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用于制备遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞的方法， 以及将其用于生产异源结合蛋白的用途
    【发明领域】

    本发明总体上涉及遗传工程和抗体生产领域。具体地讲，它涉及遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞的制备，所述淋巴细胞具有分化成更成熟的淋巴系细胞的能力，并且涉及将其用于生产任何异源抗体或结合蛋白的用途。

    【发明背景】

    业已证实单克隆抗体对于疾病的诊断、预防和治疗来说都是有效的制剂(Glennie和Johnson，Immunol.Today，21，p.403-410，2000)。这是由于它们通过其可变区非常特异地结合在靶分子(抗原)上的特定表位上的独特能力，同时，还由于能通过它们的恒定区结构域介导效应物功能(Frazer和Capra，Fundamental Immunology，W.E.Paul(Ed.)，Fourth Edition，p.37-74，1999)(图1)。这使得单克隆抗体能够特异性地鉴定大分子的复杂混合物中的独特抗原，并且产生针对所述靶分子的效应物功能。

    抗体(或免疫球蛋白)由通过二硫键连接在一起的两个相同的重(H)链和轻(L)链糖蛋白(图1)组成。每一个H和L链包括在不同的抗体之间是相同的N-末端可变区和C-末端恒定区，该区在属于相同的免疫球蛋白同种型的不同抗体中是相同的(图1)。H和L链可变区的组合，产生了抗体的抗原结合袋，并且决定其特异性(或独特型)，而所述恒定区决定其同种型(Frazer和Capra，s.a.)。由于VH和VL结构域是由被称为V(可变地)，D(多样性；仅存在于H链基因座上)和J(结合)基因片段的多个基因片段编码的这一事实，导致了免疫球蛋白的可变性(Tonegawa，Nature，302，p.575-581，1983)(图1)。在B淋巴细胞分化期间，在每一个细胞中随机选择V，D和J基因片段，进行V(D)J重组的位点特异性重组过程，该过程能组装所述基因片段，以便产生VH或VL结构域的新的编码区(Grawunder等，Curr.Opin.Immunol.，10，p.172-180，1998)。由于所述多个V，D和J基因片段，以及基因片段结合中的不精确性，免疫系统每天产生的数百万个B淋巴细胞，能够产生具有不同V区特异性的大量所有组成成分(repertoire)(Melchers等，Curr.Opin.Immunol.，7，p.214-227，1995)。

    在进化期间，在不同的物种之间免疫球基因具有微小的差别，以便不同物种之间的抗体的恒定区有所不同。其后果是，来自一个物种的免疫球蛋白如果被导入另一个物种的血管系统，最常见是免疫原性的。

    因此，异种单克隆抗体的免疫原性限制了它们在治疗人类疾病方面的应用，因为患者接触异种抗体可能导致负面作用，甚至是急性毒性，或者可能简单地导致所使用的抗体的中和与清除，从而减弱其药理学效力(Clark，Immunol Today，21，p.397-402，2000)。相反，给患者施用完全的人抗体，通常不会导致任何上述并发症。

    业已偶尔从各个患者的血液中分离了人类抗血清或人类多克隆抗体，以便治疗或预防罕见的，并且通常是高度致命的疾病，如埃博拉病毒感染，或者，用于治疗接触蛇毒之后的个体。不过，由于多种原因，这种方法对于治疗影响较大群体的疾病是不实用的。另外，出于伦理考虑，不可能为了生产单克隆抗体而用特定抗原对人类进行免疫，因为人体内产生需要的抗体的B系细胞，是在次级淋巴器官中发育和存留的，并且不能方便地获得。另外，治疗性抗体，特别是用于癌症治疗的抗体的很多潜在的靶抗原是人类蛋白(Glennie和Johnson，s.a.)。在正常环境下，人类不会产生针对所述靶的抗体。因此，最近主要的努力一直集中在建立不需要人类免疫系统的开发治疗性人类或人源化抗体的方法。

    最简单的方法，利用标准遗传工程技术由分泌具有所需特异性的异种抗体的杂交瘤克隆编码H和L链的可变区(VH和VL结构域)的cDNAs。然后将克隆的可变区cDNAs克隆到含有人类恒定区基因的合适的大肠杆菌，酵母，昆虫或哺乳动物细胞表达载体中。这样可以生产具有与人类CH和CL恒定区结构域融合的异种VH和VL的单克隆抗体，从而得到人源化抗体。不过，该方法的缺陷是，异种VH和VL结构域与人类CH和CL恒定区的融合，可能导致减弱了的亲和力或改变了的特异性。另外，所述人源化抗体的异源VH和VL在人体内仍然是免疫原性的，因为V结构域的构架区在不同物种之间是不同的。在某些场合下，这一问题可以通过将介导直接接触抗原的各个互补性决定区(CDRs)嫁接到H和L链可变的人类构架区上而得到克服(Fiorentini等，Immunotechnology，3，p.45-59，1997)。不过，由于未知原因，CDR嫁接通常仍然会导致免疫原性抗体的产生和/或亲和力和特异性的减弱/丧失。

    因此，为了制备完整的人类免疫球蛋白，近年来业已开发了两种不同的并且更有效的方法。

    第一种方法基于单链可变区(scFv)的表达(展示)，所述scFv由位于大肠杆菌的丝状噬菌体表面上的一个VH和VL结构域组成(Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21，p.371-3818，2000)(还可参见EP 0 585 287B1，EP 0 605 522B1)。可以构建含有VH和VL链的各种所有组成成分的噬菌体展示文库，可以构建包括不同的VH和VL链的所有组成成分的噬菌体展示文库，并且，通过重组噬菌体与固定化抗原的结合，可以从所述文库中分离各个scFv特异性(McCafferty等，Nature，348，p.552-554，1990)。

    源于天然人类所有组成成分的scFv结合蛋白的噬菌体展示文库具有这样的缺陷：它局限于包含在所述所有组成成分中的特异性，因此，很多人类抗原的特异性最常见的是不存在于所述文库中。尽管可以利用组合的或合成的噬菌体展示文库来克服这一问题，该技术的一般缺陷是，通常不能分离特定抗原的高亲和力结合蛋白。因此，很大的精力一直投入在通过费力的克隆或位点特异性重组方法，构建非常大的原始文库。

    估计最佳组合或合成的文库含有109-1011个潜在的不同结合位点，并且可以产生1-200nM范围内的结合特异性(Hoogenboom和Chames，s.a.)。不过，在体内，在生发中心B细胞中的免疫球蛋白亲和成熟期间，可以达到的在皮摩尔范围(10-12M)内的较高的亲和力，只能在采用额外的烦琐的遗传工程方法时才能产生，包括V基因混排，易错PCR，使用大肠杆菌突变菌株等。

    无论噬菌体展示文库筛选方法的结果是什么，最终都需要将编码scFv结合位点的基因重新克隆到合适的表达载体中，用于表达人类免疫球蛋白，并且需要将所述载体稳定地转入可以大规模生产人类抗体的细胞表达系统中，这是另一个耗费时间和昂贵的过程。

    用于生产完全的人单克隆抗体的第二种方法，是基于具有人类免疫球蛋白H和L链基因座的构建体的转基因小鼠的用途(Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.，6，p.561-566，1995)。将所述人类免疫球蛋白转基因最终转育到不再能组装内源鼠抗原受体基因的遗传背景中。在所述小鼠中，B系细胞的发育取决于来自人类转基因构建体的免疫球蛋白H和L链的表达，所述小鼠的B系细胞只能产生人类抗体。该技术存在三种变化形式。在一种变化形式中，将人类免疫球蛋白微基因座用作转基因，通过它只能产生人类抗体的有限的所有组成成分(Fishwild等，Nat.Biotechnol.，14，p.845-851，1996)(还可参见EP 0 546 073B1，US 5,874,299)。在第二种变化形式中，使用了包括克隆到酵母人工染色体中的可变区基因片段的大部分的人类IgH和IgκL链基因座的大的区域。在第三种变化形式中，将含有完整的人类免疫球蛋白H和L链基因座的人类染色体片段整合到产生了所谓转染色体动物的小鼠种系中。具有所述复合转基因的小鼠产生了实际上正常的人类免疫球蛋白的所有组成成分。

    对所述转基因或转染色体小鼠进行免疫，产生了导致完全的人抗体产生的体液免疫应答。这种制备人类抗体的方法与噬菌体展示文库技术相比具有一个重要优点：由于人类免疫球蛋白在生发中心B细胞中可以经历作为免疫应答进程的正常过程的亲和力成熟，可以制备针对特定抗原的高亲和力抗体。

    不过，该技术存在一个重大缺陷：首先，转基因或转染色体小鼠的制备是非常麻烦，困难和耗费时间的，并因此是费用较高的。整个过程需要制备至少四种不同的小鼠株：两种株在内源IgH和IgL链基因座内具有定向破坏，两种株携带编码部分或全部人类IgH和IgL链基因座的转基因或转染色体。另外，所有四种小鼠株都必须同时繁育，得到了具有携带内源IgH和IgL链基因座的纯合破坏的基因型，与此同时，携带编码异源IgH和IgL链的人类转基因。不同剔除和转基因小鼠株的制备，它们的筛选以及最终的杂交是花费时间的过程，它通常需要至少两年时间，即使对每一个步骤都进行全面优化也是这样。因此，培育异种小鼠株所需要的较长的时间框架，给设计含有修饰过的转基因构建体的不同的小鼠株留下了很小的灵活性。因此，这种技术不适合现有抗体的修饰和改进(例如对它们的亲和力进行改进)。因为该方法需要很长的时间来制备生产一种抗体的新型转基因小鼠株。因此，这种技术基本上局限于人类抗体的从头制备。

    根据以上事实，明显存在对综合了噬菌体展示系统的优点(即在制备人类抗体方面的速度和灵活性，以及修饰和改进现有抗体特性的能力)，和人类免疫球蛋白转基因小鼠技术的优点(即由于在免疫系统中进行的亲和力成熟而获得高亲和力抗体的能力，以及具有生理学和天然结构特征的抗体的产生)的完全的人抗体产生技术的需要。

    发明概述

    本发明提供了制备脊椎动物前体淋巴细胞的手段和方法，可将所述方法用于生产任何异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段。具体地讲，本发明提供了对脊椎动物前体淋巴细胞进行遗传修饰并实现将它们在体外或体内分化成更成熟的淋巴系细胞的手段和方法，以便制备能够产生所有形式的异源免疫球蛋白样多肽的淋巴细胞，可以根据需要表现的特定活性或特征对所述多肽进行考虑和设计。另外，本发明提供了适合实施本发明的遗传元件和构建体，以及特殊的淋巴细胞。

    因此，本发明的方法在制备淋巴系细胞方面具有很大灵活性，所述细胞具有在短时间内表达几乎所有类型的抗体或结合蛋白的潜力。与此同时，将所述细胞移植到相容性脊椎动物宿主中，在这里使所述细胞参与诸如亲和力成熟的特殊免疫功能的可能性，使得能够利用所述免疫系统的选择性制备对任何特定抗原性化合物或组合物具有高的结合亲和力的抗体和免疫球蛋白样或甚至是人工结合蛋白。

    【附图说明】

    图1是免疫球蛋白结构和遗传学的示意图。抗体或免疫球蛋白(Ig)是糖蛋白，在它们的单体形式下，由通过二硫键共价偶联的两个相同的重链(IgH)和两个相同的轻链(IgL)组成。根据抗体的同种型，每一个IgH链包括一个N-末端可变区(VH)和3-4个恒定区结构域(CH1-3，或4)。另外，在第一和第二CH结构域之间包括铰链区的抗体赋予了异四聚体糖蛋白的两个抗原结合臂灵活性。轻链仅由一个N-末端可变(VL)和一个C-末端恒定结构域(CL)组成。两个IgH和IgL链的排列，导致了具有两个抗原的高度可变结合位点的Y型单体抗体，它是通过IgH和IgL链可变区的缔合形成的。在比较不同抗体之间的V区时，在所谓高变区上的可变区存在很大不同。这种可变性是由于以下事实：V区不是由单个基因编码的，相反，对于VH区来说，是由多个不同的V，D，和J基因片段编码的，从中随机选择，然后重组，以便形成IgH链的可变编码区(参见附图的左上部分)。这一过程被称为V(D)J重组，并且是在早期B细胞发育期间发生的。IgL链基因座只包括多个不同的V和J基因片段，通过随机的V到J重排产生了可变区的编码区(参见附图的右上部分)。来自相同亚型(同种型)的抗体的所述恒定区结构域，决定了所述抗体的效应物功能，并且在不同的抗体之间没有差别。不过，在免疫应答过程中，可以诱导各个B淋巴细胞，以便改变要表达的抗体的同种型。在这种情况下，在位于不同恒定区基因的5’末端的转换区之间发生了体细胞DNA重组事件(在附图的下部通过恒定区基因的示意图上的点表示)。例如，μ-和ε-转换区之间的重组，可能导致来自Cμ-Cγ4的所有恒定区基因的缺失，正如在附图中所示出的。其后果是，将VDJ可变编码区带到了Cε恒定区附近，导致了IgE同种型抗体的表达。

    图2表示小鼠体内的B细胞发育。小鼠体内B淋巴细胞的分化可以细分成不同的阶段，这些阶段可以进行表型和基因型细分。存在于野生型小鼠骨髓中的最早定型的前体B(preB)细胞，源于多能造血干细胞(HSC，左侧)，它不能表达所有细胞系特异性标记(被称为Lin-)，不过，以干细胞抗原1的表面表达为特征(Sca-1)。从它开始，制备了preB细胞，它在两个IgH链等位基因上通常携带有DJH重排，并且，以表面表达B220(泛-B细胞标记)和c-kit为特征。在此阶段，所有其他Ig基因座，通常仍然是种系(GL)构型。DJH重排的PreB细胞被命名为preB-I细胞，并且能够在特定条件下在组织培养中扩增。在所述细胞中的下一个重排事件，涉及重排成预先存在的DJH元件的VH基因片段之一。如果这种重排导致了任何等位基因的生产性重排，使μH链可以表达，所述细胞接受增殖性信号，扩增并且分化成preB-II细胞。所述细胞丧失了c-kit表面标记的表达，但是，获得了CD25的表达。在任何IgL链等位基因上的其他生产性平台，导致了分化成能表达膜结合IgM的不成熟B细胞。这些不成熟的未接触抗原的B细胞可以离开骨髓，迁移到外周淋巴器官中，在那里，它们可能最终会遇到抗原。在免疫应答过程中，所述B细胞随后可分化成抗体分泌性浆细胞，在此期间，可能在IgH恒定区基因座上发生另一个DNA重组过程(类别转换重组)，导致由浆细胞分泌的抗体同种型的改变。

    图3是本发明用于制备人源化前体B淋巴细胞(HupreB′s)的方法的示意图。鼠DJH重排的preB-I细胞可以从交配后14-19天的小鼠的胎肝中分离，或者从成年小鼠的骨髓中分离(步骤1)。所述细胞的长期培养需要特殊的组织培养条件，包括基质细胞饲养层和/或诸如IL-7(白介素7)的某些生长因子的存在。在所述条件下，preB-I细胞不会有进一步分化(步骤2)。为了将所述细胞用于生产异源抗体，必须防止在所述细胞中发生其他生产性内源Ig基因重排。例如，这一目的可以通过在IgH和IgL链基因座的两个等位基因上导入顺式作用突变而实现(步骤3b)，或者通过导入破坏Ig基因的其他V(D)J重组的反式作用突变，例如，通过缺失两个重组激活基因RAG-1或RAG-2(步骤3a)之一而实现。然后可以用重组逆转录病毒稳定地转导所述后一种细胞，对于人类来说，这种转导能够介导异种IgH和IgL链的表达(步骤4a)。还可将所述逆转录病毒用于稳定转导在内源Ig基因座上携带有顺式作用突变的前一种细胞。另外，携带有顺式作用突变的preB细胞对于Ig基因重排来说仍然是感受态的。因此，可以用异源种系Ig基因座稳定地转染所述细胞，所述基因座可能发生V(D)J重排，并且通过这种重排产生新的异种抗体(步骤4b)。如果所述异源或异种IgH和IgL链基因是来自人类，所述preB-I细胞将仅具有表达完全的人抗体的潜力，并因此被称为HupreB细胞。

    图4是表示利用阳性-阴性基因导向载体导向于内源基因座的示意图。为了导向于内源基因座，将位于该基因座上游大约1kb的基因组区(短臂)和位于该基因下游的大约3kb的区(长臂)克隆到空的阳性-阴性导向载体上。作为一种例子，示出了DJH3重排IgH链基因座的导向策略。将该构建体转染到preB-I细胞中，并且选择和最终筛选通过同源重组进行的所述导向载体的整合。所述阳性选择标记允许选择所述构建体向转染过的细胞基因组中的稳定整合。所述阴性选择标记的表达对所述细胞有毒性，并且只有在稳定整合时丧失了所述阴性选择标记的情况下细胞才能存活，所述丧失是通过在正确基因座上的两个同源重组事件发生的。内源基因座和导向构建体之间的发生同源重组的两个可能的位点通过阴影线表示。如果通过所述同源重组事件发生了所述构建体的整合，所述阳性药物选择标记取代了位于具有同源性的短臂和长臂之间的内源区。如果如本文所述在所述阳性选择标记的侧翼有两个loxP重组信号，cre重组酶的瞬时表达，可能介导所述选择标记的缺失，以便可以将同一个导向构建体用于导向于相同基因座的第二个等位基因。

    图5a表示用于构建IgH链基因座导向载体的克隆方法。在这里，以DFL16.1-JH4重排基因座为例，示出了DJH重排鼠IgH链基因座的一种可能的导向构建体的详细的克隆方法。其他DJH重排的IgH链基因座可以用相同的导向载体导向。在所述内源基因座上示出了独特的限制位点(上部构建体)，并且示出了通过PCR方法从基因组DNA克隆到空的阳性-阴性导向载体pBSL-flneo-DT4中的1523-3215bp的片段(参见图6b，选择pBSL-flneo-DT4作为多种不同的空导向载体的一种例子)。将短臂和长臂的PCR引物设计成包括用于将所述片段克隆到BSL-fineo-DT4上的独特的和相容的限制位点上的片段的NotI和AscI限制位点。在底部示出了最终定向构建体的组构，并且标出了选择的限制位点的位置。

    图5b表示用于构建IgκL链基因座导向载体的克隆方法。在这里示出了用于构建一种可能的导向构建体的详细克隆方法，这种构建体用于被设计成用来定向缺失所有种系JK基因片段的鼠IgκL链基因座。在所述内源基因座上示出了独特的限制位点(上部构建体)，并且示出了通过PCR方法从基因组DNA克隆到空的阳性-阴性导向载体pBSL-fineo-DT4上的739-3379bp的片段(参见图6b，选择pBSL-flneo-DT4作为多种不同空的导向载体的一种例子)，如图5a所示，将用于短臂和长臂的PCR引物设计成包括用于将短臂和长臂克隆到所述片段克隆到pBSL-flneo-DT4的相容性限制位点上的NotI和AscI限制位点。在底部示出了最终的定向构建体的组构，并且标出了选择的限制位点的位置。

    图5c表示用于构建RAG基因座导向载体的克隆方法。在这里示出了用于构建鼠RAG基因座的一种可能的定向构建体的详细克隆方法，该构建体用于被设计成用来定向缺失RAG-1基因。小鼠体内的RAG基因座位于2号染色体上，并且包括两个连锁非常紧密的基因RAG-1和RAG-2，它们都是Ig基因重排所必需的。这两个基因的开放读框(ORFs)是由单个外显子编码的，不过，将每一个启动子元件下游的短的未翻译的外显子(用三角形表示)剪接成一个含有完整RAG ORFs的大的外显子。在所述内源基因座上示出了独特的限制位点(上部构建体)。如图所示，通过PCR方法，分别将位于RAG-1 ORF上游和下游的1078和2950bp的基因组区从基因组DNA上克隆到空的阳性-阴性导向载体pBSL-flneo-DT4上(有关pBSL-flneo-DT4，参见图6b，选择它作为多种不同的空的导向载体的一种例子)。如图5a所示，将短臂和长臂的PCR引物设计成包括用于将短臂和长臂克隆到pBSL-flneo-DT4的相容性限制位点的NotI和AscI限制位点，在下部示出了最终定向构建体的组构，并且示出了选择的限制位点的位置。

    图6a表示基于用于基因导向的阳性-阴性载体的有关DT-α和DT-α(tox176)的详细克隆方法(预备步骤)。制备空的导向载体的先决条件是，延伸诸如pBluescript的常规克隆质粒的多克隆位点(MCS)，以便在所述多接头上增加额外的有用的限制位点，然后可将它用于插入阳性和阴性选择标记的表达盒，以及通过同源重组插入内源基因座的导向所必需的基因组区。在这里示出了将具有额外限制位点的额外寡聚体插入pBluescript的MCS，以便制备具有延长的多接头的质粒pBSL。将这种构建体用于插入β-肌动蛋白启动子驱动的表达盒，该表达盒是用于野生型白喉毒素α或它的减毒形式，表示为DTα(tox176)(参见例5b，步骤2)。将具有延伸的多克隆位点的这两种构建体分别命名为pBSL-DT4(底部，左侧)和pBSL-DT4tox176(底部，右侧)。如图所示，用XbaI和BglII限制位点将白喉毒素表达盒克隆到pBSL上。还示出了减毒的DTtox176表达盒所特有的诊断性NheI限制位点。

    图6b表示用于基因导向的基于DT-α和DT-α(tox176)的阳性-阴性载体的详细克隆方法(最终的克隆步骤)。披露了空的阳性-阴性导向载体的克隆，所述载体包括新霉素，潮霉素B，或嘌呤霉素作为阳性选择标记，并且包括野生型白喉毒素α表达盒。可以将相同的克隆方法用于含有DT-α(tox176)的表达盒的载体。示出了用于片段克隆和构建体线性化的限制酶。将所有阳性选择标记设计成其侧翼为loxP位点(floxed)，该位点可以被cre重组酶识别。尽管floxed新霉素表达盒可以从现有载体pGL2-neo(m)+(DSM 14705)中再次克隆，floxed潮霉素B和floxed嘌呤霉素表达盒需要分两个步骤插入。为此，将含有通过MluI位点隔开的两个loxP位点的合成DNA寡聚体插入pBSL-DT4，以便制备pBSL-DT4-2loxP，如图所示。在最后的步骤中，将潮霉素B和嘌呤霉素抗性的表达盒通过PCR方法克隆到pBSL-DT4-2loxP的独特的MluI位点。

    图7a表示人IgH链逆转录病毒表达载体的示意性组构。允许表达人IgH链蛋白的重组逆转录病毒载体具有包括Ig基因座启动子和增强子元件，以及IgH链的可变区和恒定区结构域的编码区的标准设计。IgH表达盒的转录方向与逆转录病毒5′LTR启动子元件的方向相反，以便赋予基于Ig特异性启动子和增强子元件的B细胞特异性表达模式。所述表达盒包括鼠VH启动子，具有编码IgH可变区的VDJ外显子的前导(L)序列，鼠内含子重链增强子(EμH)，编码异源IgH链的恒定区的外显子，编码免疫球蛋白的跨膜区的外显子，以及来自鼠IgH 3′α增强子的元件。可以利用产生相容性突出末端的限制酶，将不同的L-VDJ区，甚至是L-VDJ区的文库克隆到IgH表达载体的独特的BamHI和HindIII限制位点。由于所述标准设计，可以用简单的分子生物学技术置换恒定区外显子或增强子元件(如图中所示)。

