文心兰优质种苗快速繁殖方法 【技术领域】
本发明涉及文心兰的优质种苗快速繁殖方法和所使用的培养基。
背景技术
文心兰(Oncidinm)又名舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，是兰科植物中最大的属之一，本属植物全世界原生种有400种以上，而商业上用的千姿百态的商品种多为杂交种。文心兰原生于美洲热带地区，种类分布最多的有巴西、美国、哥伦比亚、厄瓜多尔及秘鲁等国家。其分布地区较广，有热带、暖带、高山的温带和寒带等。文心兰是一种极美丽而又极具观赏价值的兰花，是世界上重要的兰花盆花和切花品种之一，做切花时适合于家庭居室和办公室瓶插，也是加工花束、小花篮的高档用花材料，现世界各地均有栽培。它的形态变化较大，假鳞茎为扁卵圆形，较肥大，但有些种类没有假鳞茎。叶片1~3枚，可分为薄叶种、厚叶种和剑叶种。薄叶种叶片较薄，稍革质，多数植株生长健壮，适合中温温室种植；厚叶种耐干旱能力强，在温室内栽培冬天几十天不浇水也不至于因干旱而死亡；剑叶种株型较小，适于家庭栽培。一般一个假鳞茎上只有1个花茎，也有可能一些生长粗壮的种有2个花茎。有些种类一个花茎只有1~2朵花，有些种类又可达数百朵，如作为切花用的小花种一枝花几十朵，数枝上百朵到数百朵，其花朵色彩鲜艳，形似飞翔的金蝶，又似翩翩起舞的舞女，故又名金蝶兰或舞女兰。文心兰的花色以黄色和棕色为主，还有绿色、白色、红色或洋红色等，其大小有的极小如迷你型文心兰，有些又极大，花的直径可达12厘米以上。花的构造极为特殊，其花萼萼片大小相等，花瓣与背萼也几乎相等或稍大；花地唇瓣通常三裂，或大或小，呈提琴状，在中裂片基部有一脊状凸起物，脊上又有凸起的小斑点，颇为奇特，故名瘤瓣兰。文心兰由于花色艳丽、花朵数量多，花形变化大，有些品种还具有清香，既可做盆花栽培，也可做切花观赏，是世界上栽培最广泛、最普及的兰花种类之一。我国大陆近年来引进了不少文心兰品种，但种苗生产主要靠分株，繁殖速度慢，母本的病害也易感染给种苗。
国内外对文心兰的组织培养已进行了较多的研究，但未有利用花梗和茎尖进行原球茎和丛生芽增殖途径进行大规模生产和专利申请的报道。
【发明内容】
本发明提供了多种文心兰原种和杂种的组织培养繁殖方法和所使用的培养基。对外植体的选择，培养条件和培养基成分进行了系统阐述，应用价值高。本发明采用的文心兰种质优良，实验中利用文心兰的花梗和茎尖为外植体，采用独特的培养基进行丛生芽增殖并获得优质种苗的方法，技术简单实惠，切实可行，本发明所述的文心兰优质种苗快速繁殖方法，包括如下步骤：
1、材料：此发明已实验的材料有同色文心兰(Oncidium concolor)、香水文心兰(Oncidium Sweet Fragrance)、蜜糖文心兰(Oncidium Sweet Sugar)、野猫文心兰(Oncidium Wildcat)、金西文心兰(Oncidium Kinsei)、达卡文心兰(Oncidium Taka)、金宝文心兰(Oncidium Golden Gem)等，材料均取自华南植物园。
2、外植体的消毒：取文心兰花芽的花梗和茎尖，用自来水冲洗干净后，剪取2-3厘米带节的花梗切段或新长出的2-3厘米的幼芽，在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟，再用0.1％升汞溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次后，用无菌吸水纸吸干，花梗切段两端各剪去0.5厘米，幼芽基部切去0.3厘米接种到原球茎和丛生芽诱导培养基上。
3、花梗丛生芽的诱导：花梗苗的诱导培养基为N6+6-苄基嘌呤2-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水培养基上，在培养温度(26±2)℃条件下，15天左右花芽开始生长，已发育完成的花蕾会继续在试管内开花，腋芽中未发育完全的花芽能转化成营养芽，形成带叶的花梗苗。培养基含蔗糖30克/升，pH 5.5-5.8，琼脂0.7％。光照度1500～2000lx，光照12小时/天，培养条件下同。
4、茎尖丛生芽的诱导：采用茎尖为外植体时，诱导培养基为N6+6-苄基嘌呤1-3毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水，在培养温度(26±2)℃条件下，10天左右芽启动生长，40天左右能长成3-4厘米高。
5.、丛生芽增殖：将利用花梗和茎尖培养得到的小苗，剪去部分叶片转移到丛生芽增殖培养基：N6+6-苄基嘌呤1-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水+蔗糖30克/升，能诱导原球茎和丛生芽形成。原球茎能在较高的6-苄基嘌呤浓度培养基上增殖，原球茎转入较低6-苄基嘌呤浓度的培养基时会分化出丛生芽，丛生芽在较低6-苄基嘌呤浓度的培养基上能增殖。
6、生根壮苗培养：丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种在1/2N6培养基+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+活性碳0.5克/升的生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。
