具有增强红细胞生成素体内活性的融合蛋白技术领域
本发明涉及具有增强红细胞生成素(下简称EPO)体内活性的融
合蛋白，所述EPO是治疗贫血症的新药。具体而言，通过将EPO分
子与具有延长半寿期活性并衍生自人体的一定肽融合，本发明涉及具
有高度增强红细胞生成素体内半寿期和活性的融合蛋白。
背景技术
EPO为糖蛋白，分子量30,000-34,000，是促进红细胞生成和分化
的因子。该蛋白与红细胞前体细胞上的受体结合后导致细胞内钙离子
浓度降低、DNA生物合成增加、刺激血红蛋白形成等。所述EPO能
用于治疗肾衰竭贫血、早产婴儿贫血、甲状腺功能减退贫血以及营养
不良贫血等。重组人EPO的临床使用与日俱增。但是由于其半寿期短，
每周平均需要施用三次，这种使用可带来某些不便和高额费用。因而，
如果EPO的体内活性能维持长时间，则可大大降低施用EPO的次数。
EPO功效与其体内半寿期成正比。已知EPO体内半寿期与位于
EPO碳水化合物链末端的唾液酸含量相关。因此，EPO功效高度依赖
于碳水化合物链的存在。由于碳水化合物的形式在各种表达EPO的细
胞中有不同表现，因此相同糖蛋白在不同细胞中表达时可有不同的碳
水化合物结构。尽管最近已表明一些细菌能添加碳水化合物链，但已
知典型细菌如大肠杆菌(E.coli)就不会。E.coli中表达的蛋白不含有
碳水化合物链，因此衍生自E.coli的EPO也不含有碳水化合物链，其
在体外表现出活性，但在体内却没有活性。这是因为去糖基化的EPO
从人体中很快消除，半寿期极短。总之，碳水化合物链在EPO活性中
发挥极其重要的作用。
已进行了许多研究来增强EPO的活性。主要途径是通过EPO基
因上的诱变取代一些EPO氨基酸。例如，Amgen公司提交的题目为
“红细胞生成素类似物”的专利申请PCT/US94/09257公开了通过诱
变增加碳水化合物含量来提高EPO体内半寿期的方法。还通过形成
EPO二聚体来试图提高EPO的体内半寿期。参见A.J.Sytkowski等，
J.B.C.274(35)：24773-24778。此外，另一已知方法是将新氨基酸、
肽或蛋白片段与EPO分子通过基因工程方式融合以及提高EPO的碳
水化合物含量，即唾液酸含量，从而增强体内EPO活性。然而，并非
所有氨基酸、肽或杂合蛋白片段能用于此目的。在大多数情况下，这
些修饰可导致蛋白固有活性的降低或损失，并且体内使用时可带来抗
原性问题。
虽然与EPO无关，融合蛋白或嵌合蛋白已用于研究例如一种性
激素促卵泡激素。参见Furuhashi等，1995，Mol.Endocrinol.。不过，
由于采用基因工程方法进行蛋白修饰存在一些风险，这些方法还未应
用到工业上。即，在大多数情况下，没有专业技能不易获得靶蛋白，
与之相反，通过添加或取代以新氨基酸则可降低或丧失蛋白固有活
性。
发明内容
本发明人通过将新氨基酸、肽或蛋白片段与EPO分子融合并由
此提高其碳水化合物含量，已广泛研究了增强EPO体内活性的新方
法。结果本发明人发现，将已在人体内存在的血小板生成素(下简称
TPO)的羧基端肽(下简称CTP)与EPO的羧基端融合，可得到EPO
融合蛋白，由于许多氨基酸增加糖基化位点，该融合蛋白具有高度增
强的体内半寿期同时又不损失EPO的固有活性，并且给人体施用时不
会导致任何抗原性。由此，本发明人完成了本发明。
因此，本发明目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白具有增强的
人EPO体内活性并含有与人EPO在其羧基端相融合的TPO的CTP。
本发明的另一个目的是提供编码该融合蛋白的核酸、含有该核酸
的重组载体以及被该重组载体转化了的宿主细胞系。
本发明的进一步目的是通过培养转化的细胞系提供制备具有增强
人EPO体内活性的融合蛋白的方法。
首先，本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白具有增强的人EPO
体内活性并含有与人EPO在其羧基端相融合的TPO的CTP。CTP优
选包含对应于位置176-353氨基酸(下简称LTP)的SEQ ID No.1氨
基酸序列或其部分，尤其包含对应于位置337-353氨基酸(下简称STP)
的SEQ ID No.2氨基酸序列。
特别地，根据本发明的融合蛋白包含SEQ ID No.3或4的氨基酸
序列。
其次，本发明涉及编码融合蛋白的核酸、含有该核酸的重组载体
以及被该重组载体转化了的宿主细胞系，优选CHO细胞(中国仓鼠
卵巢细胞)。
第三，本发明涉及通过培养转化的细胞系制备具有增强人EPO
体内活性的融合蛋白的方法。
以下将更详细解释本发明。
附图简述
附图1a和1b表示TPO羧基端肽(LTP、STP)的核苷酸和氨基
酸序列；
附图2aa 和2ab表示EPO和肽LTP的融合蛋白ELTP的核苷酸
和氨基酸序列，以及附图2b表示EPO和肽STP的融合蛋白ESTP的