    图7b表示人IgκL链的逆转录病毒表达载体的示意性组构。与图7a所示载体相同，允许表达人IgκL链蛋白的重组逆转录病毒载体具有包括IgL链特异性基因座启动子和增强子元件，以及IgκL链的可变区和恒定区结构域的编码区的类似标准设计。IgκL表达盒的转录方向与逆转录病毒5′LTR启动子元件的方向相反，以便赋予基于Ig特异性启动子和增强子元件的B细胞特异性表达模式。如图所示，所述表达盒包括鼠Vκ启动子，具有编码IgκL可变区的VJ外显子的前导(L)序列，鼠κ内含子增强子(κiE)，编码异源IgL链的恒定区的外显子，来自鼠IgK3′增强子(K3′E)的元件。另外，逆转录病毒IgκL链表达载体包括完整的嘌呤霉素表达盒，使得能够选择稳定转导的preB细胞。利用产生相容性突出末端的限制酶，可以将不同的L-VJ区，甚至是L-VJ区的文库，克隆到IgH表达载体的独特的BamHI和HindIII限制位点。由于所述标准设计，可以利用简单的分子生物学技术取代修饰过的恒定区外显子或增强子元件(如图所示)。

    图8表示用编码异源IgH和IgL链的逆转录病毒载体对鼠基质细胞/IL7依赖性preB细胞进行逆转录病毒转导的程序。如图所示，可以用编码IgL链和IgH链的逆转录病毒表达载体顺序转导具有影响内源Ig基因重排的长期增殖的基质细胞/IL7依赖性preB细胞系(参见图3)。在用第一异源IgL和IgH链表达逆转录病毒构建体顺序转导之后，所述细胞具有在细胞在体外和体内分化时表达异源抗体的潜力(参见图10)。

    图9是可以分离可变区编码区的来源的示意性概况图。如图所示，可变区编码区可以从很多不同的来源分离。所述逆转录病毒载体的标准设计，使得能够从现有的有用的单克隆抗体克隆编码诸如单特异性的逆转录病毒载体。在转导所述载体，并且将转导过的细胞移植到小鼠体内时(参见图10)，单特异性然后可能经历亲和力成熟。另外，可以从来自健康的，患病的，或免疫过的患者体内的外周血淋巴细胞(PBLs)中分离完整的VDJ和VJ文库，然后克隆到IgH和IgL链逆转录病毒表达载体中。事实上，甚至可能制备完全合成的VH和VL区所有组成成分，可将它克隆到逆转录病毒Ig表达载体上，然后可以对它进行稳定转导，并且在体内进行功能性选择(参见图10)。

    图10表示将HupreBs移植到免疫缺陷型小鼠体内，以便生产完全的人单克隆抗体。与正常的鼠preB细胞类似，HupreB细胞可以移植到鼠宿主体内，在这里，它们能够参与所述宿主的免疫应答。如果将HupreB细胞移植到缺少内源B细胞的免疫缺陷型宿主体内，能够产生的唯一的抗体，是来自移植的HupreB细胞的异源(人类)抗体。有很多种不同的宿主株可用于移植HupreB细胞。例如，缺少B和T淋巴细胞的株是RAG-1-和RAG-2-缺陷型和scid小鼠株。为了能够诱导涉及源于移植的HupreB细胞的B淋巴细胞的T细胞依赖性免疫应答，可以分离T辅助淋巴细胞群，并且共同移植到所述小鼠体内(左侧)。另外，通过仅移植HupreB细胞可以重建仅缺乏B淋巴细胞的小鼠株，如JH缺陷型小鼠(右侧)。在移植之后，一旦重建了外周B和T淋巴细胞区室，可以用针对任何需要的抗原的常规免疫方案对所述小鼠进行免疫。然后可以将源于所述小鼠的浆细胞永生化，例如，通过与骨髓瘤细胞融合，以便产生能够永久性分泌对注射的免疫原性化合物或组合物特异的异源(人类)单克隆抗体的(杂交瘤)细胞。

    图11a表示用于抗-细胞程序死亡基因bcl-2的组成型表达的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤)。从连续增殖的体外preB细胞培养物中除去IL-7，导致了preB细胞的分化，不过，与此同时，还导致了细胞程序死亡的诱导。通过抗-细胞程序死亡基因，如bcl-2的组成型表达，能够抑制这种细胞程序死亡。为了制备bcl-2的可选择的逆转录病毒表达载体，用潮霉素B开放读框将鼠bcl-2cDNA依次克隆到双重基因表达载体piRES中。该载体包括其侧翼为两个多克隆位点的内部核糖体进入序列，可以将两个不同的基因克隆到它里面。这使得能够从一个启动子在哺乳动物细胞中表达两个基因。示出了用于将bcl-2ORF和潮霉素B选择标记基因克隆到piRES载体中，以便制备pBcl2-IRES-hygroB载体。

    图11b表示用于组成型表达抗-细胞程序死亡基因bcl-2的逆转录病毒表达载体的构建(最终的克隆步骤)。在组装源于bcl-2-IRES-潮霉素B盒的CMV启动子之后，以SalI-ClaI片段形式，将来自pBcl2-IRES-hygroB载体的完整的双重表达盒，重新克隆到逆转录病毒转移载体pLIB上，如图所示。由此产生了重组逆转录病毒构建体pLIB-Bcl2-IRES-hygroB，可将这种构建体用于稳定转导preB细胞，并且赋予bcl-2和对潮霉素B的抗性的同时表达。

    图12a解释了用于表达人IgH链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤I)。将各种IgH启动子和增强子元件，以及不同的可变区和恒定区结构域的编码区依次克隆到诸如质粒pLIB的逆转录病毒转移载体上。这种质粒含有逆转录病毒包装和原病毒整合所需要的所有元件，即克隆到细菌中的5′LTR，包装信号，和3′LTR，具有ColE1复制起点的氨苄青霉素选择质粒主链(如图所示)。图中示出了用于插入VH启动子，鼠重链内含子增强子(EμH)，包括侧翼基质连接区(MAR)和IgH链3′α增强子(3′αE)的第一个克隆步骤。突出显示了整合在PCR扩增片段末端的限制酶，以及所述质粒主链上的独特的相容性限制酶位点，该位点可用于多个克隆步骤。

    图12b解释了用于表达人IgH链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤II)。IgH 3′α增强子包括四个功能区，在末端B细胞分化期间激活所述增强子时，这些功能区变得对DNaseI消化敏感，并因此被称为超敏性区HS1，2，3和4。所述每一个HS区赋予了3′αE的增强子活性，不过，大部分增强子活性是由HS1，2区赋予的。尽管3′αE的HS1，2区本身能够启动报导基因表达达到与完整3′αE区几乎相同的水平，对某些逆转录病毒IgH表达构建体来说，可能需要包括3′αE的其他功能区。因此，在这里示出了3′αE的HS3和HS4区的克隆。突出显示了整合在基因组PCR片段末端的限制酶，以及所述质粒主链上的相容性限制酶位点，这些位点可用于多个克隆步骤。

    图12c表示用于表达人IgH链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤III)。在将IgH启动子和增强子元件克隆到逆转录病毒转移载体之后，需要插入IgH链的编码区。为了能够表达膜结合的，以及分泌形式的免疫球蛋白，在所述逆转录病毒表达载体上需要包括IgH链的跨膜区。在不同的同种型之间，所述跨膜区在长度，一级序列和外显子/内含子结构方面明显不同。因此，需要克隆IgM，IgG，IgA和IgE重链的不同的跨膜区。作为一种例子，示出了PCR克隆和将四种相应的不同的跨膜区插入质粒pAB-3中的过程。可以用含有IgH3′αE的延伸形式的载体pAB-4和pAB5进行相同的克隆方法。突出显示了整合在基因组PCR片段末端的限制酶，以及质粒主链上的相容性限制酶位点，这些位点可用于多个克隆步骤。

    图12d表示用于表达人IgH链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤IV)。人B淋巴细胞能够产生四种不同的IgG同种型，IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，这些同种型只是在序列上稍有差别，并且具有不同的生理学效应物功能。图中示出了将所述恒定区基因克隆到已经包含了IgG跨膜外显子的中间载体pAB-3.2。示出了内源外显子/内含子组构，它包括编码各种IgG同种型的铰链(H)区的外显子。示出了整合在基因组PCR片段末端的限制酶，以及位于质粒主链上的独特的相容性限制酶位点，可将所述位点用于多个克隆步骤。在克隆VDJ重排的可变区外显子时，所述构建体能够表达完整的IgG链(参见图15)。

    图12e表示用于表达人IgH链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤V)。图中示出了编码其余的人Ig同种型IgM，IgA1，IgA2，和IgE的恒定区基因的克隆。与图12d所示的IgG恒定区基因的克隆方法类似，将这些同种型的基因组区以NotI消化的PCR片段形式插入所述同种型的相应的跨膜外显子上游的独特的NotI限制位点。示出了各种Ig同种型的包括编码铰链(H)区的外显子的内源外显子/内含子组构。示出了整合在基因组PCR片段末端的限制酶，以及所述质粒主链上的独特的相容性限制酶位点，可将这些位点用于各种克隆步骤中。在克隆VDJ重排的可变区外显子时，所述构建体能够表达相应同种型的完整的IgH链(参见图15)。

    图13a表示用于表达人1gκL链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤I)。与表达IgH链的逆转录病毒表达载体的构建类似，IgκL链的表达载体除了κL链蛋白的编码区之外，需要κL链基因座特异性启动子和增强子元件，随后需要将其克隆到逆转录病毒转移载体上。如图所示，从基础逆转录病毒载体pLIB开始，首先将Vκ启动子克隆到pLIB上。随后插入含有人κ内含子增强子(κiE，具有它的上游基质相关区，MAR)和人κL链恒定区基因(图的左侧)的PCR产物，或者插入具有人κL链恒定区基因(图的右侧)的小鼠κiE的融合PCR片段，该片段是通过单一重叠延伸(SOE)PCR制备的。将含有鼠κ3′增强子(κ3′E)的PCR产物插入这两种构建体中。示出了整合在各种基因组PCR片段末端的限制酶，以及位于所述质粒主链上的独特的相容性限制酶位点，可将这些位点用于多个克隆步骤中。

    图13b表示用于表达人1gκL链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤II)。然后将用于人IgH和IgκL链的逆转录病毒表达构建体转导到preB细胞中，并且因此希望在用IgκL链表达载体进行第一轮转导之后能够选择稳定转导的细胞。为此，如图所示，将SV40启动子驱动的嘌呤霉素表达盒插入两种可能的IgκL链逆转录病毒转移载体中间体pAB-7.1和pAB-8.1中。在将VκJκ重排的可变区外显子克隆到所述载体上时，所述逆转录病毒构建体能够表达人IgκL链(参见图15)。

    图14a表示用于表达人1gλL链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤I)。通过以下方法克隆用于人IgλL链的逆转录病毒表达构建体体：首先，将嘌呤霉素盒和Vλ启动子的融合PCR产物插入pLIB(所述PCR融合是通过单一重叠延伸(SOE)PCR进行的，正如在实施例部分所述)。如图所示，在下一个步骤中，将两个鼠λL链增强子元件，λ2-4和λ3-1增强子的SOE-PCR融合构建体插入所述构建体。最后，使用所标明的限制酶，通过PCR克隆将所述人Cλ1区的编码区插入该逆转录病毒克隆载体。在将VλJλ重排的可变区外显子克隆到所述载体上时，这些逆转录病毒构建体能够表达人IgλL链(参见图15)。

    图14b表示用于表达人1gλL链的逆转录病毒表达载体的构建(预备步骤II)。如图所示，通过用独特的MluI-NotI限制酶简单地克隆，将其他的人IgλL链恒定区基因用于取代Jλ编码区。在将VλJλ重排的可变区外显子克隆到所述载体上时，这些逆转录病毒构建体能够表达不同的人IgλL链同种型(参见图15)。

    图15a表示将V-区基因插入逆转录病毒人IgH，IgκL和IgλL链表达载体中。迄今为止业已披露的用于人IgH和L链的所有逆转录病毒表达构建体都不包括所述可变区的编码区。所述结构域可以通过PCR克隆从各种来源中分离(例如，参见图9)，并且可以作为编码单一特异性的V区外显子或作为编码不同特异性的文库插入所述逆转录病毒载体(它需要用简并引物对进行PCR扩增)。如图所示，V区是与它们的特有前导(L)序列一起通过PCR方法扩增的。示出了可用于克隆可变区外显子的限制酶。该附图示出了某些特定的最终逆转录病毒IgH和IgL链表达载体。由于所述载体的标准设计，可以使用不同的编码区和启动子和增强子元件。

    在本说明书中所使用的术语的定义

    亲和力：抗原受体(或任何受体)与它的关联抗原(或它的配体或结合配偶体)的结合强度，是通过受体-配体相互作用的缔合速度与解离速度的比例而确定的。

    亲和力成熟：在生发中心通过抗原刺激的B淋巴细胞产生的抗体的结合特异性的抗原驱动的改良的高度调控的免疫学过程。这一过程是通过与选择性扩增和产生较高亲和力抗体的B淋巴细胞的存活相关的抗体的可变区的编码区内的体细胞超变引起的。

    抗体：通过B淋巴细胞和浆细胞产生的糖基化多肽，它的单体形式包括两个相同的重(H)链和两个相同的轻链，每一条链包括一个可变区和一个(L链)或若干(H链)恒定区结构域。两个H和两个L链组装成对称的Y型二硫键连接的抗体分子，它具有通过H和L链的可变区组合形成的两个结合结构域。

    抗原：能够通过免疫球蛋白(或抗体)的可变区结合的任何生物分子或化学实体。

    抗原受体：抗原受体由可变区和恒定区组成，前者具有结合抗原的能力，而后者能介导效应物功能或将信号传导到细胞内。抗原受体包括T细胞受体和膜结合免疫球蛋白。

    人工结合蛋白：包括不是来自天然基因或它的片段的多肽序列(例如合成的间隔区序列)的结合蛋白。

    结合蛋白：具有选择性地结合抗原或配体能力，有或没有额外效应物功能的所有类型多肽的最通用的术语。结合蛋白包括人工结合蛋白，抗体的片段，例如单链可变片段(scFv)，还包括组合了免疫球蛋白的可变区和恒定区结构域和T细胞受体的融合产物，或者反之亦然。另外，结合蛋白可以是具有其他受体分子的功能性部分的可变区的融合产物。相反，结合蛋白可以是来自非-Ig或TCR相关受体的结合部分与抗原受体的恒定区结构域的融合体。

    顺式作用：只对相同等位基因上的或附近的遗传元件和基因座有影响。

    编码区：具有能够表达成多肽的具有开放读框的遗传元件。

    互补决定区(CDRs)：可变抗原受体结构域的三维结构上的可直接建立与抗原的联系的区。CDRs通常是抗原受体的最多变的部分。

    结构域：生物分子的结构部分，它以特殊的三维结构为特征(例如，免疫球蛋白的可变区或恒定区结构域在结构上是相关的，如Ig-样结构域可以在免疫系统的很多分子中见到，它属于所谓的Ig-超家族)。

    效应物功能：免疫球蛋白恒定区在免疫系统内的功能，例如，激活互补体的能力，或通过与恒定区的特异性受体(Fc受体)结合激活某些免疫细胞。

    内源的：某些细胞或生物自身的。

    增强子：可以在大的距离上，不依赖于方向或位置刺激启动子元件的活性的遗传元件。

    表位：由抗体的可变结合区识别的抗原的三维结构实体。

    (抗体，抗原受体或结合蛋白的)功能性片段。功能性片段可源于选自下组的特定多肽：抗体，抗原受体和结合蛋白，就特定的应用领域而言，它们共有所述多肽所固有的至少一种需要的特征。例如，功能性片段可以是保留了所述多肽结合某些抗原和/或配体的能力的多肽或寡肽。相同的原理适用于能介导所述多肽所特有的特异性效应物功能的片段。与片段相关的其他例子能够激活或抑制抗体，抗原受体和常规受体-配体系统的特殊免疫原性和/或生理学效应物功能。

    遗传元件：独立的或任何功能性或非功能性组合形式的基因，基因座，或其片段，如启动子，增强子，和编码区。

    生发中心：外周淋巴器官(例如淋巴结或脾脏)中的独特的组织结构，其中，发生了抗原呈递细胞和不同的淋巴细胞群之间的关联的相互作用，导致了抗原反应性淋巴细胞的增殖性扩增，以及通过抗原反应性B淋巴细胞产生的抗体的亲和力成熟和类别转换重组。

    种系构型：基因和基因座的天然构型，它是从亲本那里遗传下来的，并且通过种系可以传递给下一代。发生在体细胞内的DNA重组事件，如发生在淋巴细胞内的V(D)J重组，导致了某些基因座上的遗传信息的重新改组或丧失，从而改变所述基因的种系构象。

    异源的：是与内源不同的。

    人源化抗体：通过将非人抗体的可变区融合在人恒定区结构域上制备的人工抗体。

    杂交瘤：通过融合永生化骨髓瘤细胞系(不能分泌抗体)和永生化浆细胞(可以分泌大量抗体)而制备的永生化细胞系。

    独特型：抗原受体的结合特征(特异性)。

    同种型：由决定其(效应物)功能的抗原受体的恒定区产生的结构特征。

    免疫球蛋白(Ig)：是抗体的同义词。

    免疫球蛋白微基因座：包括若干(即单一位数)V，D和/或J基因片段的人工遗传构建体，它能够进行V(D)J重组，以便产生可变编码区的有限的寡克隆所有组成成分。

    文库：不同遗传元件的总称。

    单克隆抗体：具有由所述抗体的可变抗原结合区的独特结构决定的一种确定的特异性的抗体。

    骨髓瘤细胞：源于处在浆细胞分化阶段的细胞的永生化细胞，它没有表达内源免疫球蛋白的能力。

    多克隆抗体：具有不同的可变抗原结合区结构的抗体的混合物，因此，很有可能具有不同的结合特异性。

    PreB淋巴细胞：前体B淋巴细胞的特征是能表达与V(D)J重组相关的淋巴特异性因子(例如RAG-1，RAG-2)，通常在至少一个免疫球蛋白重链等位基因上启动了V(D)J重组，但是，仍然具有种系构型中的轻链基因座，因此，不能表达完整的抗体。

    初级淋巴器官：一种器官，造血干细胞在其中发育成淋巴细胞，在小鼠和人体中，例如骨髓，胸腺，和在胎儿生命阶段，如肝脏。

    所有组成成分：不同(结合)特异性的集合。

    体细胞超变：在体细胞内发生的诱导以高频率(＞10-4突变/碱基对/细胞分裂)将点突变导入基因组的特定区域的一种过程。

    基质细胞：源于骨髓的增殖性粘附细胞，在存在额外preB细胞生长因子的条件下具有支持preB细胞增殖的能力。

    反式作用：对位于不同染色体上的遗传元件和基因座具有影响。

    转染：将核酸序列导入真核细胞的过程，通常与使用化学和物理方法相关。

    转化：使细胞永生化的过程，以便建立连续增殖的细胞系。

    转基因：导入动物种系的人工遗传元件。因此，所述转基因可以从一代遗传到下一代。

    转导：通过重组病毒的产生将DNA送递到哺乳动物细胞中的过程。为此，用重组病毒DNA构建体转染表达病毒颗粒结构蛋白的包装细胞系，所述构建体包括用于将所述病毒DNA构建体包装到病毒结构蛋白中的调节元件。通过这种方法，生产了重组病毒，可将这种病毒用于感染哺乳动物靶细胞，以便导入克隆到所述重组病毒基因组中的遗传信息。

    V(D)J重组：DNA重组过程，在该过程中，很多V(可变的)，有时D(多样性)，和J(连接)基因片段之一组装至抗原受体的可变区的编码区。

    载体：人工制备的核酸构建体，可将其用于在不同的生物和物种之间转运核酸元件，并且，还可将它用于繁殖，扩增和保持基因组信息。

    异种的：源于不同物种的(通常作为异源的同义词使用)。

    在本说明书中所引用的所有参考文献都被收作本文参考。

    发明详述

    根据第一方面，本发明提供了一种用于制备脊椎动物淋巴细胞的方法，可将其用于生产任何异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段，包括以下步骤：

    (a)通过导入编码至少一种异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段的至少一种外源遗传元件对脊椎动物前体淋巴细胞进行遗传修饰，所述淋巴细胞

    (i)源于初级淋巴器官，和

    (ii)具有分化成成熟的淋巴系细胞的潜力；以及

    (b)在体外或体内实现将所述遗传修饰过的前体淋巴细胞分化成成熟的淋巴系细胞，以便制备能够生产所述异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段的淋巴细胞。

    为了实现上述异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段的大规模生产，优选将能生产感兴趣的多肽的最终分化的淋巴细胞永生化，或者分离编码所述异源抗体或结合蛋白的遗传信号，并且从所述细胞中转移到不同的表达系统中。在这里可以保持，扩增所述遗传信号和/或用于生产相应的免疫球蛋白样蛋白或其功能性片段。

    所述淋巴细胞的永生化，优选可以通过以下步骤实现：

    (a)将所述淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞融合，以便制备杂交瘤细胞；

    (b)用转化病毒，如Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)转化所述细胞；或

    (c)用合适的载体构建体转染所述细胞，确保至少一种转化癌基因的表达，如v-ab1，或SV40大T抗原，在所述基因超量表达时，会导致稳定转染细胞的永生化。

    以便制备能够永久性生产所述异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段的脊椎动物淋巴细胞。

    在一种优选实施方案中，所述脊椎动物前体淋巴细胞能够表达淋巴V(D)J重组机制的至少一种成分，并且源于有颚脊椎动物，包括软骨鱼，硬骨鱼，两栖动物，爬行动物，鸟类，哺乳动物，包括猪，绵羊，牛，马和啮齿动物，包括小鼠，大鼠，兔和豚鼠，优选来自小鼠的鼠前体(pre)B淋巴细胞。

    在从人类到进化上最原始的软骨鱼类的所有有颚的脊椎动物物种的原始前体B淋巴细胞的特征，不仅是能表达特殊类型的细胞表面标记(如在小鼠体内B220和c-kit的组合)，而且还在于它们组装编码抗体的可变区的基因片段的潜力，对所述抗体来说，它们表达V(D)J重组机制的淋巴特异性成分，如RAG-1，RAG-2，和TdT(末端脱氧核苷酰转移酶)。尽管诸如鸟类的某些物种具有不同的初级淋巴器官(例如，法氏囊)，在这里产生了所述前体B淋巴细胞，尽管事实是，除了V(D)J重组之外，其他物种还利用不同的机制使抗体多样化，如体细胞超变(如绵羊)或基因转化(例如兔)，来自所有脊椎动物物种的前体B淋巴细胞能够进行V(D)J重组，并且具有分化成更成熟的B系细胞的潜力，以便能够表达通过VDJ重排的免疫球蛋白基因座产生的抗体。因此，如果所述分离或制备的脊椎动物前体B淋巴细胞不能表达内源抗体，并且如果编码异源免疫球蛋白基因座的所有部分的遗传元件被稳定导入所述淋巴细胞，它们将获得生产异源抗体的潜力，因此，属于本发明的范围。

    本发明的方法利用了存在于初级淋巴器官中的脊椎动物前体B(preB)淋巴细胞。对于小鼠来说，所述细胞可以从胎肝或成体骨髓中分离，例如，通过用常规标记的抗体进行制备性细胞分选，结合到小鼠preB细胞上的诸如细胞表面标记B2和C-kit上；或者，由于它们对骨髓衍生的饲养(基质)细胞，和诸如白介素-7和白介素-3的生长因子的强的增殖反应，它们能够从鼠胎肝或骨髓细胞中选择性地生长。

    就V(D)J重组细胞系的淋巴成分的表达而言，分化成成熟淋巴系细胞的潜力和抗原受体蛋白多样化的遗传学机制，T系淋巴细胞与B系淋巴细胞非常相似。因此，可以理解的是，本文所披露的用于对前体B淋巴细胞进行遗传修饰，以便生产异源抗体或结合蛋白的方法，同样可应用于前体T淋巴细胞。因此，本发明的方法主要是结合鼠preB淋巴细胞披露的，但它还可应用于源于如上文所述的所有有用脊椎动物的所有脊椎动物前体淋巴细胞。应当理解的是，将任何其他前体淋巴细胞系用于实施本发明的原理仅仅取决于抑制内源抗体表达和将编码异源抗体或结合蛋白的内源遗传元件导入所述细胞的可行性。由于本领域技术人员能够理解所述原理的广泛的可应用性，支持本发明的一般概念，主要是结合鼠前体B(preB)淋巴细胞的应用进行说明的。

