水生藻类叶绿素测定方法 【技术领域】
本发明涉及一种水生藻类叶绿素测定方法，特别涉及用分光光度法测定水生藻类叶绿素的方法，适合于测定水中藻类叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c。
背景技术
水体富营养化、藻类大量繁殖导致水质恶化。为了评价水体富营养化程度，应对藻类含量进行测定。藻类是绿色浮游生物，体内含有叶绿素，用于进行光合作用。藻类叶绿素包括叶绿素a、叶绿素b和叶绿素c。所有藻类体内均包含有叶绿素a，其含量约占有机体干重的1～2％，部分藻类还含有叶绿素b、c。叶绿素a占叶绿素的绝大部分，是整个光合作用过程中的能量传递中心。因此，用叶绿素、尤其是叶绿素a能比较准确地反映藻类生物量，可用于衡量水体富营养化的程度。测定藻类叶绿素的方法有三类，即分光光度法、荧光法、高效液相色谱法。分光光度法所需仪器设备简易，操作简便，是目前普遍采用的方法。美国水质监测标准方法提供了用分光光度法测定水中藻类叶绿素含量的美国标准。我国一些水质监测部门也借用此方法进行测定，但该方法所用试剂挥发强烈，并具有毒性，污染工作环境，危害测试人员身体健康，且该方法所需过滤膜依赖进口，测试时间长，测试成本高。我国目前还没有测定水中藻类叶绿素含量的国家标准方法，国内推荐使用的方法存在着测定结果偏差大、测定结果不稳定、重现性差、污染工作环境等缺点。
【发明内容】
本发明提供一种水生藻类叶绿素测定方法，该方法运用分光光度法测定水生藻类叶绿素，该方法选用了无毒性的试剂和价格便宜的过滤膜，所需仪器设备简易，操作简便，测试时间短，测定结果准确、稳定、重现性好，测试费用低，安全无污染。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
本发明采用醋酸纤维微孔滤膜过滤水中藻类，用90％乙醇浸泡研磨截留了藻类的醋酸纤维膜，将藻类细胞中的叶绿素萃取到乙醇中，将萃取液离心获得澄清液，以90％乙醇作参比，用分光光度计测定萃取液在630、647、664、750nm处的吸光度值，采用计算公式计算水中叶绿素a、b、c含量。
本发明计算公式如下：
Chla＝[12.12(D664-D750)-1.58(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)
(1)
Chlb＝[-5.55(D664-D750)+21.51(D647-D750)-2.72(D630-D750)]VE/(Vsδ)
(2)
Chlc＝[-1.71(D664-D750)-7.77(D647-D750)+25.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)
(3)
式中Chla、Chlb、Chlc——分别为水样中叶绿素a、b、c的浓度，ug/L；
D630、D647、D664、D750——分别为萃取液在波长630、647、664、750nm处的吸光度值；
VE-离心管中萃取液的定容体积，ml；
Vs-水样体积，L；
δ-比色皿光程，cm。
所述采用醋酸纤维微孔滤膜过滤水中藻类是在真空条件下。
所述醋酸纤维微孔滤膜过滤前在虑膜上滴至少一滴1％的MgCO3悬浊液。
所述醋酸纤维微孔滤膜采用0.8μm孔径。
本发明与现有技术比较如下：
目前与本发明类似的方法有美国国家标准方法(简称美国方法)和国家环保局编著的《水和废水监测分析方法》一书中提供的国内普遍采用的方法(简称国内方法)，现将本发明与这两种方法做比较。
1、与美国方法比较：
在操作方法方面区别在于：(1)提取液不同。美国方法提取液为90％丙酮。(2)过滤膜不同。美国方法采用玻璃纤维膜。(3)需要地测试时间不同。美国方法的萃取液需要在低温(0～4℃)条件下放置2～24小时，使得藻类细胞中的叶绿素被提取液充分提取，然后再离心测定。本发明的提取液提取能力强，在短时间内能充分提取叶绿素，不需要延时提取，可直接离心测定。(4)计算公式不同。由于90％丙酮和90％乙醇的比吸光系数不同，因而计算公式不同。美国方法的计算公式为：
Chla＝[11.85(D664-D750)-1.54(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ) (4)
Chlb＝[-5.43(D664-D750)+21.03(D647-D750)-2.66(D630-D750)]VE/(Vsδ) (5)
Chlc＝[-1.67(D664-D750)-7.6(D647-D750)+24.52(D630-D750)]VE/(Vsδ) (6)