核苷酸和氨基酸序列；
附图3a和3b表示表达载体pcDNA-ELTP和pcDNA-ESTP制备
过程的图解；
附图4为被表达的ELTP和ESTP的电泳照片；以及
附图5表示EPO、ELTP和ESTP的药代动力学结果。
发明最佳实施方式
本发明包含下列步骤：所需融合蛋白基因的制备和克隆，含有所
需基因的表达载体的构建，动物细胞的转化，表达，纯化和生物分析。
(1)基因制备
采用EPO cDNA末端的互补引物(EP1和EP2)，执行常规PCR
技术(Bioneer公司的PCR PreMix Kit)从衍生自人胎儿肝脏的cDNA
文库(Invitrogen公司)中可获得EPO cDNA。采用TPO cDNA末端
的互补引物(T1和T2)以相同方式可获得TPO cDNA。
EP1：ATGGG GGCAC GAATG TCCTG CCTGG CTGG(SEQ ID
No.5)
EP2：GTCCC CTGTC CTGCA GGCCT(SEQ ID No.6)
T1：ATGGA TCTGA CTGAA TTGCT CCTC(SEQ ID No.7)
T2：TTACC CTTCC TGAGA CAGAT TCTGG GA(SEQ ID No.8)
由PCR获得的EPO cDNA和TPO cDNA分别克隆到克隆载体
pGEM-T(Promega公司)中。然后将pGEM-EPO和pGEM-TPO测
序并用作下列程序的模板。
以pGEM-TPO为模板，采用引物EL1和T2，通过PCR扩增，
可获得本发明所用的TPO的CTP基因LTP。
EL1：GAGGC CTGCA GGACA GGGGA CGCCC CACCC ACCAC
AGCTG TCC(SEQ ID No.9)
引物EL1含有延伸至靠近EPO 3’端的限制性酶StuI位置的基
因，以及同时含有LTP基因(TPO位置176-353的氨基酸)5’端的
一部分。另一方面，以pGEM-EPO为模板，采用引物EP1和EP2，
进行PCR扩增，只生成EPO基因。由此获得的EPO和LTP基因分别
用限制性酶StuI处理。然后，将EPO和LTP基因片段连接，并在PCR
程序中以连接产物为模板，采用引物EP11和L2，从而生成含有约1113
bp(碱基对)的基因片段ELTP。
EP11：TAAGC TTATG GGGGT GCACG AATGT(SEQ ID No.10)
L2：TGGAT TCTTA CCCTT CCTGA GACAG ATTC(SEQ ID
No.11)
将该基因克隆到克隆载体pGEM-T中，然后测序(pGEM-ELTP，
附图3a)。
进一步，本发明所用的STP基因可由合成和自身引导PCR程序
获得。合成的基因片段为下述的ES1、S2、S3和上述的L2。
ES1：AGGGG AGGCC TGCAG GACAG GGGAC CCTCT TCTAA
(SEQ ID No.12)
S2：GTGGG TGTAG GATGT GTTTA GAAGA GG(SEQ ID No.13)
S3：TACAC CCACT CCCAG AATCT GTCTC(SEQ ID No.14)
4种基因片段每种取出1μl(50pmol/μl)，采用宝灵曼(BM)
公司的高保真Taq系统进行PCR扩增。
将约50bp的基因片段(STP基因)在1％琼脂糖凝胶中鉴定。
该基因编码TPO羧基端的17个氨基酸(位置337-353的氨基酸)(附
图1)。
以pGEM-EPO为模板，采用引物EP11和EP2，进行PCR扩增，
只生成EPO基因。以该EPO基因和STP基因同时作为模板，采用引
物EP11和L2，经BM公司的高保真Taq系统进行PCR扩增，生成
约630bp的所需融合基因即ESTP基因。将该基因克隆到克隆载体
pGEM-T中，然后测序(pGEM-ESTP，附图3b)。
(2)表达载体构建
Invitrogen公司的pcDNA3.1载体用作表达载体。
将pcDNA3.1载体用限制性酶HindIII和BamHI处理生成线性载
体，将pGEM-ELTP和pGEM-ESTP也分别用相同的限制性酶HindIII
和BamHI处理。将消化的pcDNA3.1、ELTP和ESTP基因采用Qiagen
提取试剂盒在琼脂糖凝胶上分离。各个基因连接后，将连接产物导入
E.coli NM522中。将该转化的E.coli在LB-氨苄青霉素平板上过夜培
养，从所形成的菌落中分离出质粒，并用限制性酶HindIII和BamHI
处理。然后用1％琼脂糖凝胶电泳筛选出含有ELTP或ESTP基因的菌
落。分别将这些质粒命名为pcDNA-ELTP和pcDNA-ESTP(附图3a
和3b)。
(3)CHO细胞转化和表达
将CHO细胞(DG44)在60mm细胞培养皿中培养到40-80％汇
合(1-4×105细胞/60mm培养皿)。将3μl的superfection试剂(BM
