合、再定向分子的人工表面可以再次包被核心。