2、与国内方法比较：
区别在于：(1)提取液不同，国内方法提取液为90％丙酮。(2)操作程序不同，国内方法的滤膜过滤后放在冰箱内低温干燥6～8小时，再取出加提取液研磨。(3)需要的测试时间不同，国内方法需要增加6～8小时的低温干燥时间。(4)测定波长不同。国内方法测定波长为630、645、663、750nm。(5)计算公式不同，国内方法的计算公式为：
Chla＝[11.64(D663-D750)-2.16(D645-D750)+0.1(D630-D750)]VE/(Vsδ) (7)
Chlb＝[-3.94(D663-D750)+20.97(D645-D750)-3.66(D630-D750)]VE/(Vsδ) (8)
Chlc＝[-5.53(D663-D750)-14.18(D645-D750)+54.22(D630-D750)]VE/(Vsδ) (9)
3、在测定效果方面的比较：
(1)本发明测定结果稳定，重现性好。对同一份水样分别用三种方法进行10次重复测定，测定结果见表1。从表1可以看出，本发明测定结果的标准偏差与美国方法相当，比国内方法小得多，重现性有了大幅度提高。
表1各测定方法重现性比较重复试样编号 Chla(ug/L) 总叶绿素(ug/L) 本发明美国方法 国内方法 本发明美国方法国内方法 1 59.1 56.7 52.1 67.5 60.5 63.4 2 58.3 57.9 55.5 66.7 62.1 68.1 3 58.2 58.6 55.5 65.7 62.9 68.1 4 60.6 57.8 51.0 67.4 61.7 62.8 5 61.4 57.1 54.5 69.6 61.5 70.0 6 61.9 54.5 50.3 69.6 59.2 61.1 7 60.7 59.1 47.4 68.9 63.5 58.3 8 59.8 60.4 58.4 67.3 65.2 71.1 9 61.4 57.7 57.6 70.4 62.5 69.7 10 57.5 57.8 54.1 64.3 61.4 66.7 平均 59.9 57.8 53.6 67.8 62.1 65.9 标准差 1.47 1.47 3.25 1.8 1.6 4.1相对标准差(％) 2.4 2.5 6.1 2.7 2.6 6.2
注：总叶绿素为Chla、Chlb、Chlc的和。
(2)本发明测定结果准确。选择了一系列不同叶绿素浓度的水样，分别用三种方法进行测定，测定结果列于表2。从表2可看出，本发明与美国标准方法的测定结果基本一致，12个试样的叶绿素a的平均相对误差仅为0.55％，总叶绿素的平均相对误差也只有2.5％。而国内方法与美国标准方法的测定结果相差较大，6个试样的叶绿素a的平均相对误差为-19.7％，总叶绿素的平均相对误差为-3.45％。本发明的测定结果的准确程度与国内方法相比有了较大程度的提高。
表2 各测定方法测定结果比较试样编号 Chla(ug/L) 总叶绿素(ug/L)Chla相对于美国方法的相对误差(％)总叶绿素相对于美国方法的相对误差(％)本发明美国方 法国内方 法本发明美国方 法国内方 法本发明国内方 法本发明国内方 法 1 32.8 35.1 23.6 36.3 36.8 32.6 -6.6 -32.8 -1.4 -11.4 2 45.6 44.9 34.9 49.4 46.6 43.2 1.6 -22.3 6 -7.3 3 59.8 57.7 53.8 66 61.6 66.5 3.6 -6.8 7.1 8 4 64.8 60.8 49.2 69.3 63.2 67.1 6.6 -19.1 9.7 6.2 5 85.6 89.6 69.8 93.7 94.7 85.8 -4.5 -22.1 -1.1 -9.4 6 125.3 127.3 108.1 136.1 135.3 126.1 -1.6 -15.1 0.6 -6.8 7 27.1 26 31.3 29.6 4.2 5.7 8 28.7 30.1 34 34.3 -4.7 -0.8 9 31.7 32.4 37.5 36.4 -2.2 3 10 53.7 53 59 61.7 1.3 -1.8 11 84.2 84.2 90.8 87.6 0 3.7 12 127.4 133.1 143.5 145.1 -4.3 -1.1 平均 0.55 -19.7 2.5 -3.45