公司)和97μl的细胞培养基(带有基质的a-MEM、无血清、无抗生
素)混合均匀，并向其中加入pcDNA-ELTP(＝0.1μg/μl，约2μg)
和含有dhfr基因的载体pLTRdhfr26(ATCC37295，0.2μg)。室温下
混合物反应5-10分钟，然后加入如上所制备的细胞中。一天后，用含
有G418的培养基(无基质的α-MEM，10％的FBS)以500μg/ml的
量更新培养基。然后用含有500μg/ml G418的G418培养基更新培养
基7-10天，在此期间，无G418抗性基因的细胞以及阴性对照细胞被
完全杀死。将G418培养基上所筛选出的细胞培养充分，并采用BM
公司的EPO ELISA试剂盒鉴定表达的ELTP蛋白。对ESTP表达载体
使用相同方法，而后以相同方式鉴定表达的ESTP融合蛋白。
(4)被表达的ELTP和ESTP的纯化
采用抗EPO单克隆抗体(R&D公司)按如下方法制备用于分离
和纯化的亲和树脂：
将0.3g CNBr活化的琼脂糖凝胶4B在1mM HCl中溶胀20分钟，
然后将树脂移至柱内，并用1mM HCl洗涤。用4ml偶联缓冲液(0.1M
NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)洗涤树脂，立即与含在4ml偶联缓冲
液中的抗EPO单克隆抗体(500μg/瓶)混合，并在室温下震荡试管
反应2小时。用封闭缓冲液(0.2M甘氨酸，pH8.0)更新后，震荡试
管使树脂在室温下反应2小时。然后将树脂按序用6.5ml偶联缓冲液、
6.5ml醋酸缓冲液(0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH4)以及6.5ml偶联缓
冲液洗涤。以如此获得的树脂制备柱子，并按如下所述进行纯化。
细胞在无血清培养基中培养一天后，采用Centriprep(Millipore，
截留分子量10,000)将培养基浓缩约5倍。该浓缩液以20ml/小时流
速装载到预先用PBS平衡过的柱上，并用PBS再次洗脱。将洗脱缓
冲液(0.1M甘氨酸，pH2.8)施加到柱上，并将洗脱液立即用1M Tris
滴定至pH7.5。用SDS-PAGE和银染分析，纯度至少为97％(附图4)。
(5)生物分析方法测定活性
在采用经苯肼处理的小鼠脾细胞的生物分析试验中，ELTP和
ESTP表达并被适当纯化后，比EPO显示较高的活性。这表明ELTP
和ESTP中的融合羧基端不能抑制EPO自身活性。
(6)药代动力学实验
对小鼠进行药代动力学实验以测定所制备的ELTP和ESTP是否
真正延长了体内半寿期。将候选物质以20单位/小鼠的量静脉施用给
4只小鼠。为了鉴定血液中的定时浓度，每间隔30分钟从小鼠中取出
血液，并采用宝灵曼(BM)公司的EIA试剂盒测定浓度。在小鼠的
药代动力学实验中，候选物质ELTP和ESTP比对照EPO显示长得多
的半寿期(附图5)。
本发明将以下列实施例更具体地解释。但是应理解下列实施例旨
在描述本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：基因制备
采用与EPO cDNA末端互补的引物EP1和EP2各50pmol，从人
衍生的胎儿肝脏的cDNA文库(Invitrogen公司)中进行常规PCR
(Bioneer公司的PCR PreMix试剂盒)，从而获得EPO cDNA。采用
与TPO cDNA末端互补的引物T1和T2以相同方式获得TPO cDNA。
使用BM公司高保真的Taq系统共进行30次循环的PCR。反应条件
为52℃退火40秒，72℃延伸55秒以及94℃变性20秒，生成EPO cDNA
和TPO cDNA。它们分别被克隆到克隆载体pGEM-T(Promega公司)
上。即，将PCR产物从1％琼脂糖凝胶中洗脱出来，并连接到pGEM-
T上，然后导入到E.coli NM522中。将转化的E.coli在含有X-gal/IPTG
的LB-氨苄青霉素平板上培养过夜。质粒从白色菌落中纯化并用限制
性酶SacI和SacII处理，以便筛选含有各自cDNA的菌落。该步骤获
得的载体命名为pGEM-EPO和pGEM-TPO，经测序后用于下列程序
的模板。
采用BM公司高保真的Taq系统，以pGEM-TPO为模板，EL1
和T2为引物(各50pmol)，在反应条件为50℃退火40秒、72℃延伸
45秒以及94℃变性20秒下，共进行30次循环的PCR，从而获得本
发明中所用的TPO的CTP基因LTP。引物EL1含有来自限制性酶StμI
识别位点的基因，该位点靠近EPO的3’端，同时含有LTP基因5’
端的一部分。在1％琼脂糖凝胶中鉴别出约534bp的基因片段(LTP)。
该基因编码TPO羧基端178个氨基酸(氨基酸位置176-353)(附图1)。
另一方面，采用pGEM-EPO为模板以及引物EP1和EP2进行PCR
扩增，只产生EPO基因。