    在小鼠体内，从造血干细胞发育成抗体分泌性浆细胞，是一个高度调控的过程，并且，在体内，取决于基因片段在免疫球蛋白受体基因座上的有序重排和来自生产性重排的Ig基因座的免疫球蛋白的受控表达(图2)。通常，重排首先发生在IgH链基因的两个等位基因上，首先是D到JH基因片段的重排，随后是VH到DJH基因的重排(图2)。如果在一个等位基因上发生了生产性VHDJH重排，μH链可以作为与替代L链配对的preB细胞受体在所述细胞表面上表达(由preB细胞特异性基因λ5和VpreB编码)(Karasuyama等，Adv.Immunol.，63，1-41，1996)。PreB细胞受体的表达，使得preB细胞分化到一种阶段，在此阶段，启动了VL到JL的重排，这种重排通常首先发生在κL链等位基因上，随后发生在λL链等位基因上(Melchers等，Ann.Rev.Immunol.，12，p.209-225，1994)。如果发生了生产性IgL链表达，可以通过所谓的不成熟的B细胞，表达膜结合IgM和/或IgD抗体。用合适的信号刺激外周IgM/IgD阳性成熟的B细胞，可以导致在IgH链等位基因上发生类型转变重组，这种重组能使所表达的抗体的同种型改变成任何IgG，IgA，IgE亚型(在小鼠体内：IgG1，IgG2a，IgG2e，IgG3，IgA，IgE，在人体内：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE)(图1)。

    正如前面已经提到过的，适合实施本发明的鼠preB细胞具有以下特征：表达B220和C-kit表面标记，表达淋巴V(D)J重组基因RAG-1和RAG-2的至少一种，以及反应于基质细胞和/或IL7或IL3的较长时间增殖的能力(Rolink等，EMBO J.，10，p.327-336，1991；Winkler等，Blood，85，p.2045-2051，1995)。如果preB细胞系和克隆是用野生型小鼠建立，它们通常携带位于两个IgH链等位基因上的DJH重排(Alt等，EMBO J.，3，p.1209-1219，1984)，或者在某些场合下，具有非生产性VHDJH重排(图2)。不过，它们的IgH链等位基因的重排不是用具有preB细胞表型的小鼠建立基质细胞，IL7或IL3反应性细胞所必需的，因为所述细胞还可以用V(D)J重组缺陷型突变小鼠株建立(Grawunder等，International Immunology，7，p.1915-25，1995)。在任何场合下，无论Ig基因重排preB细胞的潜力如何，都保留了在体外分化成更成熟的B系细胞的潜力，并最终分化成同种型-转换的浆细胞(Rolink等，Immunity，5，p.319-330，1996)。

    可以用小鼠的各种淋巴器官建立长期增殖的鼠preB细胞系和克隆，包括胎肝，胎血，胎脾和成体骨髓，不过，还包括具有基质细胞，IL7或IL3反应性preB细胞的其他胚胎或成体器官，特别是在生命的早期阶段(小于4周龄)(Rolink等，Blood，81，p.2290-2300，1993)。

    用于产生上述preB细胞的小鼠可以是野生型小鼠，嵌合小鼠，移植过的小鼠或具有妨碍内源鼠Ig基因座上V(D)J重组的突变的小鼠株。上述突变可以是顺式的，包括以下片段的缺失或发生在以下片段上的缺失：IgH多样性(D)基因片段，IgHJ基因片段(Chen等，Int.Immunol.，5，p.647-656，1993)，μH链恒定区，包括编码μH跨膜锚的两个外显子(Kitamura和Rajewsky等，Nature，356，p.154-156，1992)，Igκ和IgλJ基因片段，κL链恒定区(Cκ)(Chen等，EMBO J.，12，p.821-830，1993)，λL链恒定区(Cλ1-4)和各种IgH和L链增强子，包括重链内含子增强子(EμH)，κ内含子增强子(κiE)，3’κ增强子(3’κE)和两个λ增强子(Eλ2-4和Eλ3-1)。

    根据本发明，可以将携带上述任何顺式作用突变的preB细胞用于导入包括部分或全部异源，特别是非重排的，即种系构型的人免疫球蛋白基因座。可以将所述遗传修饰过的preB细胞用于抗体特异性的从头生产，因为所述新特异性仅在异源遗传学免疫球蛋白基因座上发生的V(D)J重组时产生。

    另外，合适的preB细胞还可以用由于反式作用突变而不能重排内源免疫球蛋白基因座的小鼠制备，所述突变例如，发生在淋巴特异性重组激活基因RAG-1和RAG-2上的突变(Mombaerts等，Cell，68，p.869-877，1992；Shinkal等，Cell，68，p.855-867，1992)，或发生在普遍表达的DNA修复因子Ku70，Ku86，XRCC4，DNA连接酶IV，DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PKcs)的Artemis或催化性亚基上的突变，它们参与非同源性DNA末端连接，并且还是V(D)J重组所需要的。为了在具有所述反式作用突变的preB细胞中生产异源抗体和结合蛋白，所使用的表达构建体不需要V，(D)和J基因片的DNA重排(参见下文)。

    对于鼠类体内的顺式作用突变来说，在免疫球蛋白重链和免疫球蛋白κL链基因座上优选必须最少包括(a)纯合的突变。对于反式作用突变来说，特定preB细胞系上的一个上述纯合突变，就足以排除作为本发明方法的基本要求的内源免疫球蛋白的表达。

    具有干扰内源免疫球蛋白表达的顺式或反式作用遗传修饰的前体B淋巴细胞，可以从具有天然(例如scid小鼠)或人工产生的突变的小鼠体内分离。另外，可以筛选来自野生型小鼠的preB淋巴细胞的位于它们的免疫球蛋白等位基因上的突变，排除内源抗体的表达，例如位于两个重链等位基因上的末端框外DJH重排。可以将破坏内源鼠抗体表达的突变导入造血干细胞或导入早期祖细胞，可以用所述细胞通过体外或体内分化制备合适的长期增殖的preB细胞。

    另外，前面所提到的遗传学效应，还可以直接导入要进行遗传修饰的前体淋巴细胞的至少一个等位基因。一个等位基因的失活，可以足以实施本发明，因为可以分离突变的克隆，它们在所述其他等位基因上已经具有了某些突变(杂合突变)，以便在本发明使用的所述前体淋巴细胞内建立纯合基因座。

    尽管可以理解的是，本发明可以通过野生型前体淋巴细胞实现，优选的是，在本发明的方法中，所述脊椎动物前体淋巴细胞丧失了它们的表达内源抗体和/或抗原受体或其功能性片段的潜力，这一目的是通过以下方法实现的：分离/选择表达内源免疫球蛋白或其片段缺陷的脊椎动物前体淋巴细胞，和/或将至少一种载体构建体导入所述脊椎动物前体淋巴细胞，所述载体构建体被设计成能功能性地使至少一个遗传元件的至少一个等位基因失活，所述遗传元件选自下组：

    (a)免疫球蛋白重链基因座的编码区，包括V，D，和J基因片段的全部或部分，以及μ，δ，γ，ε，和α重链的恒定区外显子的任何编码区，有或没有它们的跨膜外显子；

    (b)免疫球蛋白κ和/或λ轻链基因座的编码区，包括V和J基因片段编码区的任意一种，以及所述恒定区外显子的任意一种；

    (c)T细胞受体α，β，γ，和δ基因座的编码区，包括V，D和J基因片段的全部或部分，以及α，β，γ，和δ恒定区外显子的任何编码区；

    (d)顺式作用免疫球蛋白重链基因座增强子元件，包括重链内含子增强子和3′α增强子；

    (e)顺式作用免疫球蛋白轻链基因座增强子元件，包括κ轻链内含子增强子(κiE)，3′κ增强子，和λ2-4和λ3-1增强子；

    (f)顺式作用T细胞受体基因座增强子元件，包括TCRα，β，γ，和δ增强子；

    (g)反式作用重组激活基因，RAG-1和RAG-2，包括它们的启动子和增强子元件，以及它们的编码区；和

    (h)V(D)J重组所需要的反式作用DNA修复基因，包括Ku70，Ku86，DNA-依赖性蛋白激酶(DNA-PKcs)的催化性亚基，DNA连接酶IV，XRCC4和Artemis，包括它们的启动子和增强子元件，以及所述基因的编码区。

    上述载体构建体优选包括基因导向载体，该载体包括与所述至少一个遗传元件同源的DNA序列区，优选位于能够选择阳性转染子的阳性选择标记侧翼。例如，合适的导向载体包括具有高度序列同源性(＞99％)的两个区，或与所导向的基因座具有序列同一性，优选位于阳性选择标记(如抗生素抗性标记)侧翼，以便在每一个所述序列同源区上发生的双交换事件能导致所述阳性选择标记的定向整合，并因此导致内源基因的定向破坏(图4a-c)。在所述导向载体中采用的阳性选择标记可以包括赋予诸如嘌呤霉素，潮霉素B，新霉素(G418)，组胺醇，霉酚酸，和zeocin等的抗生素抗性的表达盒。

    所述基因导向载体优选还包括位点特异性DNA重组酶的一对DNA识别序列，位于所述阳性选择标记侧翼，在编码所述关联(cognate)重组酶的至少一种的核酸序列转染和瞬时表达时，能够缺失所述阳性选择标记。例如，所述阳性选择标记的侧翼可以是分别由cre-重组酶或FLP重组酶识别的loxP或FLP序列(Kuhn和Schwenk，Curr.Opin.Immunol.，9，p.183-188，1997)，可以通过cre-或flp-重组酶表达载体的顺式转染，从基因导向preB细胞的基因组中位点特异性除去所述选择标记表达盒(图6a，b)。这一方法允许反复使用采用了相同的阳性选择标记的导向载体。

    在一种优选实施方案中，所述基因导向质粒载体还包括能够筛选转染物的阴性选择标记，在所述转染物中，所述基因导向载体通过非同源重组随机地整合到它的基因组中。例如，筛选导向构建体的随机整合的合适的阴性选择标记可以包括单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的表达盒，白喉毒素基因(DT)的表达盒(McCarrick等，TransgenicRes.，2，p.183-190，1993)，或它的减毒形式DTtox176的表达盒(Maxwell等，Mol.Cell.Biol.，7，p.1576-1579，1987)。所述阴性选择标记位于所述导向构建体上，以便所述阳性/阴性导向构建体的定向整合导致了所述阴性选择标记的去除(图6a，b)。因此，只有通过同源重组整合所述导向载体，才能使所述细胞存活，并且，其后果是，选择通过同源重组导致的内源基因座的一部分的定向和破坏。

    应当理解的是，使用丧失了它们的表达内源抗体和/或抗原受体或其功能性片段的脊椎动物前体淋巴细胞是优选的。不过，具有表达抗体和/或抗原受体或其片段的脊椎动物前体淋巴细胞同样可用于本发明中。无论所述前体淋巴细胞的实际遗传学背景如何，都必须对所述细胞进行遗传修饰，以便能够生产异源抗体或结合蛋白。可以理解的是，所述修饰优选是在通过上述方法选择和/或制备鉴定了合适的靶细胞或克隆之后进行的。不过，还可以在使得所述细胞不能表达内源免疫球蛋白或它的一部分之前，对所述细胞进行遗传修饰。另外，同时进行这两个步骤可能也是合适的。

    因此，在另一种实施方案中，优选的是将编码异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段的用于实施所述需要的遗传修饰的至少一种外源遗传元件，携带在选自下组的遗传构建体上：

    (a)重组逆转录病毒DNA构建体，包括可操作地连接的启动子，增强子和编码核酸序列，以便能够表达至少一种异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段，它们是野生型的或在其一级氨基酸序列上具有(a)设计的突变，或者是人工的；

    (b)重组的基于质粒的DNA构建体，包括可操作地连接的启动子，增强子，和编码核酸序列，以便能够表达至少一种异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段，它们是野生型的或在其一级氨基酸序列上具有(a)设计的突变，或者是人工的；

    (c)重组的基于质粒的小免疫球蛋白或T细胞受体基因座，具有可操作地连接的未重排的V，D和J基因片段，以便能够进行V(D)J重组，并且随后表达至少一种异源抗体或T细胞受体，或其功能性片段，它们是野生型的或在其一级氨基酸序列上具有(a)设计的突变；

    (d)细菌，酵母或脊椎动物人工染色体，包括可操作地连接的种系构型的部分或全部免疫球蛋白或T细胞受体基因座，以便能够进行V(D)J重组，并且随后表达至少一种异源抗体或T细胞受体，或其功能性片段，它们是野生型的或在其一级氨基酸序列上具有(a)设计的突变；

    (e)细菌，酵母或脊椎动物人工染色体，在修饰过的排列中包括至少一种异源免疫球蛋白或T细胞受体基因座的部分或全部，所述修饰过的排列被设计成能够进行V(D)J重组，并且随后表达至少一种异源抗体或T细胞受体，或其功能性片段，它们是野生型的或在其一级氨基酸序列上具有(a)设计的突变；

    (f)跨染色体元件，它是异源染色体的片段，具有种系构型中的免疫球蛋白或T细胞受体基因座的部分或全部，使得能够进行V(D)J重组，并且，随后表达至少一种异源抗体或T细胞受体，就其一级氨基酸序列而言，它是野生型的；

    其中，所述至少一种外源遗传元件最优选编码天然的或修饰过的人工抗体，人类结合蛋白，人类抗原受体，或(a)其功能性片段。

    另外，优选的是，至少一种外源遗传元件编码能够进行所述结合区的亲和力成熟的异源或人工受体。

    为了实施遗传修饰的步骤，根据本发明，可以采用若干不同的方法，这些方法将在下文进行说明。

    第一种方法基于编码非重排的，种系构型的部分异源抗原受体基因座的重组质粒DNA构建体的稳定导入，类似于以前在转基因小鼠体内所获得的结果。所述异源抗原受体基因座，可以包括免疫球蛋白H，κL和λL链基因座的V，D和J基因片段，以及来自任何T细胞受体(TCR)α，β，γ或δ基因座的基因片段。

    第二种方法涉及兆碱基大小的异源抗原受体基因座的稳定整合，包括非重排的、种系构型的免疫球蛋白和/或TCR基因座的全部或一部分，作为转染色体片段，或克隆到细菌人工染色体(BACs)，酵母染色体(YACs)，或脊椎动物人工染色体(VACs)上，所述整合也是在转基因小鼠体内进行的(Green等，Nat.Genet.，7，p.13-21，1994；Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，p.722-727，2000)。

    这两种方法的遗传元件，都必须稳定地整合到在它们的内源鼠Ig基因座上具有顺式作用突变的preB细胞中，这种整合只会干扰内源Ig基因座的重排，但仍然可以由非重排的和/或种系异源抗原受体基因座制备各种抗体所有组成成分。编码人Ig基因座的DNA构建体的构建，取决于对所有人Ig基因座及其几乎完全公开的DNA序列的组构的了解，以上知识是人类基因组工程的结果。例如，人类IgH链基因座位于染色体14q32.33上的1.25Mbp片段上。它包括123-129个(取决于等位基因变异)VH基因片段(所述功能的41-47)，位于所述恒定区基因簇上游的27D和6JH基因片段。人类IgκL链基因座位于染色体2p12上，包括1.82Mbp，并且包括40或76个(取决于等位基因)VK基因片段(分别为所述功能的34或64)，以及位于单一Cκ区上游的5个Jκ基因片段。所述人类IgλL链基因座位于染色体22q11.2上，跨越1.05Mbp的长度，并且包括70或71Vλ(31或32个功能性)基因片段，位于7-11串联重复的Jλ-Cλ基因片段上游。

    携带部分或全部种系异源免疫球蛋白或T细胞受体基因座的DNA构建体存在于跨染色体片段上，或可以克隆到BAC，YAC，或VAC载体构建体上，可以用标准基因转移方法，将所述DNA构建体稳定地转入长期增殖的靶preB细胞中，例如，包括电穿孔，磷酸钙或DEAE-葡聚糖转染，脂质体介导的转移，原生质球或原生质体融合，弹道转移，显微注射，或特异性蛋白-加成物形成，或上述方法的组合。可以通过包含在YAC，BAC和VAC载体主链上的合适的(药物)选择标记，选择稳定的转化体，包括赋予对诸如嘌呤霉素，潮霉素B，新霉素(G418)，组胺醇，霉酚酸，和zeocin等的抗性的基因。

    可以将第三种概念上不同的方法用于导入编码异源的，优选人类抗体或结合蛋白的异源遗传元件。根据这种替代方法，利用逆转录病毒转导，将异源遗传元件稳定地转入鼠preB细胞。逆转录病毒转移载体只能容纳7-10kb的外源DNA，它明显有利于异源的，优选人类抗体和结合蛋白的表达载体的克隆。因此，通过标准的分子生物学技术，使用逆转录病毒转移载体，可以方便地并且快速地修饰异源抗体和结合蛋白的所有特性。相反，在转基因小鼠系统中导入对异源抗体表达的修饰，是非常麻烦的和花费时间的过程，因此，在实践上是不可行的。用转基因小鼠改变转基因编码的异源抗体的功能，会需要制备若干新的转基因小鼠株，包括将其转育到免疫缺陷型遗传学背景中。

    编码异源抗体或结合蛋白的重组逆转录病毒转移载体，可以作为表达单克隆结合特异性的克隆生产，或者可以以编码多克隆结合特异性文库的形式制备。因为逆转录病毒载体，没有大到足以整合种系抗原受体基因座的较大的片段，所述异源编码区需要包括编码可变区的已经V(D)J重排的基因片段，与异源抗体和结合蛋白的恒定区的编码区组合。因此，异源抗体或结合蛋白的逆转录病毒表达载体的克隆或文库的表达，不需要V(D)J重组的功能性细胞机制，并且，因此可以与具有顺式和/或反式作用突变的preB淋巴细胞组合使用，正如上文所指出的，它能破坏内源免疫球蛋白基因表达。

    首先，将赋予异源抗体或结合蛋白对鼠preB细胞表达的逆转录病毒表达载体，转染到逆转录病毒包装细胞系，有很多种所述细胞系都可以通过商业渠道获得，具有产生重组逆转录病毒的能力，所产生的逆转录病毒具有感染性的亲嗜性，兼嗜性或泛嗜性所有组成成分。用逆转录病毒gag，pol和env基因的表达构建体，稳定地转染所述包装细胞系。用编码异源抗体或结合蛋白的重组逆转录病毒质粒载体转染逆转录病毒包装细胞，随后会导致能感染preB细胞，并且将异源遗传学信息稳定地转导到preB细胞系和克隆中的重组逆转录病毒的形成(图8)。用于上述方法的逆转录病毒表达载体，是用通过商业渠道获得的空的逆转录病毒转移载体构建的，所述载体包括最低必需逆转录病毒因子，包括5′-LTR，Psi包装信号和3′-LTR(图11a)。

    用于异源抗体或结合蛋白表达的最终的逆转录病毒载体，可以包括任何以下以一种方式可操作地连接的遗传元件，以便确保异源抗体和结合蛋白在B系细胞中的表达，所述遗传元件选自：

    (a)启动子元件，包括组成型启动子，如CMV(巨噬细胞病毒)，SV40(猿猴病毒40)，β-肌动蛋白或PGK(磷酸甘油激酶)启动子，或B系特异性启动子，如CD19启动子，或IgH和IgL链基因启动子；

    (b)来自任何抗原受体基因座的可变(V)区外显子，包括免疫球蛋白和TCR基因座；

    (c)使异源抗体或结合蛋白能够进行高水平的和B系特异性表达的增强子，如EμH或κiE内含子增强子元件；

    (d)恒定区外显子，包括编码分泌形式和膜结合形式的抗体和结合蛋白的外显子(图7a，b)；和

    (e)重链和轻链基因座的任何3′免疫球蛋白基因增强子，(即3′α，3′κ或λ3-1和λ2-4增强子)，这些增强子是编码异源抗体或结合蛋白的外显子的可变区的细胞超变所必须的(图7a，b)。

    另外，诸如嘌呤霉素，潮霉素B，新霉素(G418)，组胺醇，霉酚酸，zeocin的合适的(药物)选择标记的表达盒，或诸如EGFP(强化绿色荧光蛋白)及其突变体YFP(黄色荧光蛋白)，CFP(青色荧光蛋白)，和BFP(兰色荧光蛋白)，或RFP(红色荧光蛋白)的合适的报导基因的表达盒，可以是所述逆转录病毒载体的一部分，可以分别选择，或分离稳定转导过的细胞(图7b)。所有所述编码区和控制元件的排列和存在需要加以认真设计，以便能够分别表达膜或分泌形式的异源Ig糖蛋白，以及在体内，在生发中心驱动异源抗体和结合蛋白的亲和力成熟的抗原。如果需要，恒定区结构域外显子可以在同种型之间交换，或者导入影响表达的异源抗体的效应物功能的设计的突变(图7a，b)。提到所述非限定性例子，是为了说明该系统可以对逆转录病毒编码的异源抗体或结合蛋白的所有区进行快速修饰。

    所述重组逆转录病毒载体上的编码所述可变区的外显子可以是单克隆的，以便表达一种特定的特异性，如现有抗体的特异性，它的抗原结合特异性，希望在将稳定转导的preB细胞移植到鼠宿主中之后通过亲和力成熟进行修饰，并且随后免疫(图9)。另外，所述外显子编码可变区可源于多种V(D)J重排的文库。所述V区文库可以从异源的，优选人B淋巴细胞中分离，通过PCR方法，使用简并引物对，扩增多种不同的VH基因家族和JH基因片段(图9)。所述B淋巴细胞可源于免疫过的或未免疫过的个体(激发的与未接触过抗原的所有组成成分)，或源于患有自身免疫病的患者(自身免疫所有组成成分)。另外，可以利用体外组装的V结构域特异性基因片段，构建全合成的V区结构域的文库，所述片段在相当于互补决定区的区域具有随机的核苷酸序列(图9)。

    可以将逆转录病毒构建体的组合，同时或依次转导到preB细胞中，当所述preB细胞在体外或体内分化时，可以表达并且分泌完整的异源免疫球蛋白和二聚结合蛋白(图8)。

    通过上述任何方法进行过遗传修饰，以便它们业已获得了表达异源抗体或结合蛋白的潜力的脊椎动物preB细胞，需要分化成成熟的B系细胞，并最终分化成浆细胞，以便所述异源抗体或结合蛋白可以表达并最终分泌。这一目的可以通过在体外组织培养物中分化实现，或通过将遗传修饰过的preB细胞移植到合适的脊椎动物宿主体内实现。

    因此，优选通过以下方法实现脊椎动物前体B淋巴细胞的体外分化：

    (a)通过在缺少任何前体淋巴细胞生长因子的情况下培养，阻止所述脊椎动物前体淋巴细胞的增殖，并且诱导它分化成成熟的淋巴系细胞，和

    (b)通过在存在至少一种选自下组的成分的条件下进一步培养所述细胞，诱导最终的淋巴细胞分化：

    (i)可溶性T细胞相关的刺激因子，包括白介素-2，白介素-4，白介素-5，白介素-6，白介素-10，白介素-13，TGF-β，和IFN-γ；

    (ii)激活B细胞的共刺激受体的因子，包括对以下成分具有特异性的激动性抗体或活性重组配体：CD40，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，补体受体1(CD35)和2(CD21)，LFA-1(CD11a)，LFA-3(CD58)，CD19，CD20，CD30，CD32，CD37，CD38，CD70，CD71，Igα(CD79α)，Igβ(CD79β)，TAPA-1(CD81)，Fas(CD95)，TNF-受体1(p55，CD120a)，TNF-受体2(p75，CD120b)，Ox-40(CD134)，和淋巴毒素-β受体；和