7、试管苗移栽：春季与秋季为移栽的适宜季节。试管苗移栽时，在自然光照下炼苗7-14天，将文心兰小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟后凉干，以小塑料盆为栽培容器，以浸泡过的小树皮和蛭石为栽培基质，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％-100％。
本发明所述的文心兰优质种苗快速繁殖方法，生产出的文心兰种苗具有遗传稳定性高，出苗快，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等优势。本发明所提供的文心兰优质种苗快速繁殖方法能成功地进行优良品种的文心兰优质种苗的组织培养和快速繁殖，由于采用无性繁殖，特别是能获得优良品种的无病毒苗。具有投入少，产出高等优势，是利用植物组织细胞的全能性和植物组织培养等生物技术进行植物优质种苗的规模化生产，实施该方法只需有简单的植物组织培养设备即可进行。已生产出优质的文心兰种苗，市场十分看好。
【具体实施方式】
实施例1
1、取材：同色文心兰(Oncidium concolor)
2、外植体的消毒：取同色文心兰花芽的花梗和茎尖，用自来水冲洗干净后，剪取2厘米带节的花梗切段或新长出的2厘米的幼芽，在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟，再用0.1％升汞溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次后，用无菌吸水纸吸干，花梗切段两端各剪去0.5厘米，幼芽基部切去0.3厘米接种到原球茎和丛生芽诱导培养基上。
3、花梗丛生芽的诱导：花梗苗的诱导培养基为N6+6-苄基嘌呤3-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水培养基上，在培养温度(26±2)℃条件下，15天左右花芽开始生长，已发育完成的花蕾会继续在试管内开花，腋芽中未发育完全的花芽能转化成营养芽，形成带叶的花梗苗。培养基含蔗糖30克/升，pH 5.5-5.8，琼脂0.7％。光照度1500～2000lx，光照12小时/天，培养条件下同。
4、茎尖丛生芽的诱导：采用茎尖为外植体时，诱导培养基为N6+6-苄基嘌呤2-3毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水，在培养温度(26±2)℃条件下，10天左右芽启动生长，40天左右能长成3-4厘米高。
5.、丛生芽增殖：将利用花梗和茎尖培养得到的小苗，剪去部分叶片转移到丛生芽增殖培养基：N6+6-苄基嘌呤1-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水+蔗糖30克/升，能诱导原球茎和丛生芽形成。当6-苄基嘌呤浓度为1-2毫克/升时只有丛生芽，无原球茎，当6-苄基嘌呤浓度为3-4毫克/升时既有丛生芽，又有原球茎，当6-苄基嘌呤浓度为5毫克/升以上时，生成的原球茎多，诱导出的丛生芽数量少。原球茎能在较高的6-苄基嘌呤浓度培养基上增殖，原球茎转入较低6-苄基嘌呤浓度的培养基时会分化出丛生芽，丛生芽在较低6-苄基嘌呤浓度的培养基上能增殖。
6、生根壮苗培养：丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种在1/2N6培养基+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+活性碳0.5克/升的生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。
7、试管苗移栽：春季与秋季为移栽的适宜季节。试管苗移栽时，在自然光照下炼苗7-14天，将文心兰小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟后凉干，以小塑料盆为栽培容器，以浸泡过的小树皮和蛭石为栽培基质，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％。
实施例2
取文心兰杂交品种蜜糖文心兰(Oncidium Sweet Sugar)为外植体。基本操作方法同实施例1一致。但培养基成分略有不同，其丛生芽诱导和增殖的培养6-苄基嘌呤的浓度比同色文心兰低。高浓度的6-苄基嘌呤会产生过多的原球茎。
在培养过程中，花梗苗的诱导培养基为N6+6-苄基嘌呤1-3毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水；采用茎尖为外植体时，诱导培养基为N6+6-苄基嘌呤1-2毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水。丛生芽增殖培养基为N6+6-苄基嘌呤1-3毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水+蔗糖30克/升。生根培养基为1/2N6培养基+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+活性碳0.5克/升，试管苗移栽的成活率可达100％。