由此获得的EPO和LTP基因分别用限制性酶StuI处理。然后采
用Qiagen抽提试剂盒纯化EPO和LTP基因的片段并用连接酶连接。
以EPO和LTP基因的连接产物为模板，采用引物EP11和L2(各50
pmol)和BM公司高保真的Taq系统在反应条件为55℃退火40秒、72
℃延伸60秒以及94℃变性20秒下，共进行30次循环的PCR，生成
所需的含有约1113bp的融合基因ELTP。将该基因以上述相同方式克
隆到克隆载体pGEM-T中，然后测序(pGEM-ELTP，附图3a)。
通过合成和自身引导PCR程序获得STP基因。合成的DNA片段
为ES1、S2、S3和L2。4种DNA片段各取1μl(50pmol/μl)，采
用BM公司高保真的Taq系统在反应条件为55℃退火40秒、72℃延
伸40秒以及94℃变性20秒下，共进行15次循环的PCR。在1％琼脂
糖凝胶上鉴定了为约50bp的基因片段(STP基因)。该基因编码TPO
羧基端的17个氨基酸(氨基酸位置337-353)(附图1)。
以pGEM-EPO为模板，采用引物EP11和EP2以上述的相同方式
进行PCR扩增，只生成EPO基因。将该EPO基因和STP基因同时用
作模板，并以EP11和L2为引物，采用BM公司高保真的Taq系统在
反应条件为58℃退火40秒、72℃延伸50秒以及94℃变性20秒下，
共进行30次循环的PCR，最终生成所需的约630bp的融合基因ESTP
基因。将该基因克隆到克隆载体pGEM-T上，并测序(pGEM-ESTP，
附图3b)。
实施例2：表达载体peDNA-ELTP和pcDNA-ESTP的构建
Invitrogen公司的pcDNA3-1载体用作表达载体。克隆到pGEM-T
载体上的ELTP和ESTP基因分别在末端含有HindIII和BamHI识别
位点。pcDNA3.1、pGEM-ELTP和pGEM-ESTP分别用限制性酶HindIII
和BamHI处理。线性pcDNA3.1、ELTP和ESTP基因在琼脂糖凝胶
上用Qiagen提取试剂盒分离。在pcDNA3.1与ELTP或ESTP连接后，
将连接产物导入E.coli NM522中。将质粒从转化的E.coli在LB-氨苄
青霉素平板上经培养过夜后所形成的菌落中分离出来，并用限制性酶
HindIII和BamHI处理。然后含有ELTP或ESTP基因的菌落经1％琼
脂糖凝胶电泳后被筛选出来。这些质粒分别命名为pcDNA-ELTP和
pcDNA-ESTP(附图3)。
实施例3：CHO细胞的转化及表达
将CHO细胞(DG44)在60mm细胞培养皿中培养至40-80％汇
合(1-4×105细胞/60mm平皿)。将3μl的superfection试剂(BM
公司)和97μl的细胞培养基(带有基质的α-MEM、无血清、无抗体)
混合均匀，然后其中加入质粒pcDNA-ELTP(＝0.1μg/μl，约2μg)
和具有dhfr基因的载体pLTRdhfr26(ATCC37295，0.2μg)。室温下
混合物反应5-10分钟，然后加入如上所制备的细胞中。一天后，用含
有G418的培养基(无基质的α-MEM，10％FBS)更新原培养基，含
量为500μg/ml。然后用含有500μg/ml G418的培养基连续更新培养
基7-10天，在此期间，无G418抗性基因的细胞和阴性对照细胞被完
全杀死。将筛选出的细胞在G418培养基上充分培养，并用BM公司
的EPO ELISA试剂盒鉴定所表达的ELTP蛋白。相同方法应用到
pcDNA-ESTP。
实施例4：被表达融合蛋白的纯化
采用抗EPO单克隆抗体(R&D System公司)制备用于分离和纯
化的亲和树脂，方法如下：
将0.3g CNBr活化的琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)在1mM HCl
中溶胀20分钟，然后将树脂转移至柱内，并用1mM HCl洗涤。用4ml
偶联缓冲液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)洗涤树脂，立即与
包含在4ml偶联缓冲液中的抗EPO单克隆抗体(500μg/瓶)在管内
混合，并室温下震荡试管反应2小时。用封闭缓冲液(0.2M甘氨酸，
pH8.0)更新后，震荡试管使树脂在室温下反应2小时。然后，将树
脂按序用6.5ml偶联缓冲液、6.5ml醋酸缓冲液(0.1M醋酸，0.5M NaCl，
pH4)以及6.5ml偶联缓冲液洗涤。采用如此获得的树脂制备柱子，
并按如下所述进行纯化。
将细胞在无血清培养基中培养一天，并采用Centriprep
(Millipore，截留分子量10,000)将培养基浓缩约5倍。将该浓缩液
以20ml/小时流速装载到预先用PBS平衡过的柱上，用PBS再次洗脱。
将洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH2.8)施加到柱上，并将洗脱液立即