    (iii)B细胞促细胞分裂因子，1型T细胞非依赖性抗原，和其他多克隆激活剂，包括脂多糖(LPS)，源于格兰氏阴性细菌的脂蛋白，聚阴离子，poly-dldC，美洲商陆有丝分裂原(PWM)，和抗-免疫球蛋白试剂；

    以及它们的组合。

    在组织培养物中进行的体外分化，可以通过两个步骤的方法实现，包括(a)从组织培养基中除去preB细胞生长因子，如IL7，或IL3，这样能抑制preB细胞的增殖，与此同时，能诱导分化成具有成熟的B细胞表型的细胞，并且包括(b)通过所述T细胞相关的和/或有丝分裂原性的，T细胞独立性刺激刺激所述分化的B细胞，以便诱导最终的浆细胞分化。通过除去preB细胞生长因子，使preB细胞最初分化成具有B细胞表型的细胞，伴随着细胞程序死亡的诱导。因此，它是使用超量表达bcl-2或bcl-xL的抗细胞程序死亡基因的优选实施方案。可以通过使用从bcl-2，或bcl-xL转基因动物体内分离的preB细胞，将所述抗-细胞程序死亡基因导入preB细胞，或者通过用任何抗细胞程序死亡基因的超量表达载体转染或转导preB细胞。

    作为遗传修饰过的前体淋巴细胞的体外分化的一种替代，所述细胞在移植到合适的脊椎动物宿主中之后，还可以在体内分化，导致所述细胞转移到次级淋巴器官，并且分化成更成熟的淋巴系细胞。优选将所述淋巴细胞与未接触过抗原的或抗原激发的T辅助淋巴细胞共同移植到所述宿主中，其中，术语′共同移植的′被理解成不局限于确实在同一时间同时移植。根据另一种优选实施方案，在所述体内分化之后，用至少一种需要的免疫原性化合物或组合物对所述宿主进行免疫。

    另外，所述脊椎动物宿主优选是相容性宿主，就内源B细胞，T细胞，和/或NK(天然杀伤)细胞，或它们的组合的产生而言，是缺陷型的。

    正如以前业已针对脊椎动物前体淋巴细胞的合适的来源的选择所作的说明，所述脊椎动物宿主优选选自有颚脊椎动物，包括软骨鱼，硬骨鱼，两栖动物，爬行动物，鸟类和哺乳动物，包括猪，绵羊，牛，马，以及啮齿动物，包括小鼠，大鼠，兔，豚鼠，小鼠是优选的宿主物种。

    用作遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞的移植的受体的合适的宿主，相对淋巴细胞的发育而言，可以是野生型的，或者它们可能优选获得了能抑制内源鼠Ig基因重排的多种顺式作用突变中的任意一种。所述突变可以包括在Ig基因座的增强子元件上发生的突变，如上述EμH和KiE增强子元件，在Ig基因编码区内的缺失，如DH，JH或JL基因片段，和IgC区，包括它们的跨膜外显子，另外，可以使用携带能选择性地抑制B(和T)淋巴细胞发育的反式作用突变的合适的宿主，例如，在所有组成成分系或淋巴细胞特异性转录因子或RAG-1和RAG-2基因上的突变，这些突变是启动V(D)J重组所必需的(Mombaerts等，s.a.；Shinkai等，s.a.)。

    另外，导致免疫缺陷型宿主的反式作用突变，包括在普遍表达的DNA修复基因上的突变，还需要V(D)J重组，如Ku70，Ku86，DNA-依赖性蛋白激酶(DNA-PKcs)的催化亚基，XRCC4，DNA连接酶IV和Artemis。然后，可以用所述遗传修饰过的preB细胞移植具有上述任何突变的仅缺乏B淋巴细胞群，或同时缺乏B和T淋巴细胞的脊椎动物宿主，并且，对于B-和T细胞缺陷型小鼠来说，可以用组织相容性T辅助细胞群共同移植。所述T辅助细胞群优选包括原始T辅助细胞，抗体激发的效应物T细胞群，或记忆T细胞，或它们的任意组合。T辅助细胞群的共同移植可以同时进行，在遗传修饰过的preB细胞移植的实际时间点之前或之后。

    然后，可以将其外周淋巴细胞群业已通过移植修饰过的preB细胞和选择性地共同移植T辅助细胞群部分或完全重构的鼠或脊椎动物宿主用于用任何需要的抗原免疫，以便引起针对所述抗原的免疫应答，并且刺激所述淋巴细胞表达合适的异源受体特异性，这种表达会导致B细胞克隆的增殖性扩增，所编码的异源抗体或结合蛋白的结合结构域的亲和力成熟，以及最终分化成能分泌所述异源抗体或结合蛋白的浆细胞。

    正如通过以上说明可以了解的，本发明的另一种优选实施方案，涉及将可以通过任何上述方法获得的遗传修饰过的和分化的脊椎动物淋巴细胞，用于以本身已知的方法生产任何异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其片段。就此而言，在上述任何用于制备遗传修饰过的和分化的脊椎动物淋巴细胞的方法之后，优选进行以下步骤：

    (a)从所述分化的淋巴细胞中分离至少一种外源遗传元件，和

    (b)将所述遗传元件置于能够生产所述至少一种异源抗体，抗原受体，人工结合蛋白，或其功能性片段的环境中。

    为了实现所需要的免疫球蛋白或免疫球蛋白-样蛋白或其功能性片段的大规模生产，编码感兴趣的多肽的遗传学信息可以从所述细胞中提取，并且转移到不同的表达系统中，在这些系统中，所述遗传信息可以保持，扩增和/或用于生产需要的蛋白或它的一部分。

    更具体地讲，体现所述异源抗体或结合蛋白的编码区的开放读框，可以通过标准分子生物学方法分离，包括用特殊的引物对进行PCR扩增，并且转入不同表达系统的环境中，以便能够连续生产所述异源抗体或结合蛋白。所述表达系统包括体外转录/翻译系统，原核表达系统，如大肠杆菌或真核表达系统，如在酵母细胞，使用杆状病毒感染的昆虫细胞，或哺乳动物细胞中表达。

    上述异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段可以具有一种独特的特异性，并且因此可能是单克隆的，或者可以是由一种以上独特的特异性编码的，并因此可能是多克隆的。

    根据一种优选实施方案，所述异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段完全或部分类似于可以根据人类遗传学所有组成成分组装的人类抗体，抗原受体，或结合蛋白或它们的一部分。

    另外，要生产的所述异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其片段优选选自下组：

    (a)膜结合或分泌的抗体，并且包括存在于天然抗体中的化学计量组合物中的异源重链和轻链多肽，并且包括任何已知的重(μ，δ，γ，α，ε)和/或轻(κ和λ)链同种型；

    (b)具有重链和轻链多肽组合的抗体，就所述一级氨基酸序列而言，它是完全的人抗体；

    (c)含有来自不同脊椎动物物种的异源重链或轻链多肽的杂合抗体；

    (d)全部或部分异源的分泌型Fab，scFv和F(ab′)2抗体片段；

    (e)通过接头肽共价偶联的抗体片段，得到了双特异性或多特异性抗体片段；

    (f)α，β，γ，和δ同种型的T细胞受体，抗原受体，以及其他与所述免疫球蛋白超家族的蛋白结构相似的结合蛋白；

    以及其功能性片段。

    根据另一方面，本发明提供了遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞，和源于它们的更成熟的淋巴系细胞，以及能生产异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段的永生化细胞，其中，所述细胞可以或者业已通过上文所述任何方法获得。

    另外，提供了适合至少部分激活脊椎动物前体淋巴细胞，以便表达内源免疫球蛋白或它的一部分的载体构建体，以及具有编码上文所定义的异源抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段的至少一种外源遗传元件的遗传构建体。

    根据另一方面，本发明提供了药用或诊断制剂，包括通过上述任意一种方法获得的至少一种抗体，人工结合蛋白，抗原受体，或其功能性片段，它具有野生型免疫效应物功能，或不是源于种系编码的异源免疫球蛋白或抗原受体的修饰过的或人工效应物功能。

    正如可以理解的，可以将完全的人或人源化抗体或其功能性片段用于人类疾病的诊断，预防和治疗，例如，它们的与特殊抗原的可变区结构域结合的能力，因此，利用的是通过它们的恒定区结构域介导免疫效应物功能的能力。下面将详细说明可以按照本发明生产的人类单克隆抗体用于人类疾病诊断，预防和治疗的可能的用途。对于诊断用途来说，可以将人类单克隆抗体用于鉴定和观察某些病理学条件，包括将标记过的抗体导入个体的血管系统，在这里可以检测特殊疾病相关的抗原性结构(例如，在某些病理学细胞上表达)。在预防人类疾病方面的用途包括具有抑制某些细胞表面受体-配体系统在病理学状态(拮抗性抗体)的相互作用的能力的抗体，或者相反，在缺少配体的病理学状态下，模拟配体与细胞表面受体(激动性抗体)的结合作用。另外，可以将人类单克隆抗体用于抑制毒性物质，或病原体的作用，例如，在中毒，炎症或感染期间使用。就此而言，人类抗体具有特殊用途，因为它们能介导所述物质和抗原的标记，以便被天然免疫系统的特化细胞除去。还可将人类单克隆抗体用于导向对癌细胞的免疫功能，利用特殊结合改变在恶性肿瘤细胞表面上表达的自身结构。对自身免疫症状来说，还可以利用人类单克隆抗体中和或对抗自身免疫因子(自身抗体，过敏性抗体)的病理学作用。人类单克隆抗体可用于人类疾病的诊断，预防和治疗，因为可以将它们导入个体的血管系统，而又不会导致任何负面影响，因为抗体是血浆和人类的液体成分(例如，黏液，唾液，淋巴液等)的正常组成成分。

    生物材料的保藏

    根据布达佩斯条约的规定，业已将携带用于本发明的遗传元件的质粒交由德意志微生物保藏中心(DSMZ)保藏(Braunschweig，Germany)，保藏日期为2001年12月17日，获得以下保藏号：

    质粒                  保藏号

    pBS-DT4               DSM 14703

    pPGK-hygro            DSM 14704

    pGL2neo(m)+           DSM 14705

    pBS-DT4-tox176        DSM 14706

    以下实验方法，详细披露了利用鼠preB细胞制备人类单克隆抗体的方法，所述细胞是进行过遗传修饰的，以便赋予人类抗体生产的潜力。方法的特定例子如下文所披露的，以便可以对鼠preB细胞进行遗传修饰，以便内源抗体不再能表达，不过，所述人类抗体可以由稳定送递的异源逆转录病毒表达构建体生产。另外，提供了与将所述遗传修饰过的鼠preB细胞移植到合适的鼠宿主中的实验细节，以及与所述移植小鼠的免疫相关的方法，抗体分泌细胞的分离，及其作为永生化单克隆人类抗体分泌型杂交瘤细胞系的建立。尽管所提供的方法是完整的，并且足以用遗传修饰过的鼠preB细胞生产异源的，特别是人类单克隆抗体，不应当将所述方法视为限制性的，而应当视为说明性的。

    实施例

    实施例1：具有分化成成熟的B系细胞潜力的长期增殖的，鼠前体B细胞的建立

    基质细胞和IL7反应性鼠前体B细胞存在于交配后15-18天的小鼠胚胎的胎肝中，存在于成年小鼠的骨髓中，以及存在于新生动物(＜3周龄)的脾脏中(Rolink等，Blood，81，2290-2300，1993)。为了分离所述preB细胞，通过CO2窒息处死小鼠，并且在无菌条件下取出相应的器官。通过取出股骨和胫骨，用消毒过的剪刀打开所述骨的两端，并且使用5ml的一次性注射器和25或26号针头，用2-5ml磷酸缓冲的盐溶液(PBS)冲洗所述骨髓，获得全骨髓细胞。将同样在无菌条件下制备的分离的脾脏或胎肝放置在装有5-10ml PBS的petri培养皿中的无菌200目不锈钢网格上。将所述器官切成碎片，并且用5ml塑料注射器的柱塞轻轻地挤压通过所述金属网格。通过离心洗涤细胞悬浮液1次(200g，10分钟，4℃)，并且重新悬浮在10-20ml PBS中。所有细胞制备是用冰冷的溶液进行的，并且将细胞悬浮液保持在冰上，直到转移到组织培养物中。

    各个preB细胞克隆的建立，是通过在用生长在特殊基质细胞培养基中的半铺满的，3000rad γ-辐射的ST-2(Ogawa等，EMBO J.，7，1337-1343，1988)或PA-6(Kodama等，J.Cell.Physiol.，118，233-240，1984)鼠基质细胞(参见下文)包被的96孔平板上进行限制稀释进行的。对于限制稀释铺板来说，可以使用总的器官细胞群，或者使用B220+或CD19+表面标记阳性B系细胞，所述细胞是通过使用对所述标记特异的商业化抗体，通过荧光或磁性珠活化的细胞分选(FACS或MACS)富集的。

    鼠preB细胞的长期培养物，是在含有100单位的重组白介素-7(IL-7)的特殊无血清培养基中进行的(参见下文)。在限制稀释条件下，在37℃下，在10％CO2气体的潮湿培养箱中培养6-7天内，在基质细胞饲养层上形成了各个preB细胞集落。首先将单个preB细胞集落转移到24孔平板上，然后依次扩增到25cm2，并最终扩增到75cm2的组织培养烧瓶上，一直用3000radγ-辐射过的基质细胞预先包被。在最初的扩增之后，需要将preB细胞密度保持在1×105-2×106preB细胞/ml组织培养基的范围内，需要每隔2-3天对所述细胞进行继代培养。

    建立长期增殖的基质细胞，IL-7依赖性鼠preB细胞所需要的特殊的无血清组织培养基(Iscove和Melchers，J.Exp.Med.，147，923-933，1978)如下(1升培养基的配方)：

    ·11g                   DMEM-粉(不含碳酸氢盐)

    ·10ml                  1M HEPES，pH7.3

    ·33.3ml                7.5％NaHCO3溶液

    ·8ml氨基酸储液，含有以下成分：

    -L-丙氨酸               600mg

    -L-天冬酰胺             520mg

    -L-天冬氨酸             720mg

    -L-谷氨酸               1800mg

    -L-脯氨酸               960mg

    -丙酮酸钠               2640mg

    +1.6ml生物素/维生素B12储液，它含有

    -维生素B12              5.0mg

    -D-生物素               5.0mg

    溶解在20ml+10μl        1M HCl中

    所有成分都溶解在240ml超纯净水中

    ·4ml                   半胱氨酸储液，它含有

    -L-半胱氨酸             1.4g

    溶解在150ml H2O，50ml 1M HCl中

    ·5ml                   10％BSA(牛血清白蛋白)溶液

    ·0.15ml                人类运铁蛋白储液，包括：

    -10ml溶液a)和80μl溶液b)

    a)溶解在10ml DMEM中的1g人运铁蛋白(1.3g/100ml H2O)

    +100μl 1M HEPES，pH7.3

    b)440mmg FeCl3×6H2O+185ml H2O+200μl 1M HCl

    ·5ml                   大豆-脂类储液

    -与45ml DMEM混合的200mg大豆脂(1.3g/100ml H2O)+5ml10％BSA。在冰水中超声波处理3×15分钟。

    ·20ml卡那霉素(5000μg/ml)

    ·30μl                 2-巯基乙醇(1.43M)

    ·105U                 重组小鼠白介素-7(IL7)

    所有成分都溶解在最终体积为1000ml的三重蒸馏的超纯净水中，过滤消毒，并且在4℃下保存待用。

    ST-2或PA-6基质细胞饲养细胞，需要生长在以下特殊的含有低浓度血清的培养基中(1升体积的配方)：

    ·17.7g         IMDM-粉(无碳酸氢盐)

    ·3g            NaHCO3

    ·10ml          100×非必需氨基酸(GIBCO-BRL)

    ·10ml          100×青霉素/链霉素(GIBCO-BRL)

    ·1ml           5mg/ml猪胰岛素溶液

    ·1ml           50mM 2-巯基乙醇

    ·3ml           10％ primatone(超滤，以便排除＞10kD的蛋白)

                    (来源：Quest International，Naarden，NL)

    ·20ml          胎牛血清

    将所有成分溶解在最终体积为1000ml的三重蒸馏的超纯净水中，过滤消毒，并且在4℃下保存待用。

    实施例2：在体外将鼠前体B细胞逐步分化成抗体分泌型浆细胞

    长期增殖的基质细胞和IL7依赖性鼠preB细胞，保留了它们的分化成更成熟的B系细胞的潜力(Rolink等，EMBO J.，10，327-336，1991)，所述细胞可以在体外获得。这种分化可以分两个步骤进行，首先，诱导分化成具有成熟的B细胞表型的细胞，其次，通过诱导分化成具有抗体分泌型浆细胞表型的细胞。

    第一个分化阶段，是通过在连续存在基质细胞的条件下，从preB细胞中除去IL7实现的。为此，从增殖的培养物中收获preB细胞，用缺少IL7的无血清preB细胞培养基洗涤3次，以1-2x106细胞/ml的密度铺板到不存在IL7的新的3000radγ-辐射的基质细胞上。在3天时间内，preB细胞停止增殖，并且分化成具有不成熟的B细胞表型的细胞。所述表型改变包括，例如，c-kit的丧失，λ5和VpreB表达，以及获得CD25和CD40的表达。在来自野生型小鼠的preB细胞中，这种分化还伴随着在IgH链基因座上发生的VH到DJH的重排，随后是在IgL链基因座上进行的VL到JL的重排，这可能导致表面结合的IgM抗体在分化的B系细胞上的表达(Rolink等，EMBO J.，10，327-336，1991)。不过，必须指出的是，IgH和L基因片段的有序的重排，不是所述preB细胞在体外进行表型分化的先决条件(Grawunder等，Int.Immunol.，7，1915-1925，1995)。

    第二个分化阶段可以用激动性抗-CD40抗体或LPS与诸如IL4，IL5，IL10或TGF-β的细胞因子组合刺激缺少IL7的细胞而实现。这种处理会诱导增殖，与各种Ig基因同种型的类别转换重组(取决于所采用的细胞因子组合)，并最终分化成抗体分泌型浆细胞。在诸如抗-CD40/IL4刺激的场合下，在preB细胞组织培养基中洗涤细胞3次，在存在100U/ml IL4和5μg/ml抗-CD40单克隆抗体的前提下铺板到新的，亚铺满的3000radγ-辐射的基质细胞上，培养4-6天。通过激活的细胞分选(FACS)，根据导致明显增加的正向散射值的它们的大的体积，鉴定并且分离增殖的浆细胞阶段细胞。

    野生型preB细胞的体外分化，通常伴随着由于取消生长因子诱导的细胞程序死亡而造成的细胞的大量减少。通过诸如bcl-2或bcl-xL的抗细胞程序死亡基因在所述细胞中的超量表达，可以克服这一问题(Rolink等，J.Exp.Med.，178，1263-1270，1993)。这一目的可以通过从含有B系特异性表达的bcL-2转基因的小鼠中分离preB细胞(Strasser等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，166，175-181，1990)，或通过将bcl-2编码重组逆转录病毒转导到长期增殖的基质细胞和IL7依赖性鼠preB细胞中而实现(参见下文)。

    实施例3：克隆用于鼠Bcl2超量表达的逆转录病毒表达构建体

    将基因稳定转导到长期增殖的基质细胞和IL7依赖性鼠preB细胞中的先决条件是，构建含有感兴趣的基因表达盒的重组逆转录转移载体。逆转录转移载体包括逆转录病毒5′和3′长末端重复(LTR)序列，其侧翼为逆转录病毒包装信号Psi(+)，多克隆位点(MCS)，可以将异源序列插入该位点，以及在大肠杆菌中复制和保持所述载体所需要的细菌质粒控制元件。空的逆转录病毒转移载体的例子，是可以通过商业渠道获得质粒pLIB(Clontech)(图11a)。

    为了构建含有抗细胞程序死亡基因bcl-2的逆转录病毒表达载体，采用了共同表达鼠bcl-2cDNA和潮霉素B药物选择标记的方法，包括用内部核糖体进入序列(IRES)连锁bcl-2和潮霉素B的表达，使两种构建体能够同时表达，可以用能同时选择表达抗-细胞程序死亡基因bcl-2的细胞的抗生素药物潮霉素B进行选择。用于bcl-2和潮霉素BcDNAs连锁表达的逆转录病毒载体的制备分两个阶段进行，首先，组装启动子-bcl-2-IRES-潮霉素B表达盒，其次，将该表达盒克隆到逆转录病毒转移载体pUB的MCS上(图11a+b)。

    (a)启动子-bcl-2-IRES-潮霉素B表达盒的构建

    将鼠bcl-2cDNA和潮霉素B药物抗性标记的开放读框(ORF)克隆到通过商业渠道获得的CMV-启动子/IRES载体pIRES(Clontech)上。为此，使用以下引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)由质粒pPGK-hygro(SEQ ID NO 1)扩增潮霉素B ORF：

    SEQ ID NO.5(P001) 5′-cgTCTAGAccatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg-3′，和

    SEQ ID NO.6(P002) 5′-catGCGGCCGCtattcctttgccctcggacgagtgctgggg-3′

    还添加了含有限制性内切核酸酶XbalI和NotI的其他限制酶识别位点(用大写字母表示)(位于所述限制酶识别序列5’的2-4个随机的核苷酸)，这是因为如果所述识别序列直接位于PCR扩增的DNA片段末端，大部分限制酶不能有效消化DNA。这些侧翼核苷酸是用小写字母表示的，以便突出显示所述限制酶识别位点。位于突出显示的限制位点下游或3’的序列相当于待扩增的片段的DNA序列。在对实验性实施例的说明中保持引物序列的这种表示方式。用引物P001和P002进行的PCR，能扩增具有1017个碱基对(bp)的DNA片段，它含有位于该片段末端的限制性内切核酸酶XbalI和NotI的独特的识别位点。用XbalI和NotI限制酶对所述PCR片段进行双重消化，然后定向克隆到XbalI/NotI双重消化过的pIRES质粒上，以便制备质粒构建体plRES-hygroB(图11a)。从小鼠脾脏mRNA中分离鼠bcl-2αcDNA的ORF，并且通过逆转录酶偶联的聚合酶链式反应(RT-PCR)，使用根据公开的NCBI-Genbank序列M16506和L31532设计的以下引物(结合在M16506的1821-53号位置上的引物P003，和结合在L31532的506-535号位置上的引物P004)进行扩增：

    SEQ ID NO.7(P003) 5′-attGCTAGCatggcgcaagccgggagaacagggtatgataac-3′和

    SEQ ID NO.8(P004) 5′-cgcACGCGTcacttgtggcccaggtatgcacccagagtg-3′

    它们含有NheI和MluI的限制酶识别位点(用大写字母表示)。然后将大小为699bp的NheI/NotI双重消化的PCR产物，直接克隆到NheI/MluI双重消化的载体pIRES-hygroB上，以便制备pBcl2-IRES-hygroB。

    (b)逆转录病毒Bcl-2表达转移载体的构建

    由于在空的逆转录病毒转移载体pLIB和双重bcl-2/潮霉素B表达载体pBcl2-IRES-hygroB上的多克隆位点上缺少相容性限制酶位点，通过PCR方法，使用合适的限制酶识别位点，将包括组成型CMV启动子和聚腺苷酸化位点的Bcl-2-IRES-潮霉素B的完整的表达盒克隆到pLIB上。为此，通过PCR扩增CMV-bcl2-IRES-潮霉素B表达盒，用pBcl2-IRES-hygroB作为PCR模板，使用以下引物：

    SEQ ID NO.9(P005) 5′-atatGTCGACtcaatattggccattagccatattattcattg-3′和

    SEQ ID NO.10(P006) 5′-ccggATCGATccttatcggattttaccac-3′

    它们含有SalI和ClaI的限制酶识别位点(用大写字母表示)。然后，将SalI/ClaI双重消化过的大小为3714bp的PCR产物直接克隆到SalI/ClaI双重消化过的pLB载体上，从而产生能够连锁表达bc1-2和潮霉素B的逆转录病毒转移载体pLIB-bcl2-IRES-hygroB。

