一种以磷脂类成分为成膜材料的超声造影剂组合物及其制备方法 技术领域：
本发明涉及一种超声造影剂组合物，具体涉及一种以磷脂类成分为成膜材料的包裹氟碳类惰性气体的超声造影剂组合物及其制备方法。
技术背景：
新型超声造影剂结合超声新技术能有效增强心肌、肝、肾、脑等实质性器官的二维超声影像和血流多普勒信号，反映正常组织和病变组织(肿瘤、缺血心肌)不同的血流灌注，明显提高超声诊断的敏感性和特异性。除此之外携带基因、药物的超声造影剂在治疗方面也有广泛的应用前景。理想的新型超声造影剂具备以下特点：高散射性、低弥散性、低溶解性、无生物学活性(对人体无害人可自由通过毛细血管，微泡大小均匀，组织显影好，有效增强组织显影足够满足检查时间。
新一代超声造影剂多以含氟气体为微泡的核心，因含氟碳气体为惰性气体，分子量大，在血液中的溶解度和弥散性差，稳定性好。按包裹氟碳气体的材料不同而有白蛋白类、表面活性剂类、磷脂类、高分子聚合物类。就其在超声造影的增强显像上比较，以磷脂类成分为成膜材料造影剂有更多的优势，原因在于：(1)靶向性。磷脂类造影剂进入人体后，易优先被富含网状内皮细胞的组织如肝、脾及骨髓所摄取。(2)稳定性好。磷脂类造影剂化学性质稳定，常温下可保存数月不变化，易于商品化；(3)安全。构成磷脂类造影剂的磷脂膜可生物降解，对人体无害；而白蛋白类造影剂由于以人血白蛋白为载体，尚存有传播血液性疾病的危险。
发明内容：
本发明的目的是提供一种改进地以磷脂类成分为成膜材料的造影剂组合物；本发明还提供一种优化的造影剂的制备方法；通过实现本发明的目的能够提高微气泡的产率，延长造影剂在组织显影的有效增强时间。
为实现上述目的之一，本发明采用了以下的技术方案：
本发明提供的以磷脂类成分为成膜材料的造影剂组合物是这样一种组合物，它使用磷脂类物质为主要成分制成一种成膜材料，将该成膜材料和氟碳类惰性气体混合一起施用达到造影的目的。在成膜材料的组成中，包括磷脂类成分、起泡剂、聚合物成份、稳定剂等成分；这些成份在造影剂组合物中所占的重量百分比为，磷脂类物质的比例为1～10重量％，起泡剂的比例为5～15重量％，稳定剂比例为0.5～10重量％，高分子聚合物构成比为70～90重量％，其余为氟碳类惰性气体。
以上造影剂组合物可以以单位剂量形式存在，如分装成小瓶，使用时根据病人的需要施以不同的剂量，每一剂量单位中可以含有氟碳类惰性气体0.15～0.5ml。
所说的磷脂类成分选自至少一种以下物质：卵磷脂(PC)、氢化大豆磷脂(hydrogenated soy phosphatidylcoline，HSPC)、氢化蛋黄磷脂(hydrogenatedegg phosphatidylcoline，HEPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐(DPPA)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)。
所说的起泡剂选自至少一种非离子表面活性剂，非离子表面活性剂具体的如吐温类物质、司盘类物质；使用起泡剂的目的是为了增加在制备造影剂微泡时微泡的产出率，同时对脂膜起到稳定的作用。
所说的聚合物选自至少一种高分子聚合物，高分子聚合物具体的如泊洛沙姆(Poloxamer)，高分子聚合物的使用是为脂质成份及起泡剂在构成造影剂膜时提供一个支持结构，同时对膜的稳定性也有贡献。
使用的稳定剂选自聚乙二醇、单硬脂酸甘油酯、棕榈酸，优选的是聚乙二醇1500(PEG1500)，应用稳定剂的目的是为了减少造影微泡的相互融合倾向，改善脂质双分子层的亲水亲脂作用，增强造影微泡的稳定性。
氟碳类惰性气体在造影剂中的作用是与成膜材料共同为超声波提供一个声阻抗差较大的反射界面，所述的氟碳类惰性气体选自氟化物气体，氟化物气体具体地讲包括有全氟化碳气体、氟化硫气体等，在应用中主要为全氟丙烷、六氟化硫。
本发明的造影剂组合物可以采用以下的方法制备：
步骤(a)：
将所述的成膜材料磷脂类成分、起泡剂、聚合物成份、稳定剂等成分(具体如HEPC、Poloxamer 188、Tween 80及PEG 1500)与少量无水或含微量水的非水溶剂接触，利用超声和加热方式使其成为一个均匀的溶液体系，使用的温度为45～65℃，时间为20～40分钟。