用1M Tris滴定至pH7.5。纯化ELTP和ESTP的SDS-PAGE结果显示
在附图4中。用SDS-PAGE和银染分析，纯度至少为97％。
实施例5：生物分析方法测定活性
将苯肼每天一次以60mg/kg的剂量注射到小鼠中，连续2天。3
天后分离出膨大的脾脏并用均质机研磨，得到脾细胞。脾细胞稀释至
6×106细胞/ml，然后将100μl细胞液转移入96孔板的每个孔中。将
0-500mU/ml的EPO标准品和100mU/ml的表达融合蛋白加入到每个
孔中，并让板在CO2培养箱中37℃放置22小时。每孔中加入50μl
二甲基3[H]-胸苷(20μCi/ml)，在相同培养箱中反应2小时，然后
将每孔反应液吸附到玻璃滤纸(Nunc 1-73164)上。滤纸用生理盐水
洗涤三次，然后用β计数器测定每个滤纸上放射量。融合蛋白、ELTP
和ESTP的活性显示与EPO标准品活性相当或更高，这表明融合进EPO
的羧基端不抑制EPO自身的活性。
实施例6：药代动力学实验
对小鼠进行药代动力学实验以测定所制备的候选物质是否真正延
长了体内半寿期。将根据实施例5的方法纯化的融合蛋白以20单位/
小鼠的量静脉施用给4只小鼠。为了鉴定血液中的定时浓度，每间隔
30分钟从小鼠中取出血液，并采用宝灵曼(BM)公司的EIA试剂盒
测定浓度。结果显示在附图5中。正如附图5所见，ETLP和ESLP分
别比对照EPO的半寿期显示长约三倍(EPO的半寿期为22分钟，ELTP
为60分钟，以及ESTP为57分钟)。
工业实用性
根据本发明的融合蛋白由于具有增加碳水化合物链的氨基酸，但
又不影响EPO的固有活性，显著增加了EPO体内半寿期。进一步，
由于融合肽、LTP或STP体内早已存在，因此当融合蛋白给人体施用
时不会带来任何抗原性问题。
序列表
<110>第一制糖株式会社(Cheil Jedang Corporation)
<120>具有增强红细胞生成素体内活性的融合蛋白
(Fusion protein having the enhanced in vivo activity of
erythropoietin)
<130>SPI021578-09
<160>14
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>178
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(178)
<223>人血小板生成素(TPO)第176-353位的氨基酸
<400>1
Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln
35 40 45
Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser
50 55 60
Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn
65 70 75 80
Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala
85 90 95
Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn
100 105 110
Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln
115 120 125
Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln
130 135 140
Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln
165 170 175
Glu Gly
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(17)
<223>人血小板生成素(TPO)第337-353位的氨基酸
<400>2
Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
1 5 10 15
Gly
<210>3
<211>370
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>红细胞生成素(EPO)与人血小板生成素的羧基端肽(LTP)形
成的融合蛋白(ELTP)
<4400> 3
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr
195 200 205
Leu Ash Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe
210 215 220
Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln
225 230 235 240
Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser
245 250 255
Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His 6lu Leu Leu Asn
260 265 270
Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala
275 280 285
Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn
290 295 300
Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln
305 310 315 320
Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln
325 330 335
Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr
340 345 350
Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln
355 360 365
Glu Gly
370
<210>4
<211>209
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>红细胞生成素(EPO)与人血小板生成素的羧基端肽(STP)形
成的融合蛋白(ESTP)
<400>4
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
195 200 205
Gly
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有与EPO cDNA末端序列互补的核苷酸序列的引物EP1
<400>5
atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg 29
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有与EPO cDNA末端序列互补的核苷酸序列的引物EP2
<400>6
gtcccctgtc ctgcaggcct 20
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有与TPO cDNA末端序列互补的核苷酸序列的引物T1
<400>7
atggatctga ctgaattgct cctc 24
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有与TPO cDNA末端序列互补的核苷酸序列的引物T2
<400>8
ttacccttcc tgagacagat tctggga 27
<210>9
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增以获得所需基因LTP的引物EL1
<400>9
gaggcctgca ggacagggga cgccccaccc accacagctg tcc 43
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增以获得所需融合基因ELTP和ESTP的引物EP11
<400>10
taagcttatg ggggtgcacg aatgt 25
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增以获得所需融合基因ELTP和ESTP的引物L2
<400>11
tggattctta cccttcctga gacagattc 29
<210>12
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR改组以获得所需基因STP的引物ES1
<400>12
aggggaggcc tgcaggacag gggaccctct tctaa 35
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR改组以获得所需基因STP的引物S2
<400>13
gtgggtgtag gatgtgttta gaagagg 27
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR改组以获得所需基因STP的引物S3
<400>14
tacacccact cccagaatct gtctc 25