    实施例4：长期增殖的基质细胞和IL7依赖性鼠preB细胞的逆转录病毒转导

    将遗传元件稳定转入鼠preB细胞的一种方法，是使用逆转录病毒转导(图8)。对于该方法来说，将含有逆转录病毒基因组包装所必需的逆转录病毒序列(5′LTR，包装信号Psi(+)，3′LTR)以及感兴趣的异源序列或基因的重组DNA构建体，瞬时或稳定地转染到能以组成型形式表达生产逆转录病毒颗粒所需要的表达基因的包装细胞系中。

    对于基质细胞和IL7依赖性鼠preB细胞的转导来说，可以使用亲嗜性逆转录病毒包装细胞系GPE(Markowitz等，J.Virol.，62，p.1120-1124，1988)，它通常会导致preB细胞以50-80％的效力稳定转导。这种亲嗜性包装细胞系与(重组)逆转录病毒转移载体的组合，只会产生能够鼠细胞的复制缺陷型(重组)逆转录病毒。正如以下详细说明的，为了瞬时转染亲嗜性GPE包装细胞系，使用标准磷酸钙转染：

    (a)亲嗜性逆转录病毒包装细胞系GPE的瞬时转染：

    将在基于IMDM的低浓度血清培养基中生长的GPE细胞同样用于ST-2和PA-6基质细胞，并且如实施例1所述。在转染之前1天，通过胰蛋白酶化，收获贴壁GPB包装细胞，并且以50％的铺满度接种到新的基于IMDM低浓度血清培养基中，并且，在10％CO2中，在37℃下培养。次日，通过标准磷酸钙沉淀方法，用20μg逆转录病毒DNA转染每一个T75(75cm2)组织培养烧瓶的GPE细胞。转染后24小时，可以将转染过的GPE细胞用于将重组逆转录病毒转染到preB细胞中。

    (b)用转染过的GPE细胞培养物上清液对preB细胞进行逆转录病毒转导或用转染的GPE细胞共培养：

    可以将两种方法相互交换地用于转导通过转染过的GPE细胞产生的重组逆转录病毒：第一种方法取决于用调节过的细胞培养物上清液感染preB细胞。为此，在转染之后24小时，更换来自转染过的细胞的细胞培养基，并且在细胞培养另外24小时之后收获。然后在8μg/mlpolybrene存在下，将含有细胞培养物上清液的重组逆转录病毒以1∶8(体积)-1∶1(体积)的比例添加到增殖的preB细胞培养物中，并且在37℃下继续培养3-6小时。然后收获细胞，除去含有polybrene/逆转录病毒的培养基，并且将细胞以1-2×105的密度，铺板到含有100UrIL7的preB细胞培养基中的新的3000radγ-辐射过的基质细胞上。在24小时之后，收获逆转录病毒转导的preB细胞。

    第二种方法取决于preB细胞与转染过的，重组逆转录病毒生产性GPE细胞的共培养。为此，收获对数期preB细胞，并且以2-4×105细胞的密度，重新悬浮在含有100U rIL7和8μg/ml polybrene的新的preB细胞培养基中，并且在用逆转录病毒构建体转染之后24小时，铺板到转染过的preB细胞上。在37℃下，将preB细胞共培养6小时，然后收获所述细胞，并且铺板到在含有100U rIL7培养基中的新的3000radγ-辐射过的基质细胞上，以便回收。然后，收获逆转录病毒转导的preB细胞，并且可以在24小时之后使用。

    实施例5：内源免疫球蛋白重链和轻链基因座在长期增殖的鼠前体B细胞中的失活

    用鼠前体B细胞制备异源的，优选人类抗体的第一个步骤，是使内源的小鼠IgH和IgL失活，除其他方法之外，这一步骤可以通过在preB细胞内的免疫球蛋白基因座内的基因导向实现。理论上讲，可能需要使所有三个鼠免疫球蛋白基因座，即IgH，IgκL和IgλL链基因座失活。不过，鼠λL链基因座只包括三个功能性V-J-C簇，各自具有一个基因片段，和包括在λL链上的非常有限的多样性。另外，低于5％的鼠B细胞表达λL链基因座。因此，在实际上，它足以使内源的，鼠IgH和κL链基因座失活，以便确保在转移异源IgH和IgκL链基因或基因座时，由preB细胞产生的大量B细胞(＞95％)能表达异源抗体。

    (a)具有天然存在的不能恢复的非功能性IgH等位基因的preB细胞的分离

    一般来说，使内源IgH和κL链基因座失活的控制最好的方式，是使用基因导向(参见下文)。不过，对于IgH链基因座来说，可以采用另一种方法：

    长期增殖的基质细胞IL7依赖性鼠preB细胞，在它们的两个重链等位基因上都具有DJH重排。由于D与JH结合过程的不精确性，可以发生所述DJH重排，以便D基因片段能够相对JH基因片段的固定的读框以三种可能的读框形式读出。以上读框被随意命名为读框I，II和III(Kaartinen和Makela，Immunol.Today，6，p.324-330，1985)。如果DJH连接发生在读框III上(Kaartinen和Makela，s.a.)，大部分D基因片段包括终止密码子，以便功能性H链绝对不可能由重链等位基因表达。

    因此，从统计学角度讲，所有基质细胞，IL7依赖性preB细胞的大约1/9(11.1％)，在读框III上都具有DJH重排，在它们的两个IgH链等位基因上具有终止编码序列。可以通过在限制稀释条件下亚克隆分离所述preB细胞，并且筛选需要的非功能性重排。为了确保稳定克隆的分离，需要对重排进行筛选，筛选两种非功能性DJH4基因重排，这种重排不能通过二次重排恢复，因为最后的JH基因片段业已被用完。可以将所述克隆用于κL链等位基因的其他定向失活。

    (b)鼠IgH和IgκL链基因座的定向构建体的制备

    提供了导致内源IgH和IgκL链基因座的基因导向失活方法的两种例子，作为很多顺式作用突变的例子，它们都能类似地导致没有表达内源IgH和IgκL链蛋白潜力的preB细胞(图5a，b)。对于两种定向方法来说，首先，需要构建空的阳性-阴性基因导向载体，它包括独特的克隆位点，可以插入与靶基因座同源的DNA序列，阳性药物选择标记，如新霉素或嘌呤霉素，其侧翼为loxP位点和阴性选择标记，如白喉毒素，或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，它可以对所述基因导向载体随机整合到细胞的基因组进行筛选。LoxP侧翼(floxed)阳性选择标记的存在，使得可以用相同的抗生素，在相同的细胞克隆中进行两个等位基因的顺序基因导向，因为在第一个等位基因的成功定向之后，在去除位于关联的loxP识别位点之间的所有核苷酸序列的cre重组酶瞬时表达时，可以将抗生素抗性标记从细胞中去除。所述空的阳性-阴性导向载体是按以下方法构建体的(图6a，b)：

    步骤1：延伸pBluescript SK(+)的多克隆位点

    通过在50μl的50mM Tris/HCl，100mM NaCl，pH8.0中混合100pmol的以下两个互补的合成DNA寡聚体的每一个寡聚体进行退火

    SEQ ID NO.11(P007)

    5′-TCGAccggtacctaggcgcgccatcgatatcgctagctcgagctcagatctGTAC-3′和

    SEQ ID NO.12(P008)

    5′-agatctgagctcgagctagcgatatcgatggcgcgcctaggtaccgg-3′。

    然后，在95℃下使该混合物变性2分钟，并且，在20分钟之内，从65℃缓慢冷却到室温。由此会产生具有XhoI和KpnI相容性突出末端的以下双链DNA接头(用大写字母表示)：

    5′-TCGAccggtacctaggcgcgccatcgatatcgctagctcgagctcagatctGTAC-3′

            |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

        3′-ggccatggatccgcgcggtagctatagcgatcgagctcgagtctaga-5′

    然后将退火的合成DNA接头连接到XhoI-KpnI线性化的，通过商业渠道获得的pBluescriptSK(+)(Stratagene)上，得到了含有以下克隆步骤所需要的延伸的多克隆位点(MCS+，参见图6a)的质粒pBSL。

    步骤2：插入野生型或减毒的白喉毒素α的表达盒，作为定向构建体随机整合的阴性选择标记

    作为能够对基因导向构建体的随机染色体整合进行选择的阴性选择标记，可以使用受组成型β-肌动蛋白启动子控制的白喉毒素α(McCarrick等，s.a.)或它的减毒形式白喉毒素α(DT-αtox176)(Maxwell等，s.a.)的表达盒。尽管诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的其他阴性选择标记，通常被用于使用小鼠胚胎干细胞进行的基因导向实验中，业已证实白喉毒素α及其减毒的突变体tox176能够在基质细胞中实现基因导向(Grawunder等，Mol.Cell，2，p.477-484，1998)。所述白喉毒素表达盒是以2.1kbBg lII-XbalI片段形式，从质粒pBS-DT4(SEQ ID NO.2)或pBS-DT4 tox176(SEQ ID NO.3；参见图6a)中分离的，并且连接到BglII-NheI线性化的pBSL上，分别得到了质粒pBSL-DT4和pBSLDT4tox176(参见图6a)。

    步骤3：将loxP侧翼的阳性药物选择标记插入pBSL-DT4和pBSLDT4tox176上，以便制备空的基因导向载体

    制备阳性/阴性基因导向载体的下一个步骤是将阳性药物选择标记插入pBSL-DT4或pBSL-DT4-tox176载体，位于白喉表达盒的上游。作为典型例子，示出了将侧翼为loxP位点的新霉素，嘌呤霉素和潮霉素B表达盒插入pBSL-DT4的白喉毒素α表达盒的上游。不过，应当指出的是，相同的克隆方法可应用于pBSL-DT4tox176载体，它含有减毒形式的白喉毒素α。另外，可以使用能够产生对组胺醇，霉酚酸，博莱霉素或zeocin的抗性的其他阳性药物选择标记。

    在每一种情况下，所述阳性抗生素选择标记盒的侧翼都是loxP位点，所述位点可以由cre重组酶识别，并且可将其用于通过cre重组酶表达载体的瞬时转染，消除位于loxP位点之间的药物选择标记，以便随后使用相同的选择标记。

    i)floxed新霉素抗性盒的插入：

    侧翼为loxP位点的新霉素抗性盒，能够以1497bp Bsp1201-Xba1消化过的DNA片段形式，从质粒pGL2neo(m)+(SEQ ID NO.4)中分离，并且连接到NotI-XbalI线性化的pBSL-DT4上，以便制备空的空导向载体pBSL-fineo-DT4。

    ii)floxed嘌呤霉素和潮霉素B盒的克隆(图6b)：

    由于除了新霉素之外的floxed抗生素选择标记是很罕见的，将侧翼为loxP的嘌呤霉素或潮霉素B标记的片段插入pBSL-DT4的必须步骤，是插入两个loxP位点的预备步骤。这一目的可以通过插入pBSL-DT4退火的合成DNA寡聚体而实现。合成的loxP位点包含在以下两种互补性DNA寡聚体上：

    SEQ ID NO.13(P009) 5′-

    CTAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACGCGTATAACTTCGTATAG

    CATACATTATACGAAGTTAT-3′和

    SEQ ID NO.14(P010) 5′-

    CTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTATAACTTCGTA

    TAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′

    按实施例5(b)步骤1所述方法对这两种DNA寡聚体进行退火，得到了双链DNA片段，该片段包括由独特的MluI限制位点隔开的两个loxP位点。另外，退火的合成DNA寡聚体包括两个5′-CTAG单链突出末端，可将其直接连接到相容性限制位点突出末端上(例如，通过SpeI，NheI，XbalI，或AvrII限制酶产生)。

    然后，将含有退火的两个loxP位点的DNA片段连接到SpeI线性化的pBSL-DT4上，得到了载体pBSL-DT4-2loxP(图6b)。

    嘌呤霉素或潮霉素B抗性的表达盒可以分别用质粒pPur(Clontech)或pPGK-hygro(SEQ ID NO.1)作PCR模板进行PCR扩增。用于从pPur(包括受猴病毒40早期启动子控制的嘌呤霉素ORF)扩增1366bp的嘌呤霉素表达盒的引物是：

    SEQ ID NO.15(P011) 5′-

    tcgACGCGTggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaag-3′和

    SEQ ID NO.16(P012) 5′-

    tcgACGCGTttggacaaaccacaactagaatgcagtg-3′

    两种引物都包括限制性内切酶MluI的识别位点(用大写字母表示)，以便所得到的PCR产物，可以用这种限制酶克隆。

    在对分离的PCR产物进行MluI消化之后，将嘌呤霉素标记片段连接到MluI线性化的pBSL-DT4-2loxP上，制备空的导向载体pBSL-flpur-DT4(图6b)。

    用于由pPGK-hygro(SEQ ID NO.1；包括受磷酸甘油酸激酶启动子控制的潮霉素B ORF)PCR扩增2007bp的潮霉素B表达盒的引物是：

    SEQ ID NO.17(P013) 5′-

    tcgACGCGTgaattctaccgggtaggggaggcgcttttc-3′和

    SEQ ID NO.18(P014) 5′-

    tcgACGCGTggaattagaacttggcaaaacaatactgag-3′

    两种引物都包括所述限制性内切酶MluI的识别位点(用大写字母表示)，以便可以消化所得到的PCR产物，并且用该限制酶连接。

    在对分离的PCR产物进行MluI消化之后，将潮霉素B标记片段连接到MluI线性化的pBSL-DT4-2loxP上，制备空的导向载体pBSL-flpur-DT4(图6b)。

    步骤4：克隆鼠IgH和κL链基因座，以及RAG1基因的最终的导向载体

    作为克隆内源基因座的导向载体的典型例子，披露了用于在鼠preB细胞中进行的内源IgH和IgκL链基因座的顺式作用定向突变，以及RAG1基因的反式作用突变的基因导向载体的克隆方法。

    i)IgH链导向载体的构建(图5a)

    内源鼠IgH链基因座在preB细胞中的失活，可以通过在两个IgH链的等位基因上产生很多不同的顺式作用定向缺失而实现。例如，一种IgH失活缺失，是缺失所有DH和JH基因片段，在这里它是作为使内源IgH等位基因不能生产内源免疫球蛋白的可能性之一披露的。在这里，用″floxed″新霉素定向构建体作例子，说明了导向载体的构建(参见图5a)。为了克隆含有诸如嘌呤霉素或潮霉素B的其他阳性抗生素选择标记的基因导向载体，可以采用类似方法。

    基质细胞，IL7依赖性鼠preB细胞，通常在两个等位基因上具有DJH重排(参见上文)。在设计导向载体时，需要考虑这一事实。无论DJH重排的类型如何，在所有preB细胞中的两个IgH等位基因上仍然存在介入可变基因片段和D基因片段簇之间的DNA，以及位于JH基因簇和Cμ编码区之间的介入序列。因此，DJH重排等位基因的导向载体，必须包括位于大部分5′定位的D因子(DFL16.1)上游和大部分位于3′JH基因片段(JH4)下游的同源区。

    在图5a中示出了一种可能的DFL16.1-JH4重排的等位基因与周围的基因组DNA序列的基因组组构。作为基因导向的一般方法，将被删除的位于所述区或基因上游的DNA序列同源性的短的片段(1-1.5kb)克隆到位于″floxed″阳性选择标记上游的独特的限制酶识别位点(这里是NotI)上，并且将要删除的位于所述区或基因下游的DNA序列同源性的较长的片段(＞2.5kb)克隆到位于″floxed″阳性选择标记和白喉毒素α表达盒之间的独特的限制酶识别位点上(图5a)(这里是AscI)。因此，如果同源重组发生在所述导向载体的DNA序列同源性的长的片段和所述内源基因座上，仅仅抑制了所述阳性选择标记(白喉毒素α)的表达，以便在所述导向载体定向整合到所述染色体DNA上时，所述DT-α表达盒会丢失。如果同源重组还发生在所述短的同源臂上，位于所述双交换之间的片段会被所述阳性药物筛选标记所取代。因此，在用所述定向构建体转染的preB细胞上使用抗生素筛选，得到了通过同源重组进行的所述导向载体的定向整合的有效选择，导致了所述内源基因座的缺失。

    可以用以下引物，由小鼠基因组通过PCR扩增位于大部分5′D因子(DFL16.1)上游的同源性的短的片段，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列AF018146设计的：

    SEQ ID NO.19(P015) 5′-

    aatGCGGCCGCgaacctcctgtgttgcaagcacaaatggg-3′和

    SEQ ID NO.20(P016) 5′-

    aatGCGGCCGaggcagcacggttgagtttcagttgtcatc-3′

    为了克隆目的而导入的附加的NotI限制酶识别位点的核苷酸序列，用大写字母表示。所述引物能够扩增可以用NotI限制酶消化的1465bp的基因组PCR片段，并且连接到NotI线性化的pBSL-flneo-DT4上，制备pBSL-5′JH-flneo-DT4(图5a)。位于JH基因片段簇下游的序列同源性长片段，还包括EμH重链内含子增强子，可以用以下引物由小鼠基因组DNA进行PCR扩增，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列文件J00440设计的(附加的AscI限制酶识别位点的核苷酸用大写字母表示)：

    SEQ ID NO.21(P017)

    5′-ttGGCGCGCCgtaagaatggcctctccaggtctttatttt-3′和

    SEQ ID NO.22(P018) 5′-

    ttGGCGCGCCagctcagctcagctcaccccagctcagctc-3′

    可将所述引物用于通过PCR方法扩增来自小鼠基因组DNA的3215bp的基因组PCR片段，可以用AscI限制酶消化所述片段，并且连接到AscI线性化的pBSL-5′JH-fineo-DT4上，得到最终的JH导向载体pBSL-5′JH-flneo-3′JH-DT4，可将该载体用于删除DJH重排的preB细胞中的所有其余的DH和JH基因片段(图5a)。

    ii)κL链导向载体的构建(图5b)

    与IgH链基因座的情形类似，κL链基因座可以通过若干顺式作用突变激活，例如，包括删除所有的JK基因片段，KL链内含子增强子(KiE)，恒定KL链区(CK)，或3′K增强子(3′KE)。作为一种例子，可以将本文所披露的定向构建体和方法，用于定向删除所有JK基因片段。另外，本文所披露的定向构建体的构建，只是为了提供包括″floxed″新霉素抗性标记的定向构建体。含有″floxed ″嘌呤霉素或潮霉素B表达盒的定向构建体，是以类似方式进行的。使用以下引物，由小鼠基因组DNA，通过PCR扩增JK基因片段簇上游的同源性短的片段，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank条目V00777设计的(用于克隆目的的附加的NotI限制酶识别位点的核苷酸用大写字母打印)：

    SEQ ID NO.23(P019) 5′-

    tatGCGGCCGcttatctttctcctttattaacggttgctg-3′和

    SEQ ID NO.24(P020) 5′-

    tatGCGGCCGCacagtggtagtactccactgtctggctg-3′

    引物P019与NCBI-Genbank条目V00777的1-30号位置结合，而引物P020与711-738号位置结合。所得到的738bp PCR片段用NotI限制酶消化，并且连接到NotI线性化的空导向载体pBSL-flneo-DT4上，制备pBSL-5′JK-flneo-DT4上(图5b)。位于JK基因片段簇下游的DNA序列同源性的长的片段包括κiE和恒定κL链区(Ck)，该片段是用以下引物由小鼠基因组DNA通过PCR扩增的，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank条目V00777设计的(附加的AscI限制酶识别位点的核苷酸用大写字母打印)：

    SEQ ID NO.25(P021) 5′-

    ttGGCGCGCCtgtgtaagacacaggttttcatgttaggag-3′和

    SEQ ID NO.26(P022) 5′-

    ttGGCGCGCCtgcttcgccaagtttactgggtaggttg-3′

    引物P021能结合NCBI-Genbank序列V00777的2129-2158号位置，而引物P022能结合它的5456-5483号位置。用AscI限制酶消化所得到的3379bp PCR片段，并且连接到AscI线性化的载体pBSL-5′JK-flneo-DT4上，制备pBSL-5′JK-flneo-3′JK-DT4上(图5b)。

    iii)RAG基因座导向载体的制备(图5c)：

    作为通过在IgH和IgκL链基因座内导入顺式作用突变使preB细胞表达内源免疫球蛋白潜力失活的一种替代方案，还可以通过导入反式作用突变，使得preB细胞不能对它们的内源Ig基因进行重排。例如，这一目的可以通过导向Ig基因重排所必需的两个重组激活的(RAG)基因之一而实现。在它的RAG-1或RAG-2基因上具有缺失的鼠preB细胞，不能够重排免疫球蛋白基因片段，并因此不能表达内源免疫球蛋白。

    为了一种例子，披露了导向载体的构建，以便能够完全删除RAG-1基因的ORF。通过以下引物对扩增位于RAG-1编码区上游的大约1kb的基因组序列的DNA序列同源性的短臂，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列AC084753设计的：

    SEQ ID NO.27(P023)

    5′-tataGCGGCCGcttctgctcctcttctttagtactggattc-3′和

    SEQ ID NO.28(P024) 5′-

    tataGCGGCCGCgttggctaagctacctgggaacaatggggg-3′

    用大写字母突出表示附加在每一种引物5’末端的NotI克隆位点，并且将其用于克隆包括位于RAG-1开放读框上游的基因组区的1095bp的PCR片段(图5c)。用NotI消化所述PCR产物，并且连接到阳性-阴性导向载体，例如，pBSL-fineo-DT4的独特的NotI位点上。分别包括处在正确方向的位于RAG-1编码区上游的短的同源性臂的质粒克隆，并且命名为DBSL-5′R1-fineo-DT4。

    为了克隆RAG-1基因的定向构建体的所述长臂，通过以下引物对扩增直接位于RAG-1编码区下游的大约3kb的基因组区(图5c)，所述引物对是根据Genbank序列AC084753设计的：

    SEQ ID NO.29(P025) 5′-

    ttGGCGCGCCataggatctccacatagaagttggtatttgcc-3′和

    SEQ ID NO.30(P026)

    5′-ttGGCGCGCCgtgggcacacatatgtcatcccagttaccc-3′

    将AscI限制酶的识别序列附加在每一种引物的5’末端，并且用于克隆含有位于RAG-1开放读框下游的DNA序列同源性的长臂的2954bp的长的PCR片段。在AscI消化之后，将该PCR产物克隆到载体pBSL-5′R1-flneo-DT4的独特的AscI限制位点上。分离含有正确取向的位于RAG-1编码区下游的同源性长臂的质粒克隆，并且命名为pBSL-5′R1-fineo-3′R1-DT4(图5c)，并且能够直接用于定向删除preB细胞中的内源RAG-1基因。

    步骤5：导向长期增殖的基质细胞，IL7依赖性鼠preB细胞中的内源基因座

    为了依次定向删除内源基因座的两个等位基因，可以采用两种不同的方法。一种方法是使用对导向于所述两种不同等位基因的不同阳性选择标记的导向载体。或者，另一种方法是将相同的定向构建体两次用于依次导向于两个内源等位基因。不过，对于后一种方法来说，对第一个等位基因的导向，必须紧跟着进行转入preB细胞的编码cre-重组酶的表达载体的瞬时表达，这将导致侧翼为loxP位点的药物选择标记的永久性删除，以便可以将相同的抗生素药物选择用于其他等位基因的第二次定向。