在上述的步骤中所述的非水溶剂为无水或含微量水的丁醇等直链或支链醇。更优选的实施方案中所述的非水溶剂为叔丁醇。在上述做成膜材料散布及溶解于叔丁醇等直链或支链醇时所要求的温度为45～65℃，时间为20～40分钟。
步骤(b)：
将(a)溶液缓慢降温至0-4℃，使液体凝固，或先迅速放于0-4℃冷藏，然后使用超声(室温15-22℃)至乳浊液状或反复冻融方式使析出的颗粒分散均匀。超声方式可选用水浴式或探针式超声，更优选的实施方案中所述的超声方式为探针式超声。
步骤(c)：
用冷冻干燥机冷冻干燥处理，进行冷冻干燥的时间为20～25小时，冷冻干燥中所述负压吸引压力为50～120×10-3mBar，冷冻干燥温度控制为-40～-50℃。
步骤(d)
在严格控制的无菌室内将冷冻干燥好的冻干品粉碎，分装于小瓶中制成粉针剂，向瓶内注入氟碳类惰性气体，封盖即成。
本发明的优越性表现在：1.微泡产出率高，微泡浓度达1×109/ml，而且微泡均一性好，直径2～6um的微泡占50～70％(见图1)；2.造影剂在组织显影的有效增强时间长；3.成本低，产品造价远低于同类产品。
附图说明：
图1为配置后不同时间的微泡形态(造影剂稀释4倍后400倍光镜下观察)。a配置300min后；b配置5min后；c配置10min后；d配置20min后；e配置30min后；f配置50min后；g配置90min后；h配置120min后。
图2为造影剂经兔耳缘静脉团注给药后对肾脏声学造影增强显像图像；图中显示的是以0.1mLl/kg的剂量分别在推注前(a)、造影剂推注后30秒(b)、1分钟(c)的肾脏显影情况。
图3为造影剂经兔耳缘静脉团注给药后对肝脏声学造影增强显像图像，图中显示的是以0.1mL/kg的剂量分别在推注后10秒(a)、30秒(b)、1分钟(c)肝实质显影情况。
具体实施方式：
实施例1：以磷脂类成分为成膜材料的造影剂的制备
称取十六酸1.5mg、单硬脂酸甘油酯2mg、聚乙二醇1500(PEG1500)120mg和泊洛沙姆188(Poloxamer 188)120mg分散于3ml的叔丁醇，水浴60℃溶解。另称取蛋黄卵磷脂(PC)20mg分散于1ml叔丁醇中，水浴60℃超声溶解，与上液混匀，迅速于0~4℃冷置30分钟以上，液体呈凝固状，冻干20小时。称取200mg冻干样品装于5ml西林瓶中，充全氟丙烷气体，密塞，即制备得到固态的超声造影剂。
使用时隔塞注入2ml生理盐水，轻轻摇动形成微泡混悬液，取样观察微泡浓度为2×107/ml，粒径分布在2～10um，泡壁厚为300-1000纳米。
以兔为模拟动物，采用静脉团注注射方式进行体内的超声显影效果测定，结果表明本品的微泡与市售的超声造影剂Levovist有相似的显影效果，说明本品具有优良的体内超声显影作用。
实施例2：吐温的影响
称取十六酸1.5mg、单硬脂酸甘油酯2mg、聚乙二醇1500(PEG1500)120mg和泊洛沙姆188(Poloxamer 188)120mg分散于3ml的叔丁醇，水浴60℃溶解。另称取蛋黄卵磷脂(PC)20mg和不同量的吐温80(Tween 80)分散于1ml叔丁醇中，水浴60℃超声溶解，与上液混匀，迅速于0~4℃冷置30分钟以上，液体呈凝固状，冻干20小时。称取200mg冻干样品装于5ml西林瓶中，充全氟丙烷气体，密塞，即制备得到固态的超声造影剂。
使用时隔塞注入2ml生理盐水，轻轻摇动形成微泡混悬液，取样观察微泡微泡的浓度、平均粒径及2～8um的微泡百分比，结果见表1。
表1不同含量的Tween 80对微泡浓度、粒径及粒径分布的影响
Tween 80含量(重量％)
项目
3 6 8 10 14 18
微泡浓度
4 3 5 5 7 5
(107/ml)
平均粒径(um) 7 7 6 6 6 6
2～8um的微泡百
30 25 30 35 26 20
分比
从表1中可以看出，不同含量的Tween 80对微泡的浓度、粒径及粒径分布的影响较为显著，Tween 80的含量在8～14重量％时，微泡的浓度、平均粒径及2～8um的微泡百分比三者综合结果最好。试验发现Tween 80含量越高，冻干样品粘性也相应增加，因此更优选的实施方案中所述的Tween 80的含量不超过15重量％。实施例2中Tween 80的含量5～15重量％的微泡的显影效果好于实施例1。