综合上述比较分析，可得出本发明的有益效果是：(1)测定结果准确稳定，重现性好。本发明的测定结果及其重现性均达到了美国标准方法的水平，比国内推荐使用的方法有了大幅度提高。(2)安全无污染。本发明采用90％乙醇做提取液，避免了其它两种方法中丙酮提取液对人体的伤害。(3)测试迅速，耗时短。本发明测定一个样品所需的时间为0.5小时，而美国方法至少需要2.5小时，国内方法至少需要6.5小时。(4)所需设备少，测试费用低。由于本发明不需要低温冷藏，因此可省去其它两方法中所需的冷藏设备。本发明采用了醋酸纤维膜，测试费用仅为美国方法的1/5。
【具体实施方式】
本发明包括如下步骤：
(1)藻类浓缩。用0.8um孔径的醋酸纤维微孔滤膜、全玻真空抽虑装置和真空泵过滤含有藻类的水样，将藻类截留在微孔滤膜上，过滤前在虑膜上滴加若干滴1％MgCO3悬浊液。
(2)色素提取。用90％的乙醇提取液浸泡研磨截留了藻类的滤膜，将叶绿素提取到提到乙醇中，再将提取液倒入离心管中，定容到数毫升。
(3)离心分离。将盛有叶绿素提取液的离心管装入离心机中离心，使得被研碎的滤膜纸屑沉淀到离心管底，获得澄清的萃取液。
(4)测定。将澄清的萃取液倒入比色皿中，用90％乙醇作参比，在分光光度计上测定萃取液在630、647、664和750nm波长处的吸光度值。
(5)计算。根据测得的各波长处的吸光度、水样体积、萃取液体积，计算水样中叶绿素a、b、c的浓度。计算公式为：
Chla＝[12.12(D664-D750)-1.58(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)
(1)
Chlb＝[-5.55(D664-D750)+21.51(D647-D750)-2.72(D630-D750)]VE/(Vsδ)
(2)
Chlc＝[-1.71(D664-D750)-7.77(D647-D750)+25.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)
(3)
式中Chla、Chlb、Chlc——分别为水样中叶绿素a、b、c的浓度，ug/L；
D630、D647、D664、D750——分别为萃取液在波长630、647、664、750nm处的吸光度值；
VE——离心管中萃取液的定容体积，ml；
Vs——水样体积，L；
δ——比色皿光程，cm。
实施例：
1、设备和试剂
(1)真空泵，真空度不大于0.05MPa；
(2)全玻真空抽滤装置；
(3)磁质或玛瑙研钵；
(4)医用离心机，转速3500～4000r/min，负载能力500～675g；
(5)离心管，15mL，带分刻度和螺帽；
(6)分光光度计，最小刻度0.5～2nm；
(7)比色皿，光程1～3cm；
(8)醋酸纤维膜，直径50mm，孔径0.8～1.0μm；
(9)90％乙醇水溶液(体积比)；
(10)1％MgCO3悬浊液：在100ml蒸馏水中加入1.0g MgCO3粉末；
2、测定程序
(1)样品准备。在水面下一定深度取水样500mL，若藻类含量高，水量可酌减。因藻类在不同水深处含量差别较大，取样时应准确记录取样点水深。取样后应尽快进行下一步测定程序，若水样需要保存，可在避光和低温(0～4℃)条件下保存24h。
(2)藻类过滤。将醋酸纤维膜装入全玻真空抽滤装置，滤膜的光亮面朝上。连接好真空泵，在过滤膜上均匀滴加数滴MgCO3悬浊液，用量筒量取500ml水样(藻类含量高时可酌减)，倒入抽滤装置中。待水样全部通过滤膜后再抽滤1分钟，以滤干滤膜上的水分。停止抽滤，取下滤膜，将滤膜向截留了藻类的一侧折叠，将其放在折叠的滤纸内，以吸干滤膜上的水分。
(3)叶绿素提取。用剪刀将滤膜剪碎，放入研钵中，加入2～3mL90％乙醇，研磨2～3分钟，帮助提取液萃取藻细胞中的叶绿素，将萃取了叶绿素的萃取液倒入离心管中。再向研钵中加入2～3mL90％乙醇，研磨1～2分钟，直到滤膜变白，说明叶绿素已全部溶解到萃取液中，将萃取液连同滤膜一起倒入离心管中。用90％乙醇涮洗研钵1～2遍，并入离心管。用90％乙醇将离心管中萃取液定容到8～10mL。
(4)离心。用螺帽盖好离心管，放入离心机中，在500g离心机中离心20～25分钟，或在675g离心机中离心15～20分钟。
(5)测定。小心取出离心管，将上清液倒入比色皿中，以90％乙醇作参比，在630、647、664、750nm波长处测定吸光度。750nm处的吸光度反映的是萃取液的混浊程度，该值不应超过0.005，若超过该值，应重新离心后测定。
(6)计算。根据萃取液在各波长处的吸光度值、比色皿光程、水样体积、萃取液定容体积，利用式(1)、(2)、(3)计算水中叶绿素a、b、c的含量。