    作为一种例子，披露了按照第一种方法依次导向内源基因的两个等位基因的实验方法，即使用具有两种不同抗生素抗性标记(嘌呤霉素和潮霉素B)的导向载体。

    为了导向于第一个等位基因上的基因座，将20μg线性化的具有嘌呤霉素抗性标记的导向载体转染到悬浮在PBS中的107preB细胞中，转染是通过使用BioRad电穿孔仪和0.4cm的电穿孔仪样品池，在350V的电压下，以960μF的电容，通过电穿孔进行的。然后将所述细胞以5×104细胞/孔的密度铺板到96孔平板培养物的IL7生长培养基中，所述平板是用3000rad辐射的嘌呤霉素抗性ST-2基质细胞的亚铺满层覆盖的。在转染之后30小时，以2μg/ml的最终浓度添加嘌呤霉素。在转染之后7-10天，分离嘌呤霉素抗性集落，并且在用2μg/ml嘌呤霉素连续选择的条件下，在新的，辐射过的和嘌呤霉素抗性ST-2基质细胞上扩增。通过标准PCR和基因组southern印迹杂交分析，分析单一嘌呤霉素抗性PreB细胞克隆的所述导向载体向一个等位基因中的定向整合。然后再次转染在一个等位基因上具有定向整合的所述导向载体的PreB细胞克隆，这一次转染是使用20μg线性化的包括潮霉素B抗性标记的导向载体在与上文所述相同的条件下进行的。然后以5×104细胞/孔的密度，将转染过的PreB细胞铺板到96孔平板培养物上的IL7生长培养基中，所述平板是用3000rad辐射过的嘌呤霉素和潮霉素B双重抗性ST-2基质细胞亚铺满层覆盖的。在转染之后30小时，通过添加2μg/ml嘌呤霉素和400μg/ml潮霉素B，选择双重抗性PreB细胞克隆。在转染之后7-10天，分离嘌呤霉素和潮霉素B双重抗性克隆，并且在用2μg/mL嘌呤霉素和400μg/ml潮霉素B连续选择的条件下，在新的，辐射过的和嘌呤霉素/潮霉素B双重抗性ST-2基质细胞上扩增。分析单个嘌呤霉素/潮霉素B双重抗性PreB细胞克隆的所述导向载体通过标准基因组PCR和/或southern印迹分析向所述第二个等位基因的定向整合。

    然后，可以用组成型cre-重组酶表达载体，瞬式转染具有两个定向等位基因的嘌呤霉素/潮霉素B双重抗性PreB细胞克隆，以便在其他基因座和等位基因上重复基因导向实验。这一目的可以通过用10μg超螺旋cre-重组酶表达载体，通过电穿孔按上述方法瞬时转染PreB细胞而实现。然后，在IL-7生长培养基中限制稀释条件下，将所述瞬时转染过的细胞铺板到若干个96孔平板上的3000rad辐射过的亚铺满的ST-2基质细胞上。在培养7天之后，将一组48个克隆复制铺板到正常ST-2基质细胞上，进行连续培养，并且在相应的选择条件下，铺板到嘌呤霉素抗性或潮霉素B单一抗性ST-2细胞上。变得对两种抗生素药物敏感的以前的嘌呤霉素/潮霉素B双重抗性PreB细胞克隆，有可能发生了cre-重组酶介导的两个loxP侧翼抗性标记的缺失。一旦通过southern印迹分析证实了有cre-重组酶介导的所述两个抗性标记的缺失，所述克隆可以进行针对其他内源基因座和等位基因的其他基因导向方法。

    实施例6：人免疫球蛋白多肽逆转录病毒表达构建体的构建

    为了对鼠基质细胞，IL7依赖性preB细胞的人免疫球蛋白的生产进行重新编程，可以使用编码人抗体多肽的新型逆转录病毒表达载体。披露了用于制备重组逆转录病毒载体的方法，可以根据B细胞分化阶段，首先作为膜结合蛋白，随后作为分泌型免疫球蛋白调控表达人IgH和L链蛋白。应当指出的是，可以将任何类型的异源结合蛋白克隆到所述逆转录病毒载体上，以便能够表达任何类型的异源和人类结合蛋白。因此，本文所披露的对表达人IgH和IgL链的逆转录转移载体的克隆的说明，仅仅被视为是说明性质的，而不是排他性质的。重组逆转录病毒载体可以容纳高达7-10kb的异源DNA序列，它需要设计IgH和L链糖蛋白的独立的构建体，包括所有需要的细胞类型和分化阶段特异性启动子，增强子和控制元件，以及内源Ig基因剪接信号。所述控制元件是确保在各种B细胞分化阶段的正确表达，免疫球蛋白的膜沉积和分泌，它们的亲和力成熟，以及异源抗体在浆细胞中的高水平分泌所必需的。可以将IgH和L链的独立的逆转录病毒构建体共同转导到preB细胞中，由此使所述构建体稳定地整合到感染过的preB细胞的基因组上。如果使用丧失了表达内源免疫球蛋白的潜力的鼠preB细胞(参见上文的说明)，在逆转录病毒转导的preB细胞分化时，就只有异源或人类抗体或结合蛋白能够在B系细胞中表达。

    (a)用于IgH链的调控表达的逆转录病毒构建体的制备

    由于编码各种IgH和L链蛋白的逆转录病毒构建体最终会转导到鼠细胞中，控制Ig表达的启动子和增强子元件可以来自鼠类起源，以便确定与B系特异性鼠转录因子的最佳相互作用。

    制备所述逆转录病毒表达构建体的起始载体，是空的逆转录病毒克隆载体pLIB(Clontech)(图12a)。编码人免疫球蛋白重链的重组逆转录病毒表达载体的制备，是一个多步骤的克隆过程，它涉及将启动子和增强子元件，以及编码人类抗体的各种可变的和恒定的区依次克隆到空的逆转录病毒克隆载体pLIB中的步骤。在第一个步骤中，通过PCR方法将鼠VH启动子克隆到pLIB的多克隆位点的独特的ClaI限制位点上。这一目的是通过PCR方法扩增来自鼠基因组DNA的鼠VH启动子元件而实现的，使用了以下引物，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank数据库保藏号X71119设计的。

    SEQ ID NO.31(P027)

    5′-ccATCGATtgactggatgcttgttaattctaataag-3′，和

    SEQ ID NO.32(P028) 5′-

    ccATCGATGGATCCtgtgtgccagtaactgtagagagaac-3′

    所述引物能够通过PCR方法扩增394bp的VH启动子片段，该片段包括位于它们的5′和3′末端的ClaI的限制酶识别位点(ATCGAT)，因为它们整合在引物P027和P028的5′末端。除了这两种引物上的ClaI位点之外，反向引物P028包括将另一个独特的限制位点导入PCR产物的额外的BamHI限制位点(GGATCC，加下划线)(参见图12a)，该位点是其他克隆步骤所必须的。在对所述PCR片段进行ClaI限制酶消化之后，将包括新的BamHI位点的扩增的VH启动子PCR片段，连接到ClaI线性化的pLIB载体上。通过诊断性限制酶消化和DNA测序，鉴定含有沿需要方向的(与5′LTR启动子的转录方向相反)的VH启动子的连接产物，并且命名为pAB-1(图12a)。

    第二个步骤，是将鼠内含子重链增强子(EμH)与它的侧翼基质连接区(MARs)克隆到逆转录病毒载体pAB-1上。已知具有它的侧翼(MARs)的EμH增强子元件，是免疫球蛋白在B系细胞中有效表达所需要的。EμH增强子克隆是通过使用以下引物扩增来自鼠基因组DNA的983bp的PCR片段而实现的，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列J00440设计的：

    SEQ ID NO.33(P029) 5′-

    cgGGATCCAAGCTTagagaggtctggtggagcctgcaaaagtcc-3′和

    SEQ ID NO.34(P030) 5′-

    gatcGCGGCCGCtctagataattgcattcatttaaaaaaaaaatatttc-3′

    附加在每一个引物上的限制位点(对于P029来说是BamHI/HindIII，而对于P030来说是NotI)用大写字母突出表示。然后用BamHI和NotI限制酶消化所述PCR产物，并且定向连接到BamHI/NotIII线性化的逆转录病毒载体pAB1上，得到了载体pAB-2。所述有义引物P029包括编码其他HindIII位点的序列(加下划线)，它将能够在pAB-2上产生随后的克隆步骤所需要的独特的限制酶识别位点上。

    然后，将含有3′α增强子的DNA片段添加到构建体pAB-2上。已知3′α增强子是在浆细胞的分化阶段抗体的最佳的和高水平表达和分泌所必需的。已知所述3′α增强子包括四个DNAseI超敏性位点(HS1，HS2，HS3，和HS4)，所述位点包括对晚期B细胞/浆细胞特异性转录因子的各种结合位点。在报导基因分析中，证实了HS1和2位于0.6kb基因组DNA片段上，能产生3′α增强子活性的至少80％，而在DNA序列上高度同源的HS3和4的作用很小。

    所有四个3′α增强子成分，HS1，2，3和4，组成了所谓的基因座控制区(LCR)，它能够不依赖于侧翼DNA序列地调控特定基因座的转录活性。因此，免疫球蛋白重链的基础逆转录病毒表达载体，将至少包括3′α增强子的HS1，2区，该区可以使用根据公开的NCBI-Genbank序列进入X96607设计的引物由鼠基因组DNA通过PCR方法扩增(克隆所述PCR片段或随后的克隆步骤所需要的其他限制酶位点的识别序列用大写字母突出表示)：

    SEQ ID NO.35(P031) 5′-

    gcatGTCGACACGCGTgggggctcagatatcagtaccagaaacaagg-3′，和

    SEQ ID NO.36(P032) 5′-

    cgatGTCGACCTCGAGttggagtcacaggcctgtctccatgtgg-3′

    除了在每一个引物上的5′末端SalI位点(GTCGAC)之外，所述正向引物P031包括额外的MluI位点(加下划线)，而反向引物P028包括其他XhoI位点(加下划线)。引物P031和P032能够扩增可以用SalI限制酶消化的644bp的PCR片段，并且连接到SalI线性化的载体pAB-2上。通过诊断性限制酶消化和DNA测序，确定具有沿需要的方向的插入片段的克隆(参见图12b)，并且命名为pAB-3(图12b)。

    在IgH表达的逆转录病毒载体构建体上，可以选择性地包括其他3′α增强子成分HS3和4。对于包括所述3′α增强子HS4区的466bp片段来说，可以用小鼠基因组DNA作模板，使用以下引物通过PCR方法扩增，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目S74166设计的：

    SEQ ID NO.37(P033)

    5′-gcaCTCGAGgggtagatgcagcctgtgttccgtttactg-3′，和

    SEQ ID NO.38(P034) 5′-

    gctCTCGAGCATGCctgagcccaccaggaagtcctctgtg-3′

    附加在每一种引物的5′末端的限制酶位点用大写字母突出表示。除了存在于两种引物中的XhoI限制位点(CTCGAG)之外，反向引物P034包括额外的SphI限制位点(GCATGC，加下划线)，含有随后的克隆用途所必需的其他独特的限制位点。用引物对P033和P034在基因组小鼠DNA上进行的PCR扩增，得到了466bp的PCR片段，所述PCR片段可以用限制酶XhoI消化，并且随后将它连接到XhoI线性化的载体pAB-3上。通过诊断性限制酶消化和DNA测序，确定具有沿需要的方向的SH4插入片段的克隆，并且命名为载体构建体pAB-4(图12b)。最后的3′α增强子片段HS3，可以用鼠基因组DNA作模板，使用以下引物通过PCR方法扩增，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目X96607用设计的(限制酶SphI的识别序列同样用大写字母突出表示)：

    SEQ ID NO.39(P035) 5′-

    ttaaGCATGCaaccacatgcgatctaagggatattgggg-3′和

    SEQ ID NO.40(P036)

    5′-ttaaGCATGCgatcattgagctccggctctaacaactggg-3′

    用SphI限制酶消化PCR扩增的HS33′α增强子区，并且连接到SphI线性化的载体pAB-4上，以便制备pAB-5。可以将载体pAB-3，4，或5中的任意一种用于插入异源免疫球蛋白重链的编码区(图12b)。

    所述人免疫球蛋白同种型的每一种可以作为膜结合表面免疫球蛋白或作为分泌型抗体表达，所述表达是通过交替的剪接事件调控的，要么保持，要么从mRNA转录物上缺失跨膜外显子。尽管每一种免疫球蛋白同种型具有它自身的编码跨膜外显子的编码区，所有人IgG，IgA和IgE抗体的所述跨膜区，对于所述独特的亚型来说实际上是相同的。因此，可以将相同的IgG膜外显子用于膜锚定IgG1，IgG2，IgG3和IgG4抗体，将不同类型的外显子用于IgA1和IgA2，并且每一个不同的外显子，是每一种IgE和IgM抗体所必需的。

    因此，朝向制备重组逆转录病毒Ig表达构建体的克隆方法的下一个步骤，是将编码人IgG，IgA，IgM和IgE抗体的各种跨膜区插入载体pAB-3，4，或5中的任一个上。作为一种典型例子，披露了基础逆转录病毒构建体pAB-3的其他克隆方法，该构建体包括VH启动子，EμH增强子和最低3′αE增强子(HS1，2)因子(图12c)。

    μH链跨膜区是由位于CμH恒定区外显子CμH1-CμH4下游1.85kb的两个外显子μM1和μM2编码的。包括所述内源聚腺苷酸化位点的μM1和μM2外显子包括在773bp的基因组片段上，该片段可以用以下引物，通过PCR方法由小鼠基因组DNA扩增，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank重叠群序列NT010168设计的：

    SEQ ID NO.41(P037) 5′-

    catACGCGTcgctgcatcaggctttcaggggcccagccc-3′和

    SEQ ID NO.42(P038) 5′-

    catACGCGTccctcaccagaaagcagtttcatggataaaatg-3′

    附加在每一种引物5’末端的MluI限制位点，用大写字母突出表示。所得到的PCR产物可以用MluI限制位酶消化，并且将所得到的773bp的片段连接到MluI线性化的载体pAB-3上。将通过限制酶作图和DNA测序证实的含有正确方向的μM1和μM2外显子的克隆，命名为构建体pAB-3.1(图12c)。

    例如，IgG抗体的膜沉积，可以通过IgG1基因的跨膜外显子实现。IgG1跨膜区是由位于跨越1.9kb的片段的Cγ1H外显子的下游1.25kb的两个外显子编码的。为了缩短γ1M1和γ1M2之间的内含子，使用了单一重叠延伸(SOE)PCR方法，通过该方法，将以上两个外显子融合在较小的PCR片段上。一般来说，如果所述上游PCR产物的反向引物和下游PCR产物的有义引物具有大约30-40bp的互补性，可以实现两种PCR产物的融合。所述完全互补性的区域能够以15-20个核苷酸的形式附加在所述反向引物和正向引物的5′末端，分别用于扩增所述上游和下游PCR产物。不过，对于两个外显子γ1M1和γ1M2的融合来说，巧合的是，两个完全相同的28bp的序列存在于γ1M1的下游78bp处，和γ1M2外显子的上游256bp处。可以通过SOE-PCR，将所述序列用于制备较短的PCR片段，所述片段含有编码γH链的跨膜区的γ1M1和γ1M2外显子。因此，使用以下引物在人基因组DNA上同时进行了两种PCRs，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列AL122127设计的。使用以下引物如人基因组DNA，扩增了包括γ1跨膜外显子1(γ1 M1)的315碱基对的PCR片段：

    SEQ ID NO.43(P039) 5′-

    catACGCGTacagagggaatcacccccagaggcccaagccc-3′和

    SEQ ID NO.44(P040) 5′-gacagcgtcagggacaggtggggacagc-3′，

    使引物P039结合在NCBI-Genbank序列条目AL122127的9710-9741号位置上，而引物P040结合在9435-9462号位置上。

    可以用以下引物由人基因组DNA扩增包括所述跨膜外显子2(γ1M2)的A555碱基对的PCR片段：

    SEQ ID NO.45(P041) 5′-gctgtccccacctgtccctgacgctgtc-3′，和

    SEQ ID NO.46(P042)

    5′-catACGCGTttatttggaaggggggcgtgtcaggtgtgtcagggtc-3′

    使引物P041结合在NCBI-Genbank序列条目AL122127的8137-8164号位置上，而引物P042结合在7624-7654号位置上。通过将1/100的γ1M1外显子PCR产物与1/100的γ1M2外显子PCR产物混合，并且用有义引物P039和反向引物P042重复进行PCR，可以将所述两种PCR产物与822bp PCR融合产物融合。除了存在于引物P039和P042上的MluI限制酶识别位点之外(用大写字母突出表示)，这些位点是克隆SOE融合PCR产物所必须的，引物P042还包括人工聚腺苷酸化信号的互补序列(加下划线)，使得在最终地逆转录病毒免疫球蛋白表达载体上，所述免疫球蛋白转录物能够正确的转录终止。然后，用MluI限制酶消化832bp的γ1M1γ1M2-polyA信号PCR片段，并且连接到载体pAB-3上。将通过限制酶作图和DNA测序证实的具有正确取向的插入片段的克隆，命名为克隆pAB-3.2(图12c)。

    α1跨膜编码区的克隆，可以通过用人基因组DNA PCR扩增含有编码包括它的内源polyA位点的α1M的单一外显子的片段而实现。可以将以下引物用于该PCR扩增，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目M60193设计的：

    SEQ ID NO.47(P043)

    5′-atcACGCGTctcaggccttagatggggacccagaccc-3′和

    SEQ ID NO.48(P044)

    5′-attACGCGTgacccccgtctcctcattcagagtctgtg-3′

    两种引物都包括附加在每一种引物的5′末端的MluI克隆位点(用大写字母突出表示)，并且能够扩增可以用MluI限制酶消化的768碱基对的PCR产物，然后将该产物连接到MluI线性化的pAB-3上。将通过限制酶作图和DNA测序证实的具有正确取向的插入片段的克隆，命名为克隆pAB-3.3。

    为了表达膜结合IgE抗体，通过PCR方法克隆由两个外显子ε1M1和ε1M2编码的ε1H链的跨膜区。为此，用以下引物由人类基因组DNA扩增了858bp的PCR产物，所述引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目X63693设计的：

    SEQ ID NO.49(P045)

    5′-catACGCGtcgggacctgggtgcccaccctcagggctgg-3′和

    SEQ ID NO.50(P046)

    5′-aatACGCGTttatttgtgccctgggctgggtgccgggccctccttgg-3′

    这两种引物都含有附加在每一个引物末端的MluI克隆位点(用大写字母突出表示)，得到了858bp的PCR产物，可以用MluI限制酶消化该产物。另外，将反向引物P046设计成包括人工polyA信号的互补序列(加下划线)，确保在最终的表达构建体上mRNA转录的正确终止。将MluI消化过的PCR片段连接到MluI线性化的pAB-3上。通过限制酶作图和DNA测序证实具有正确取向的插入片段的克隆，并且命名为克隆pAB-3.4。

    在对IgG，IgA，IgM和IgE同种型的各种跨膜外显子进行克隆之后，必须将编码人类恒定区的外显子，插入逆转录病毒构建体pAB-3.1至3.4。为此，将编码所述恒定区外显子的DNA片段克隆到pAB-3.1至4构建体中每一个的独特的NotI限制酶识别位点上。

    在图12d中示出了编码所有免疫球蛋白H链同种型γ1，γ2，γ3和γ4的逆转录病毒表达载体的克隆。用人基因组DNA作PCR模板，可以将以下引物用于通过PCR扩增四种不同的IgG重链亚型：

    对于γ1来说(根据公开的NCBI-Genbank序列AL122127设计的引物)：

    SEQ ID NO.51(P047)

    5′-gcatGCGGCCGCcctgggcccagctctgtcccacacc-3′，和

    SEQ ID NO.52(P048)

    5′-gcatGCGGCCGCtgggtgctttatttccatgctgggtg-3′

    对于γ2来说(根据公开的NCBI-Genbank序列J00230设计的引物)：

    SEQ ID NO.53(P049)

    5′-tataGCGGCCGCagggagtgggctaaggtgaggcaggtgg-3′和

    SEQ ID NO.54(P050)

    5′-attaGCGGCCGCctcagactcggcctgacccacggaaagaac-3′

    对于γ3来说(根据公开的NCBI-Genbank序列AL122127设计的引物)：

    SEQ ID NO.55(P051)

    5′-gcatGCGGCCGCccagctctgtcccacaccgcagtcacatgg-3′和

    SEQ ID NO.56(P052)

    5′-gctaGCGGCCGCtcgcaggggcccagggcagcgctgggtgctt-3′

    对于γ4来说(根据公开的NCBI-Genbank序列K01316设计的引物)：

    SEQ ID NO.57(P053)

    5′-attaGCGGCCGCggatagacaagaaccgaggggcctctg-3′和

    SEQ ID NO.58(P054)

    5′-taatGCGGCCGCccagggcagtggtgggtgctttatttcc-3′

    在每一种情况下，可以用NotI限制酶消化编码γ1H的1788bp的PCR产物，编码γ2H的1959bp的PCR产物，编码γ3H的2374bp的PCR产物，和编码γ4H的1820bp的PCR产物，将消化过的片段连接到NotI线性化的pAB-3.2上(图12d)。将通过限制酶作图和DNA测序确定的含有正确取向的并且没有任何突变的插入片段的构建体，并且分别命名为pAB-3.2-G1，pAB-3.2-G2，pAB-3.2-G3，和pAB-3.2-G4。

    为了克隆编码μH，α1H，α2H，和εH链的恒定区外显子，采用了相同的方法(图12e)。将以下引物用于使用人基因组DNA作模板，通过PCR方法扩增不同的IgH同种型：

    对于μH来说(按照公开的NCBI-Genbank序列AB019441设计的引物)：

    SEQ ID NO.59(P055)

    5′-attaGCGGCCGCcaccccagtaggccagagcatcgtgcac-3′和

    SEQ ID NO.60(P056)

    5′-taatGCGGCCGCcacccctgatagccatgacagtctggg-3′

    对于α1H和α2H来说(按照公开的NCBI-Genbank序列J00220，和J00221设计的引物)：

    SEQ ID NO.61(P057)

    5′-attaGCGGCCGCtgtcaccaggcctctctgtgctgggttcc-3′和

    SEQ ID NO.62(P058)

    5′-tattGCGGCCGCcggatggaagcgtggggctgcttgggg-3′

    对于εH来说(按照公开的NCBI-Genbank序列L00022设计的引物)：

    SEQ ID NO.63(P059)

    5′-taatGCGGCCGCcacggggtccccagctcccccatccagg-3′和

    SEQ ID NO.64(P060)

    5′-atatGCGGCCGCtcccaagaatgggtgtactggggctc-3′

    在每一种情况下，可以用NotI限制酶消化编码μH的2229bp的PCR产物，编码α1H和α2H的1667bp的PCR产物，以及编码εH的1908bp的PCR产物，并且分别连接到用NotI线性化的pAB-3.1，pAB-3.3，和pAB-3.4上(图12e)。通过限制酶作图和DNA测序确定了包括含有沿正确方向的插入片段的构建体，并且分别被命名为pAB-3.1-M，pAB-3.3-A1，pAB-3.3-A2，和pAB-3.4-E。

    由天然IgH链启动子和增强子元件控制的不同的逆转录病毒H链表达构建体仍然需要插入可变区编码区，将在对克隆逆转录病毒IgL链载体的方法进行说明之后，对此加以说明，因为将要提供有关完整的逆转录病毒IgH和IgL链表达构建体的表达独特的或不同特异性的类似方法。

    (b)用于调控IgκL链表达的逆转录病毒构建体的制备

    与设计用于IgκL链表达的构建体类似，为了IgκL链的不同的分化阶段特异性表达而设计的逆转录病毒构建体需要存在特定的KL链特异性启动子和增强子元件。其中包括VK启动子，K轻链内含子增强子(KiE)，和K3′增强子(K3′E)因子。所述因子的顺序克隆可以按以下方式实现(图13a，b)。

    使用以下引物，由小鼠基因组DNA以290bp PCR片段形式PCR扩增Vκ启动子(引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目X52768设计的)：

    SEQ ID NO.65(P061)