实施例3：卵磷脂氢化后的影响
有研究认为以氢化卵磷脂(hydrogenated egg phosphatidylcholine，HEPC)制备的长循环脂质体比未氢化卵磷脂(non-hydrogenated eggphosphatidylcholine，EPC)制备的长循环脂质体体内清除慢。我们将蛋黄卵磷脂的氢化：粉状蛋黄卵磷脂(PC)加乙醇溶解，加5％钯碳，置氢化仪上氢化处理。氢化处理结束后，过滤，滤液减压旋转除去乙醇，冷冻干燥得白色氢化卵磷脂(hydrogenated egg phosphatidylcholine，HEPC)。
以氢化卵磷脂5mg取代实施例1中的蛋黄卵磷脂(PC)20mg，Tween 80 25mg其余步骤与实施例1相同，制备超声造影剂。取样观察微泡浓度为1×108/ml，粒径分布在2～8um，泡壁厚为200-800纳米。
实施例3的微泡比实施例1和实施例2有更强的显影强度和更长的显影时间，说明本品比实施例1和实施例2有更好的显影效果。
实施例4：不同冷冻方式的影响
称取十六酸1.5mg、单硬脂酸甘油酯2mg、聚乙二醇1500(PEG1500)75mg、泊洛沙姆188(Poloxamer 188)150mg、氢化卵磷脂5mg和Tween 80 25mg分散于2ml叔丁醇中，水浴60℃超声溶解。采用不同的冷冻方式处理(1)-10℃迅速冷冻；(2)0-4℃迅速冷藏；(3)反复冻融方式：“0-4℃凝固-水浴15-22℃超声至乳浊液状-0~4℃凝固”；(4)15-22℃室温放置至液体凝固，0-4℃冷藏10min。冻干20小时。称取200mg冻干样品装于5ml西林瓶中，充全氟丙烷气体，密塞，即制备得到固态的超声造影剂冻干粉。
使用时隔塞注入2ml生理盐水，轻轻摇动形成微泡混悬液。取样观察微泡的浓度、平均粒径及2～8um的微泡百分比，结果见表2。
表2不同冷冻方式对微泡浓度、粒径及粒径分布的影响
冷冻方式
(4)15~22℃室温放置
项目 (1)-10℃ (2)0~4℃ (3)反复 至液体
迅速冷冻 迅速冷藏 冻融方式 凝固，0~4℃冷藏
10min
微泡浓度
1 3 6 7
(108/ml)
平均粒径(um) 7 7 6 6
2～8um的微泡百
30 40 55 55
分比
从表2中可以看出，冷冻方式不同对微泡的浓度、粒径及粒径分布的影响显著，方式(3)(反复冻融方式：0-4℃凝固-水浴15-22℃超声至乳浊液状-0-4℃凝固)和方式(4)(15-22℃室温放置至液体凝固后0-4℃冷藏10min)所得的微泡的浓度、平均粒径和2～8um的微泡百分比结果最好。方式(3)和方式(4)的显影效果好于实施例3。
实施例5：
称取泊洛沙姆188(Poloxamer 188)150mg、氢化卵磷脂5mg和Tween 80 25mg分散于2ml叔丁醇中，水浴60℃超声溶解。18-22℃室温放置至液体凝固(40min)，0-4℃冷藏10min。冻干20小时。称取100mg冻干样品装于5ml西林瓶中，充全氟丙烷气体，密塞，即制备得到固态的超声造影剂。
使用时隔塞注入1ml生理盐水，轻轻摇动形成微泡混悬液，取样观察微泡浓度为1×109/ml，粒径分布在2～6um，泡壁厚为200-500纳米。
应用验证：兔体内肝肾的超声显影成像
使用实施例5制备的造影剂对兔体内肝和肾进行声学造影，以0.03ml/Kg的剂量经兔耳静脉团注给药，肝脏、肾脏约10秒时即出现明显增强显像，30秒达到高峰，有效增强时间超过1分钟。
实施例6：
称取泊洛沙姆188(Poloxamer 188)150mg、氢化卵磷脂8mg和Tween 80 20mg分散于2ml无水叔丁醇中，水浴60℃超声溶解。0-4℃冷藏至液体凝固，37-39℃超声至乳浊液状，室温放置凝固。冻干20小时。称取100mg冻干样品装于5ml西林瓶中，充全氟丙烷气体，密塞，即制备得到固态的超声造影剂。
使用时隔塞注入1ml生理盐水，轻轻摇动形成微泡混悬液，取样观察微泡浓度高于1×109/ml，粒径分布在2～5um，泡壁厚为200-500纳米。
应用验证：兔体内肝肾的超声显影成像
使用实施例6制备的造影剂显影效果好于实施例5，肾脏显像有效增强时间超过2分钟，肝实质在10分钟时显像灰阶度仍高于未造影前。