    5-ccATCGATcctggtctacagtgtgaggtactggac-3′，和

    SEQ ID NO.66(P062)

    5′-ccATCGATGGATCCtctgagagctggaagagaggatgctttattagg-3′

    附加在每一种引物5’末端的限制位点用大写字母突出表示。除了存在于这两种引物5′末端的ClaI位点之外，反向引物P062包括额外的BamHIII限制位点(GGATCC，加下划线)，将另一个独特的限制位点导入所述PCR产物，该位点被用于随后的克隆目的。在对所述PCR片段进行ClaI限制酶消化之后，将扩增的Vκ启动子连接到ClaI线性化的pLIB载体上。通过诊断性限制酶作图和DNA测序鉴定含有沿需要方向的(与5′LTR启动子的转录方向相反)Vκ启动子的连接产物，并且得到构建体pAB-6(图13a)。

    κiE和κL链恒定结构域的编码区位于紧靠人和小鼠κL链基因座的地方，并且所述增强子似乎在不同物种中起作用。因此，披露了编码κL链的两种不同逆转录病毒表达载体的选择性的克隆方法，一种方法采用所述人的，而另一种方法采用所述鼠的K内含子增强子(κiE)。应当指出的是，这两种构建体可以交替使用。含有所述人KiE的构建体的克隆可以通过用以下引物，通过扩增含有人κiE和位于5′的MAR的CK外显子的基因组人DNA的PCR片段而实现的(引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目AF017732设计的)：

    SEQ ID NO.67(P063)

    5′-cgGGATCCTGACGCGTaccagggagaagactgatttattagagatttc-3′，和

    SEQ ID NO.68(P064)

    5′-gatGCGGCCGCaaagattcactttatttattcattctcc-3′

    附加在每一种引物的5’末端的其他限制位点，同样是用大写字母突出表示的(引物P063中的BamHIII和P064中的NotI)。引物P063包括编码用于随后的克隆步骤的额外MluI限制位点的序列。所述PCR引物扩增的2359bp的片段可以用BamHI和NotI消化，并且可将其直接克隆到用BamHI-NotI线性化的pAB-6上，制备逆转录病毒构建体pAB-7(图13a)。

    对于使用鼠κiE的构建体，通过前面所披露的SOE-PCR方法将含有鼠κiE的PCR产物融合到含有人Cκ区的PCR产物上。为此，首先同时进行鼠κiE和人CK区的PCR扩增，使κiE反向引物和CK区正向引物具有36bp的互补性区。在第二次PCR中，将其用于这两种PGR产物，将1/100的每一种PCR反应产物混合在一起，并且用κiE正向(P065)和CK区反向引物(P064)进行扩增，得到了这两种PCR产物在36bp的末端互补性区的融合。

    可以将以下引物用于用小鼠基因组DNA作模板扩增鼠κiE(引物是根据公开的NCBI-Genbank序列条目V00777设计的)：

    SEQ ID NO.69(P065)

    5′-cgGGATCCAAGCTTgaaaaatgtttaactcagctactataatccc-3′

    SEQ ID NO.70(P066)

    5′-gttttgttggagctcccctttgaagatattctcaggcttccttc-3′

    用基因组DNA作模板，可以将以下引物用于扩增人Cκ区(根据公开的NCBI Genbank序列条目AF017732设计的引物)：

    SEQ ID NO.71(P067)

    5′-aatatcttcaaaggggagctccaacaaaacaatttagaactttattaag-3′

    SEQ ID NO.68(P064)

    5′-gatGCGGCCGCaaagattcactttatttattcattctcc-3′

    在引物P066和P067的末端互补性区下面加下划线，所述互补性区能介导在用引物P065和P064以及用两种第一次PCR产物的混合物作模板进行的第二次PCR中介导两种PCR产物的融合。可以用BamHI和NotI消化所得到的1524bp的鼠κiE-人Cκ融合PCR产物，然后直接克隆到用BamHI-NotI线性化的载体pAB-6上，制备载体pAB-8(图13a)。

    然后将鼠κ3′E克隆到pAB-7和pAB-8上的人Cκ区的下游，分别制备构建体pAB-7.1和pAB-8.1。用于由小鼠基因组DNA克隆κ3′E的引物如下：(根据公开的NCBI-Genbank序列条目X15878设计)：

    SEQ ID NO.72(P068)

    5′-acgcGTCGACtagaacgtgtctgggccccatgaaacatc-3′，和

    SEQ ID NO.73(P069)

    5′-cgatGTCGACagctcaaaccagcttaggctacacagagaaac-3′

    两种引物都包括SalI限制位点(用大写字母突出表示)，以便所得到的827bp的PCR产物可以克隆到pAB-7和pAB-8的相容性SalI限制位点上。将通过限制酶作图和DNA测序，确定的具有沿正确方向的插入片段和具有正确DNA序列的载体克隆，并且命名为pAB-7.1和pAB-8.1(图13a)。在下一个克隆步骤中，将受组成型SV40启动子控制的嘌呤霉素抗性标记，克隆到逆转录病毒κL链表达构建体上。优选包括编码嘌呤霉素抗性的表达盒，因为IgH和IgL链逆转录病毒构建体需要稳定地共转导到鼠pre前B细胞内，以便能够表达完整的异源抗体。为了提高逆转录病毒共转导的效率，首先转导逆转录病毒IgL链构建体，并且通过嘌呤霉素选择稳定转导的细胞的IgL链构建体的整合。IgH链逆转录病毒载体的二次转导将会得到具有在用IgH链逆转录病毒载体转导过的每一种细胞中产生抗体的潜力的细胞。

    可以从所述嘌呤霉素抗性载体pPur(Clontech)上克隆嘌呤霉素表达盒，通过SOE-PCR删除某些不想要的内部限制位点，并且在扩增的PCR片段末端添加合适的ClaI克隆位点。

    用于SOE融合PCR的引物是：

    SEQ ID NO.74(P070)

    5′-ccATCGATctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgg-3′

    SEQ ID NO.75(P071)

    5′-tcaggggatggtggcggccctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttc-3′

    SEQ ID NO.76(P072)

    5′-cttttttggaggcctagggccgccaccatcccctgacccacgcccctgacc-3′

    SEQ ID NO.77(P073)

    5′-ccATCGATccagacatgataagatacattgatgag-3′

    首先，用引物对P070/P071和P072/P073同时进行两次PCR扩增，将相同的pPur模板用于所述PCRs。设计反向引物P071和正向引物P072，以便包括36bp的完全互补的区(加下划线)，所述互补区使得通过第二次PCR产生的两种PCR产物融合，在另一次PCR过程中使用等分的前面的PCR片段，单独使用引物P070和P073。包括ClaI限制位点(大写字母)的后一种引物使得可以将所得到的1351bp嘌呤霉素表达盒克隆到pAB-7.1和pAB-8.1的相容性ClaI位点上。由此分别产生了逆转录病毒构建体pAB-7.1 Pur和pAB-8.1 Pur(图13b)，可以将分别编码κL链的独特的和多样性的可变区的单一的VJκ或VJκ区文库插入所述构建体中。下面将提供用于克隆所述可变区外显子的方法，同时提供H链和λL链可变区的克隆，随后还披露了异源人λL链的逆转录病毒表达载体的克隆。

    (c)用于IgλL链的调控表达的逆转录病毒构建体的制备

    在某些场合下，需要生产含有λL链而不是KL链的异源抗体。不过，可能足以用任何人Cλ编码区取代所述逆转录病毒构建体pAB-7.1Pur和pAB-8.1Pur上的人Cκ编码区，完整的内源λL链表达形式只能通过控制λL链的表达，通过λL链基因座特异性启动子和增强子元件实现。这种情况特别适合所述鼠系统，其中，在B细胞分化期间，κL链基因重排和表达在λL链的重排和表达之前进行。

    鼠λL链基因座特异性增强子元件是λ2-4增强子和λ3-1增强子，它们位于紧靠Cλ2，Cλ4，和Cλ1，Cλ3恒定区外显子的地方，并且分别调控λ2，λ4，和λ3轻链同种型的表达。

    对于κL链逆转录病毒表达构建体来说(参见上文)，将逆转录病毒λL链表达载体设计成包括嘌呤霉素抗性基因表达盒。因此，在第一个克隆步骤中，通过SOE-PCR将SV40启动子控制的嘌呤霉素表达盒融合在Vλ启动子上，将小鼠基因组DNA和pAB-7.1Put作为模板分别用于PCR扩增。用于两次同时进行的SOE-PCR反应的引物如下(Vλ启动子特异性引物P076和P077是根据公开的NCBI-Genbank数据库序列条目J00591设计的)：

    SEQ ID NO.78(P074)

    5′-ccATCGATctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgg-3′

    SEQ ID NO.79(P075)

    5′-gatgtcacgtgagatcccagacatgataagatacattgatgagtttg-3′

    SEQ ID NO.80(P076)

    5′-tcttatcatgtctgggatctcacgtgacatcttataataaacctg-3′

    SEQ ID NO.81(P077)

    5′-ccATCGATACGCGTaattcacaaaccaagtctattattttcaata-3′

    对于前面所披露的SOE融合PCRs来说，首先，平行进行两次PCR扩增，在pAB-7.1 Pur上的嘌呤霉素表达盒用引物P074和P075作模板，而小鼠基因组DNA上的Vλ启动子用引物P076和P077作模板。然后，混合每一个1/100体积的第一次平行PCRs的等分样品，并且再次用引物P074和P077扩增。因此，将所述嘌呤霉素表达盒融合在Vλ启动子的5′末端，因为在反向引物P075和有义引物P076上设计的完全互补的36bp的区(加下划线)被用于第一轮平行的PCRs。

    引物P074和P077都包括ClaI限制位点，可将该位点用于将所述PCR融合产物克隆到ClaI线性化的pLIB上。将另一个MluI限制位点(加下划线)同样整合到反向引物P077上，得到的Vλ启动子的3’末端的另一个独特的MluI位点，该位点是其他克隆步骤所必须的。通过限制酶作图和DNA测序，证实了具有沿正确方向插入pLIB上的嘌呤霉素-Vλ启动子融合PCR片段并且具有正确的DNA序列的载体克隆，命名为载体pAB-9(图14a)。然后，通过PCR扩增从小鼠基因组DNA制备两种鼠λ2-4E和λ3-1E增强子元件，再次通过SOE-PCR融合这两种序列。可以使用以下引物(分别根据公开的NCBI-Genbank序列条目X54550和X54608设计的)：

    SEQ ID NO.82(P078)

    5′-catGCGGCCGCgagtatccctgtgcagtggggatactcag-3′

    SEQ ID NO.83(P079)

    5′-tctcaggagagaCTCGAGactcctttgtgctctgatagcacacatgac-3′

    SEQ ID NO.84(P080)

    5′-gcacaaaggagtCTCGAGtctctcctgagatggttcataggcctgcc-3′

    SEQ ID NO.85(P081)

    5′-ggGAATTCtctagacataaggaacaaagtcagtgtgcc-3′

    与前面的方法类似，首先用引物对P078/P079和P080/P081，用小鼠基因组DNA作模板扩增两种PCR片段，而在第二轮PCR反应中，将所述PCR产物的等分样品用作模板，并且通过用引物P078和P081进行的PCR扩增融合，因为P079和P080具有36bp的互补性(加下划线)。

    所得到的1513bp的PCR融合产物，可以用NotI和EcoRI限制酶消化(将相应的识别位点整合到引物P078和P081上；用大写字母突出表示)，并且定向克隆到NotI/EcoRI线性化的pAB-9上。将通过限制酶和DNA测序证实的具有正确DNA序列的克隆，命名为载体pAB-10(图14a)。将引物P079和P080上的互补性区设计成包括额外的独特的XhoI位点(用大写字母突出表示)，以便在必要的时候可以分别除去每一个增强子元件。

    在下一个步骤中，用以下引物将人Cλ区克隆到逆转录病毒构建体pAB-10上(引物是根据公开的NCBI-Genbank序列D87023和D87017设计的)：

    SEQ ID NO.86(P082)

    5′-ccACGCGTaaaagcttgtctaggtggagcccactccttgcc-3′

    SEQ ID NO.87(P083)

    5′-catGCGGCCGccctgtaccccacactgagaaccccgggg-3′

    如果用人基因组DNA作模板，所述引物能够以1094bp的PCR片段形式扩增任何功能性人Cλ区。引物P082和P083分别包括ClaI和NotI的限制位点，使得可以对所述PCR片段进行ClaI-NotI双重消化，并且将它们定向连接到pAB-10上，以便制备(根据扩增的Cλ区)pAB-11-λ1，pAB-11-λ2，pAB-11-λ3，或pAB-λ7(图14b)。

    为了制备完整的IgλL链逆转录病毒表达载体，必须将VλJλ重排的可变区外显子克隆到各种pAB-11构建体的独特的MluI和HandIII位点上，将在以下部分结合完整的IgH和IgκL链逆转录病毒表达载体的制备对此进行说明。

    实施例7：将VHDJH或VLJL可变区外显子克隆到逆转录病毒IgH和L链表达构建体上

    迄今为止，所披露的不同的人IgH和IgL链的逆转录病毒表达构建体，都包括人抗体表达的所有编码区和控制元件，只有所述可变区的编码区例外。例如，编码可变区结构域的外显子的不同的所有组成成分(文库)，可以从人外周血淋巴细胞的基因组DNA克隆，所述淋巴细胞包括具有不同VHDJH或VLJLDNA重排的B淋巴细胞。所述可变区的编码区必须包括位于每一个VHDJH或VLJL重排外显子5’末端的不同的前导外显子(图15)，它是IgH和IgL链通过内质网进行正确转运所必须的，首先跨过高尔基网络，并最终达到细胞表面。业已披露了结合在大部分人IgH，1gKL和IgλL可变区前导序列的前导序列上的简并引物，并且被用于与简并引物组合，以便扩增各种人JH和JL基因片段，以便克隆VHDJH或VLJL。可变编码区。将用于所述PCR产物的定向克隆的限制酶识别位点(参见图15)附加在所述简并引物的5′末端，并且用大写字母突出表示。可能包括一个以上核苷酸的简并引物上的位点用括弧标出。

    用于由人外周B淋巴细胞的基因组DNA通过PCR方法扩增包括前导序列的人Ig重链可变区的正向引物如下：

    SEQ ID NO.88(P084)5′-gcGGATCCacggaccggacctggagg(ag)tc(ct)tct(gt)c-3′

    SEQ ID NO.89(P085)5′-gcGGATCCatggag(ct)ttgggctga(cg)ctgg(cg)ttc(ct)t-3′

    SEQ ID NO.90(P086)

    5′-gcGGATCCatgga(ac)(ac)(at)act(gc)tg(gt)(at)(cgt)c(at)(ct)(cg)ct(ct)ctg-3′

    用于由人外周B淋巴细胞的基因组DNA扩增包括前导序列的人Ig轻链可变区的正向引物如下：

    SEQ ID NO 91(P087)

    5′-gcGGATCCacggacatg(ag)(ag)(ag)(agt)(ct)cc(act)(acg)g(ct)(gt)ca(cg)ctt-3′

    用于由人外周B淋巴细胞的基因组DNA扩增包括前导序列的人Ig入轻链可变区的正向引物如下：

    SEQ ID NO 92(P088)

    5′-gcACGCOTatg(ag)cctg(cg)(at)c(ct)cctctc(ct)(ct)ct(cg)(at)(ct)-3′

    应当指出的是，与附加在引物P084-P087 5’末端的用于克隆目的BamHI限制酶识别位点不同，可以使用BglII限制酶的识别位点(与图15进行比较)，因为BglII能产生与BamHI相同的相容性突出末端。在克隆VλJλ区时，所述定向引物P088包括MluI位点，因为所述逆转录病毒构建体能接纳业已包含内在BamHI限制位点的片段。另外，可以使用类似于P088的引物，它包括AscI位点，能产生与MluI限制酶相同的CGCG突出末端。

    用于扩增所有六种人IgHJ链基因片段的反向引物如下：用大写字母突出表示的HindIII位点附加在所述引物的5′末端，包括用于克隆目的的某些侧翼核苷酸。

    使用人B淋巴细胞的基因组DNA通过PCR方法扩增包括JH1，JH4和JH5基因片段的反向引物如下：

    SEQ ID NO 93(P089)

    5′-tatAAGCTTacctgaggagacggtgaccagggtgccctgg-3′A

    用于由人B淋巴细胞的基因组DNA扩增包括JH2，JH3，和JH6基因片段的可变区外显子的简并反向引物如下：

    SEQ ID NO 94(P090)

    5′-tatAAGCTTacctgaggagacggtgacca(tg)(tg)gt(gc)cc(ta)(tc)

    (gt)g-3′

    用于由人B淋巴细胞的基因组DNA扩增包括人JK1-4基因片段的可变K区外显子的反向简并引物如下：

    SEQ ID NO 95(P091)

    5′-tatAAGCTTacgtttgatctcca(cg)(ct)ttggtccct(tgc)ggcc-3′

    用于由人B淋巴细胞的基因组DNA扩增包括所述人JK5基因片段的可变K区外显子的反向引物如下：

    SEQ ID NO 96(P092)

    5′-tatAAGCTTacgtttaatctccagtcgtgtcccttggcc-3′

    用于由人B淋巴细胞的基因组DNA通过PCR方法扩增包括Jλ1-3基因片段的可变区IgλL外显子的反向简并引物如下：

    SEQ ID NO 97(P093)

    5′-tatAAGCTTacctaggacggtcagcttggtccc(ta)(cg)c(tg)cc-3′

    用于由人B淋巴细胞的基因组DNA通过PCR方法扩增包括Jλ7的可变区IgλL外显子的反向引物如下：

    SEQ ID NO 98(P094)

    5′-tatAAGCTTaccgagggcggtcagctgggtgcctcctcc-3′

    为了用上述引物P084-P094通过PCR方法扩增并且克隆包括重排的VHDJH和VLJL基因片段的可变区外显子，使用了等摩尔数量的引物，如果将一种以上正向或反向引物指明用于特定的可变区。对于H和KL链的可变区的克隆来说，用BamHI和HindIII消化所述PCR片段，并且定向克隆到BamHI/HindIII双重消化过载体上，用于IgH和IgκL链的表达。对于λL链的可变区的克隆来说，用MluI和HindIII消化所述PCR片段，并且克隆到MluI/HindIII双重消化过的载体上，用于IgλL链表达。

    实施例8：将编码异源IgH和L链的逆转录病毒表达载体依次转导到遗传修饰过的鼠preB细胞中

    在实施例3中业已详细披露了基质细胞和IL7依赖性鼠preB细胞的逆转录病毒转导。对于编码IgH和IgL链的逆转录病毒表达构建体的依次转导来说，将相同的方法用于转导亲嗜性包装细胞，并且使用将重组逆转录病毒转染到preB细胞中的条件。唯一的不同是，通过下面披露的方法，依次转导两种逆转录病毒表达构建体。

    首先，用业已用编码异源IgL链的逆转录病毒构建体瞬时转染过的GPE包装细胞系的上清液感染基质细胞和IL7依赖性preB细胞。如上文所述，所述IgL链表达载体还包括嘌呤霉素抗性标记。因此，可以在转导之后24小时，通过向组织培养基中添加2μg/ml的嘌呤霉素选择稳定转导过的细胞。在含有嘌呤霉素的培养基中，培养转导过的细胞，并且再扩增48小时之间。由于嘌呤霉素的选择作用，未转导过的preB细胞将被消除，并且在培养48小时之后，将获得preB细胞的100％的IgL链转导过的群体。

    在该时间点上，用来自业已用编码异源IgH链的逆转录病毒载体，瞬时转染过的亲嗜性包装细胞系GPE的上清液培养细胞。然后将所述细胞在培养物中再保持24小时时间。此时，由于所述异源免疫球蛋白重链的表达，使它们停止了增殖。然后收获所述细胞，并且可用于移植受到免疫折中的小鼠。在这里，所述细胞可以重建所述B系区室，并且在这里，它们能够参与免疫应答，产生异源抗体分泌型细胞。

    实施例9：将长期增殖的鼠前体B细胞移植到小鼠体内，用于生产异源抗体

    通过静脉内注射途径，将能表达来自稳定转导的逆转录病毒表达载体的异源IgH和L链的基质细胞和IL7依赖性preB细胞，注射到B细胞缺陷型BST小鼠体内，或与CD4+T-辅助细胞一起注射到CB17SCID，RAG-2或RAG-2缺陷型小鼠体内，以便在对所述移植过的小鼠进行抗原刺激时，移植过的小鼠可以产生T细胞依赖性或非依赖性免疫应答。

    为此，用300-600radγ-的辐射量对1.5-3个月大的小鼠进行亚致死性辐射，并且在辐射之后4-6小时，通过静脉内途径给所述小鼠注射悬浮在PBS中的5×106-107preB细胞。为了额外移植CD4+T-辐射细胞，从同系小鼠的合并的颈部、腋部、肠系膜和腹股沟淋巴结中分离CD4+细胞，包括通过使用绵羊抗小鼠Ig抗体包衣的Dynabeads(MilanAnalytic AG，La Roche，Switzerland)消除B细胞和CD8+T细胞。将106所述纯度通常超过90％的CD4+T-辅助细胞与preB细胞同时注射。在移植之后，让细胞群重建所述移植过的宿主的B和T细胞区室。

    实施例10：preB细胞移植小鼠的免疫

    用HupreB细胞和T辅助细胞移植和重建的免疫折中小鼠的免疫，基本上是按公开的方法进行的(Harlow和Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press，p.150-173，1988)。简单地讲，将10-50μg的抗原溶解在250μl PBS中，并且与250μl全弗氏佐剂剧烈混合，并且，通过腹膜内途径注射所述抗原-佐剂混合物。2周之后，用5-20μg抗原进行腹膜内注射加强，在这次注射时与不完全弗氏佐剂混合。在第一次加强10天之后，分析小鼠血清中的抗原特异性异源抗体。在4周之后，用溶解在不完全弗氏佐剂中的5-20μg抗原，通过腹膜内和静脉内途径，对最佳响应小鼠进行再次强化免疫。3天之后，从小鼠体内分离脾细胞，并且用于制备能分泌异源抗原-特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。

    实施例11：体外刺激HupreB细胞，以便分化成抗体分泌型浆细胞

    在体外组织培养物时，基质细胞和IL7依赖性HupreB细胞也能完全分化成抗体分泌型细胞。为此，首先将连续增殖的HupreB细胞培养物分化成表面免疫球蛋白阳性B细胞，包括从组织培养基中取消IL7，并且在辐射过的基质细胞上继续培养2-3天。在培养基中缺少生长因子，导致了增殖的抑制，和分化的诱导，同时伴随着细胞程序死亡的诱导，除了诸如bcl-2的抗细胞程序死亡基因在分化中的细胞表达之外。

    然后，收获所述分化的细胞，并且在存在100U/ml rIL4和20μg/ml激动性抗-CD40单克隆抗体的条件下，重新铺板到新的辐射过的基质细胞上。在培养5-6天期间，所述细胞分化成具有浆细胞表型的大细胞，所述细胞能够从所述异源Ig基因座上分泌大量的抗体，并且可将其用于制备能分泌异源单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。

    实施例12：融合骨髓瘤细胞和源于HupreB细胞的浆细胞，以便制备能产生人单克隆抗体的杂交瘤

    为了在体外分化(实施例11)或在移植过的小鼠免疫之后(实施例10)使源于HupreB细胞的浆细胞永生化，需要将所述浆细胞与永生化的骨髓瘤细胞系融合。将所述骨髓瘤细胞系用于缺少HGPRT基因表达的细胞融合，涉及到核苷酸生物合成的挽救途径。尽管所述细胞在正规组织培养培养基中能无限地生长，如果通过向所述组织培养基中添加诸如氨基喋呤的药物，抑制核苷酸的从头合成，它们将会死亡。相反，表达HGPRT基因的细胞，可以在通过氨基喋呤抑制核苷酸的从头合成时存活，特别是如果补充额外的胸苷和次黄嘌呤更是如此，因为HGPRT基因产物可以利用所述物质分别合成嘧啶和嘌呤核苷酸。因此，在HAT选择培养基中(含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷)，只有这些细胞存活和增殖，它是由于致命的，但是HGPRT+的抗体分泌型浆细胞和非致命的，但是HGPRT-的融合所导致的，并因此是氨基喋呤敏感型骨髓瘤细胞。所述细胞被称为杂交瘤细胞，并且，如果亚克隆，能够分泌具有由所述浆细胞融合配偶体编码的特异性的单克隆抗体。

    为了制备杂交瘤细胞，使用了来自用HupreB细胞移植的免疫小鼠的脾脏的浆细胞，或通过抗-CD40和IL4刺激在体外制备的浆细胞。在每一种情况下，制备了均匀的细胞悬浮液，并且用没有任何添加剂的IMDM培养基洗涤2次，通过重复的离心(500g，5分钟)和重新悬浮步骤进行洗涤。

    合并5×108骨髓瘤细胞(Sp2/0 Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6，p.511-519，1976；或X63Ag8.653 Kearney等，J.Immmunol.，123，p.1548-1550，1979)，和5×107脾细胞(或5×107体外分化的浆细胞)，混合，并且以500g的速度再次离心5分钟。将1ml50％聚乙二醇(PEG)1500在IMDM培养基中的稀释液，缓慢添加到所述细胞沉淀中，同时通过轻轻敲击，重新悬浮所述细胞。在培养2分钟之后，缓慢添加10ml没有添加剂的DMEM培养基，并且以500g的速度将细胞最终离心5分钟。在除去上清液之后，将所述细胞沉淀物重新悬浮在1ml IMDM型基质细胞生长培养基中(如实施例1所述)，所述培养基含有100U/ml重组IL6和1×浓缩的HAT添加剂。将所述细胞分配在50个96孔组织培养平板上，并且在37℃下培养，直到可以识别独立的杂交瘤克隆，并且分离，用于扩增和在组织培养物中表征。

                                        序列表

    <110>Melchers and Grawunder，Georg Friedrich and Ulf

    <120>用于制备遗传修饰过的脊椎动物前体淋巴细胞的方法，

         以及将其用于生产异源结合蛋白的用途

    <130>异源结合蛋白

    <140>

    <141>

    <160>98

    <170>PatentIn Ver.2.1

    <210>1

    <211>4953

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：pPGK-hygro；

         扩增潮霉素B的模板

    <400>1

    aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat  60

    tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga  120

    tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca  180

    acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct  240

    aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc  300

    cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag  360

    cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca  420

    cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc aggctacgca  480

    actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaggggg  540

    gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta  600

    aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc  660

    ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttc tgatggaatt agaacttggc aaaacaatac  720

    tgagaatgaa gtgtatgtgg aacagaggct gctgatctcg ttcttcaggc tatgaaactg  780

    acacatttgg aaaccacagt acttagaacc acaaagtggg aatcaagaga aaaacaatga  840

    tcccacgaga atttatagat ctatagatca tgagtgggag gaatgagctg gcccttaatt  900

    tggttttgct tgtttaaatt atgatatcca actatgaaac attatcataa agcaatagta  960

    aagagccttc agtaaagagc aggcatttat ctaatcccac cccaccccca cccccgtagc  1020

    tccatccttc cttcaaaatg taggtactct gttctcaccc ttcttaacaa agtatgacag  1080

    gaaaaacttc cattttagtg gacatcttta ttgtttaata gatcatcaat ttctgcatac  1140

    tctattcctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt  1200

    ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag  1260

    tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga  1320

    aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc  1380

    ggagccgcgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct  1440

    ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc  1500

    cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat  1560

    tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa  1620

    gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt  1680

    gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt  1740

    gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga tcggccgcag  1800

    cgatcgcatc catggcctcc gcgaccggct gcagaacagc gggcagttcg gtttcaggca  1860

    ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca ataggtcagg ctctcgctga  1920

    attccccaat gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc cgatgcaaag tgccgataaa  1980

    cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac ccgcaggaca tatccacgcc  2040

    ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc cgagagctgc atcaggtcgg  2100

    agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga cgtcgcggtg agttcaggct  2160

    ttttcatggt ggcgggatgc aggtcgaaag gcccggagat gaggaagagg agaacagcgc  2220

    ggcagacgtg cgcttttgaa gcgtgcagaa tgccgggcct ccggaggacc ttcgggcgcc  2280

    cgccccgccc ctgagcccgc ccctgagccc gcccccggac ccaccccttc ccagcctctg  2340

    agcccagaaa gcgaaggagc aaagctgcta ttggccgttg ccccaaaggc ctacccgctt  2400

    ccattgctca gcggtgctgt ccatctgcac gagactagtg agacgtgcta cttccatttg  2460

    tcacgtcctg ctcgacgcga gctgcggggc gggggggaaa cttcctgact aggggaggag  2520

    tagaaggtgg cgcgaagggg ccaccaaaga acggagccgg ttggcgccta ccggtggatg  2580

    tggaatgtgt gcgaggccag aggccacttg tgtagcgcca agtgcccagc ggggctgcta  2640

    aagcgcatgc tccagactgc cttgggaaaa gcgcctcccc tacccggtag aattcctgca  2700

    gcccggggga tccactagtt ctagagcggc cgccaccgcg gtggagctcc agcttttgtt  2760

    ccctttagtg agggttaatt ccgagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt  2820

    gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acataggagc cggaagcata aagtgtaaag  2880

    cctggggtgc ctaatgagtg aggtaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt  2940

    tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag  3000

    gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg  3060

    ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat  3120

    caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta  3180

    aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctcggccc ccctgacgag catcacaaaa  3240

    atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgttcc  3300

    cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt  3360

    ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca  3420

    gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg  3480

    accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat  3540

    cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta  3600

    cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct  3660

    gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac  3720

    aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa  3780

    aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa  3840

    actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt  3900

    taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca  3960

    gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca  4020

    tagttgcctg actgcccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc  4080

    ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa  4140

    accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc  4200

    agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca  4260

    acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat  4320

    tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgaaaaaaag  4380

    cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac  4440

    tcatgcttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt  4500

    ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt  4560

    gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc  4620

    tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat  4680

    ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca  4740

    gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga  4800

    cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg  4860

    gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg  4920

    ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctg                               4953

    <210>2

    <211>5130

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：pBS-DT4；

         扩增野生型白喉毒素A的模板

    <400>2

    aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat  60

    tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga  120

    tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca  180

    acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct  240

    aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc  300

    cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag  360

    cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca  420

    cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc aggctacgca  480

    actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaggggg  540

    gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta  600

    aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc  660

    ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt cctgcagccc gggggatcca  720

    ctagttctag agcttgcaga tctgcattcc accactgctc ccattcatca gttccatagg  780

    ttggaatcta aaatacacaa acaattagaa tcagtagttt aacacattat acacttaaaa  840

    attttatatt taccttagag ctttaaatct ctgtaggtag tttgtccaat tatgtcacac  900

    cacagaagta aggttccttc acaaagagat cgcctgacac gatttcctgc acaggcttga  960

    gccatatact catacatcgc atcttggcca cgttttccac gggtttcaaa attaatctca  1020

    agttctacgc ttaacgcttt cgcctgttcc cagttattaa tatattcaac gctagaactc  1080

    ccctcagcga agggaaggct gagcactaca cgcgaagcac catcaccgaa ccttttgata  1140

    aactcttccg ttccgacttg ctccatcaac ggttcagtga gacttaaacc taactctttc  1200

    ttaatagttt cggcattatc cacttttagt gcgagaacct tcgtcagtcc tggatacgtc  1260

    actttgacca cgcctccagc ttttccagag agcgggtttt cattatctac agagtatccc  1320

    gcagcgtcgt atttattgtc ggtactataa aaccctttcc aatcatcgtc ataatttcct  1380

    tgtgtaccag attttggctt ttgtatacct ttttgaatgg aatctacata accaggttta  1440

    gtcccgtggt acgaagaaaa gttttccatc acaaaagatt tagaagaatc aacaacatca  1500

    tcaggatcca tggcgaacta tcaagacaca aaagaaggct atagtcacct cggggccgcc  1560

    aagagcagcc gctgccgccc tgcccacttc cggcaagccg cgggctcgag ccgccagggg  1620

    gcgcgcgccc aagctcaggg gacaaaggaa gcgcagaccg gccgcattat taccataaaa  1680

    ggcaaacgct ggcccggagg cggacctagg gcaggaagcc agacctccgc cccctcccca  1740

    aacgggcgca agctccgcct acactgcgcc gacgggcggc ttgtgcgcgc gcgggaggcg  1800

    accacaccca gcaggaagcg caaacaaggc gcccgtgcca ctgtgacccc gccccttccg  1860

    gacaacggcc ccgccctcgc ccaaccccgg gcagccgcgc tcccagcctc aatacgcacg  1920

    cgcagctaac taggaagagg gggagagaag agctccctcc ctagcgcaca cgcgcctcga  1980

    tgcccagtga tagagagcgc acgcgcagtg gcatcccagc ccccacccgg ccgagccggc  2040

    cctgccgcgc ccgcccgccc gcccgcccgc ccggcaagcc gaataggcaa accggtttgg  2100

    acaaagaccc agaggccatt gaggcgtgat cgtagcgtct ggttcccaat actgtgtact  2160

    ctcaagatgg acctaatacg gcttttaaca cccgcaagcc gcaccggctc atcaaatgcc  2220

    cacaccgcga ccctagtgtg tccccaagcc ccacgcaccg agcgggagcg ggcccacgag  2280

    tgtctacacc gcgggaatgt ggctgcaaag agtctacacg ctaggcgtaa agttggctgt  2340

    gccagtgtcc gctccgcggc ccggcaccac cctccacccg cccatggtgt ccgttctgag  2400

    tgatcctcag gaccctgcag tgaggtacta gccacgagag agcgaaggcc cgctgggccc  2460

    ggcgtccctg cttacctggt ggcgggtgtg gaccggcaac gaaggagctg caaagaagct  2520

    gtgctcgcgg gtggacgcga ctcgacagtg gctgcgcgtt gcgccgccgg gttttatagg  2580

    acgccacagc ggccactcga gccataaaag gcaactttcg gaacggcggg cgctgattgg  2640

    ctccgcgtcg ctcactcacc ggcctcgccg cacagtgcag cattttttta ccccctctcc  2700

    cctccttttg aaaaaaaaaa aaaaaaagaa gaagaaaaaa aaaaaaagcg agagagaaag  2760 

    cgagattgag gaagaggatg aagagttttg gcgatgggtg ctggctccgt aggcccagat  2820

    gtacaggaat agcctccgcc cttgtggaca ctgccccatt caatgtctcg gttactaggg  2880

    ggtaccgagc tcgaattcta gagcggccgc caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc  2940

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    attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt  4140

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    ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg  4440

    ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca  4500

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    ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca  4620

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    cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca  4800

    tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca  4860

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    <210>3

    <211>5130

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：pBS-DT4tox176；

         扩增减毒的白喉毒素A的模板

    <400>3

    aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat  60

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    ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt cctgcagccc gggggatcca  720

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    cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt  3600

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    gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc  3720

    cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag  3780

    agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg  3840

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    ttgcctgact gcccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca  4260

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    ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg  4440

    ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca  4500

    gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtga aaaaaagcgg  4560

    ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca  4620

    tgcttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg  4680

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    <210>4

    <211>4514    

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：pGL2neo(+)；

         扩增loxP位点侧翼的新霉素的模板

    <400>4

    cgacgtcgca tgctcccggc cgccatggcc gcgggatatc actagtgcgg ccgcctgcag  60

    gtcgaccata tgggagagct cgaattcgag ctcggtaccc tcgacctgca gccaagctag  120

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    gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc  2400

    cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag  2460

    agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg  2520

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    cttgcccggc gtcaatacgg gataatagtg tatgacatag cagaacttta aaagtgctca  3480

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    gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg  3600

    tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac  3660

    ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt  3720

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    ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc  4020

    cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg  4080

    gcccactacg tgaaccatca cccaaatcaa gttttttgcg gtcgaggtgc cgtaaagctc  4140

    taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg  4200

    tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag  4260

    cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt  4320

    ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct  4380

    attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg  4440

    gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata  4500

    gggcgaattg ggcc                                                    4514

    <210>5

    <211>41

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物001

    <400>5

    cgtctagacc atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct g                       41

    <210>6

    <211>41

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物002

    <400>6

    catgcggccg ctattccttt gccctcggac gagtgctggg g                      41

    <210>7

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物003

    <400>7

    attgctagca tggcgcaagc cgggagaaca gggtatgata ac                     42

    <210>8

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物004

    <400>8

    cgcacgcgtc acttgtggcc caggtatgca cccagagtg                           39

    <210>9

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物005

    <400>9

    atatgtcgac tcaatattgg ccattagcca tattattcat tg                       42

    <210>10

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物006

    <400>10

    ccggatcgat ccttatcgga ttttaccac                                       29

    <210>11

    <211>55

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物007

    <400>11

    tcgaccggta cctaggcgcg ccatcgatat cgctagctcg agctcagatc tgtac          55

    <210>12

    <211>47

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物008

    <400>12

    agatctgagc tcgagctagc gatatcgatg gcgcgcctag gtaccgg                  47

    <210>13

    <211>78

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物009

    <400>13

    ctagataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac gcgtataact tcgtatagca   60

    tacattatac gaagttat                                                 78

    <210>14

    <211>78

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物010

    <400>14

    ctagataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatac gcgtataact tcgtataatg   60

    tatgctatac gaagttat                                                 78

    <210>15

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物011

    <400>15

    tcgacgcgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaag                           38

    <210>16

    <211>37

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物012

    <400>16

    tcgacgcgtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtg                              37

    <210>17

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物013

    <400>17

    tcgacgcgtg aattctaccg ggtaggggag gcgcttttc                           39

    <210>18

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物014

    <400>18

    tcgacgcgtg gaattagaac ttggcaaaac aatactgag                           39

    <210>19

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物015

    <400>19

    aatgcggccg cgaacctcct gtgttgcaag cacaaatggg                          40

    <210>20

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物016

    <400>20

    aatgcggccg aggcagcacg gttgagtttc agttgtcatc                           40

    <210>21

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物017

    <400>21

    ttggcgcgcc gtaagaatgg cctctccagg tctttatttt                          40

    <210>22

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物018

    <400>22

    ttggcgcgcc agctcagctc agctcacccc agctcagctc                          40

    <210>23

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物019

    <400>23

    tatgcggccg cttatctttc tcctttatta acggttgctg                         40

    <210>24

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物020

    <400>24

    tatgcggccg cacagtggta gtactccact gtctggctg                           39

    <210>25

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物021

    <400>25

    ttggcgcgcc tgtgtaagac acaggttttc atgttaggag                          40

    <210>26

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物022

    <400>26

    ttggcgcgcc tgcttcgcca agtttactgg gtaggttg                            38

    <210>27

    <211>41

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物023

    <400>27

    tatagcggcc gcttctgctc ctcttcttta gtactggatt c                        41

    <210>28

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物024

    <400>28

    tatagcggcc gcgttggcta agctacctgg gaacaatggg gg                       42

    <210>29

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物025

    <400>29

    ttggcgcgcc ataggatctc cacatagaag ttggtatttg cc                      42

    <210>30

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物026

    <400>30

    ttggcgcgcc gtgggcacac atatgtcatc ccagttaccc                         40

    <210>31

    <211>36

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物027

    <400>31

    ccatcgattg actggatgct tgttaattct aataag                             36

    <210>32

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物028

    <400>32

    ccatcgatgg atcctgtgtg ccagtaactg tagagagaac                          40

    <210>33

    <211>44

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物029

    <400>33

    cgggatccaa gcttagagag gtctggtgga gcctgcaaaa gtcc                     44

    <210>34

    <211>49

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物030

    <400>34

    gatcgcggcc gctctagata attgcattca tttaaaaaaa aaatatttc                49

    <210>35

    <211>47

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物031

    <400>35

    gcatgtcgac acgcgtgggg gctcagatat cagtaccaga aacaagg                 47

    <210>36

    <211>44

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物032

    <400>36

    cgatgtcgac ctcgagttgg agtcacaggc ctgtctccat gtgg                     44

    <210>37

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物033

    <400>37

    gcactcgagg ggtagatgca gcctgtgttc cgtttactg                           39

    <210>38

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物034

    <400>38

    gctctcgagc atgcctgagc ccaccaggaa gtcctctgtg                         40

    <210>39

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物035

    <400>39

    ttaagcatgc aaccacatgc gatctaaggg atattgggg                          39

    <210>40

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物036

    <400>40

    ttaagcatgc gatcattgag ctccggctct aacaactggg                           40

    <210>41

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物037

    <400>41

    catacgcgtc gctgcatcag gctttcaggg gcccagccc                            39

    <210>42

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物038

    <400>42

    catacgcgtc cctcaccaga aagcagtttc atggataaaa tg                       42

    <210>43

    <211>41

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物039

    <400>43

    catacgcgta cagagggaat cacccccaga ggcccaagcc c                        41

    <210>44

    <211>28

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物040

    <400>44

    gacagcgtca gggacaggtg gggacagc                                       28

    <210>45

    <211>28

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物041

    <400>45

    gctgtcccca cctgtccctg acgctgtc                                       28

    <210>46

    <211>46

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物042

    <400>46

    catacgcgtt tatttggaag gggggcgtgt caggtgtgtc agggtc                   46

    <210>47

    <211>37

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物043

    <400>47

    atcacgcgtc tcaggcctta gatggggacc cagaccc                             37

    <210>48

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物044

    <400>48

    attacgcgtg acccccgtct cctcattcag agtctgtg                             38

    <210>49

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物045

    <400>49

    catacgcgtc gggacctggg tgcccaccct cagggctgg                           39

    <210>50

    <211>47

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物046

    <400>50

    aatacgcgtt tatttgtgcc ctgggctggg tgccgggccc tccttgg                  47

    <210>51

    <211>37

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物047

    <400>51

    gcatgcggcc gccctgggcc cagctctgtc ccacacc                             37

    <210>52

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物048

    <400>52

    gcatgcggcc gctgggtgct ttatttccat gctgggtg                             38

    <210>53

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物049

    <400>53

    tatagcggcc gcagggagtg ggctaaggtg aggcaggtgg                          40

    <210>54

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物050

    <400>54

    attagcggcc gcctcagact cggcctgacc cacggaaaga ac                       42

    <210>55

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物051

    <400>55

    gcatgcggcc gcccagctct gtcccacacc gcagtcacat gg                       42

    <210>56

    <211>43

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物052

    <400>56

    gctagcggcc gctcgcaggg gcccagggca gcgctgggtg ctt                      43

    <210>57

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物053

    <400>57

    attagcggcc gcggatagac aagaaccgag gggcctctg                           39

    <210>58

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物054

    <400>58

    taatgcggcc gcccagggca gtggtgggtg ctttatttcc                          40

    <210>59

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物055

    <400>59

    attagcggcc gccaccccag taggccagag catcgtgcac                          40

    <210>60

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物056

    <400>60

    taatgcggcc gccacccctg atagccatga cagtctggg                          39

    <210>61

    <211>41

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物057

    <400>61

    attagcggcc gctgtcacca ggcctctctg tgctgggttc c                        41

    <210>62

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物058

    <400>62

    tattgcggcc gccggatgga agcgtggggc tgcttgggg                           39

    <210>63

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：Primer059

    <400>63

    taatgcggcc gccacggggt ccccagctcc cccatccagg                          40

    <210>64

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物060

    <400>64

    atatgcggcc gctcccaaga atgggtgtac tggggctc                            38

    <210>65

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物061

    <400>65

    ccatcgatcc tggtctacag tgtgaggtac tggac                               35

    <210>66

    <211>47

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物062

    <400>66

    ccatcgatgg atcctctgag agctggaaga gaggatgctt tattagg                  47

    <210>67

    <211>48

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物063

    <400>67

    cgggatcctg acgcgtacca gggagaagac tgatttatta gagatttc                 48

    <210>68

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物064

    <400>68

    gatgcggccg caaagattca ctttatttat tcattctcc                           39

    <210>69

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物065

    <400>69

    cgggatccaa gcttgaaaaa tgtttaactc agctactata atccc                    45

    <210>70

    <211>44

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物066

    <400>70

    gttttgttgg agctcccctt tgaagatatt ctcaggcttc cttc                     44

    <210>71

    <211>49

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物067

    <400>71

    aatatcttca aaggggagct ccaacaaaac aatttagaac tttattaag                49

    <210>72

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物068

    <400>72

    acgcgtcgac tagaacgtgt ctgggcccca tgaaacatc                           39

    <210>73

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物069

    <400>73

    cgatgtcgac agctcaaacc agcttaggct acacagagaa ac                       42

    <210>74

    <211>37

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物070

    <400>74

    ccatcgatct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtgg                             37

    <210>75

    <211>51

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物071

    <400>75

    tcaggggatg gtggcggccc taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt c             51

    <210>76

    <211>51

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物072

    <400>76

    cttttttgga ggcctagggc cgccaccatc ccctgaccca cgcccctgac c             51

    <210>77

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物073

    <400>77

    ccatcgatcc agacatgata agatacattg atgag                               35

    <210>78

    <211>37

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物074

    <400>78

    ccatcgatct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtgg                             37

    <210>79

    <211>47

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物075

    <400>79

    gatgtcacgt gagatcccag acatgataag atacattgat gagtttg                  47

    <210>80

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物076

    <400>80

    tcttatcatg tctgggatct cacgtgacat cttataataa acctg                    45

    <210>81

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物077

    <400>81

    ccatcgatac gcgtaattca caaaccaagt ctattatttt caata                    45

    <210>82

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物078

    <400>82

    catgcggccg cgagtatccc tgtgcagtgg ggatactcag                          40

    <210>83

    <211>48

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物079

    <400>83

    tctcaggaga gactcgagac tcctttgtgc tctgatagca cacatgac                 48

    <210>84

    <211>47

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物080

    <400>84

    gcacaaagga gtctcgagtc tctcctgaga tggttcatag gcctgcc                  47

    <210>85

    <211>38

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物081

    <400>85

    gggaattctc tagacataag gaacaaagtc agtgtgcc                            38

    <210>86

    <211>41

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物082

    <400>86

    ccacgcgtaa aagcttgtct aggtggagcc cactccttgc c                        41

    <210>87

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物083

    <400>87

    catgcggccg ccctgtaccc cacactgaga accccgggg                           39

    <210>88

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物084

    <400>88

    gcggatccat ggactggacc tggaggrtcy tctk c                              35

    <210>89

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物085

    <400>89

    gcggatccat ggagyttggg ctgasctggs ttcyt                               35

    <210>90

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物086

    <400>90

    gcggatccat ggammwactk tgkwbcwysc tyctg                               35

    <210>91

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物087

    <400>91

    gcggatccat ggacatgrrr dycchvgykc asctt                               35

    <210>92

    <211>34

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物088

    <400>92

    gcacgcgtat grcctgswcy cctctcytyc tyws                                34

    <210>93

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物089

    <400>93

    tataagctta cctgaggaga cggtgaccag ggtgccctgg                          40

    <210>94

    <211>40

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物090

    <400>94

    tataagctta cctgaggaga cggtgaccak kgtsccwykg                          40

    <210>95

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物091

    <400>95

    tataagctta cgtttgatct ccasyttggt ccctbggcc                           39

    <210>96

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物092

    <400>96

    tataagctta cgtttaatct ccagtcgtgt cccttggcc                           39

    <210>97

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物093

    <400>97

    tataagctta cctaggacgg tcagcttggt cccwsckcc                           39

    <210>98

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列说明：引物094

    <400>98

    tataagctta ccgagggcgg tcagctgggt gcctcctcc                           39