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用于分析方法的纳米多孔基底
    优先权要求
    本申请要求2005年12月20日提交的美国临时专利申请号60/751,924的优先权，其在这里完整引入作为参考。本申请也要求2006年12月15日提交的，Mauro Ferrari等的美国临时专利申请“用于生物液体分析的纳米多孔基底(Nanoporous Substrates for the Analysis ofBiological Fluids)”的优先权，其在此完整引入作为参考。

    联邦基金资助研究声明
    本发明的一些研究是由来自全国卫生研究所(NationalInstitutes of Health)的全国癌症研究所(National Cancer Institute)，合同号为NO1-CO-12400的联邦基金支持的。政府享有本发明的某些权利。

    【发明领域】
    本申请一般地涉及分析设备和系统及其制造和使用方法，更特别地，涉及使用纳米多孔材料的分析设备和系统及其制造和使用方法。

    【发明背景】
    有多种可用的分析临床样品中物质的技术，但是大多数常用技术要求昂贵的溶液以解决样品中高度丰富的物质产生的干扰，如血清情况中的白蛋白。这个问题的一个解决方案包括使用抗体捕获高度丰富的材料，并减低其在样品中的存在，以使其不干扰对其它目的物质的分析。存在对更好的方法和系统的需求，以便分析样品中的物质。

    发明概述
    在一种实施方式中，本发明提供了一种分级或分离的方法，包括：(a)提供一种含有第一组分和第二组分的样品；(b)提供一种含有纳米多孔材料的基底；和(c)将所述纳米多孔材料暴露于样品，其中当暴露时，所述纳米多孔材料保留所述第一组分但不保留所述第二组分。
    在另一个实施方式中，本发明提供了分析样品的方法，包括：(a)提供样品；(b)提供一种含有纳米多孔材料的基底；和(c)将所述纳米多孔材料暴露于样品；并且分析被纳米多孔材料所保留的样品部分。
    而在一个其它的实施方式中，本发明提供了一种检测生理条件标志物的方法，包括：(a)提供一种被生理条件影响的样品；(b)提供一种含有纳米多孔材料的基底；(c)将所述纳米多孔材料暴露于样品；(d)分析被纳米多孔材料保留的样品部分；和(e)将所得分析结果与对照样品的分析结果比较，以检测生理条件的标志物。
    而在又一种实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包括收集包含一种或多种组分的样品的用具；和包含配置为保留一种或多种组分的纳米多孔材料的基底。
    而在另一种实施方式中，本发明提供了一种分析系统，其包括分析仪器和一种包含纳米多孔材料的基底，其中所述基底被配置为增强了所述分析仪器对一种或多种分析物的敏感性。
    并且在又一种实施方式中，本发明提供了一种包含基底的探针，所述基底包含一种纳米多孔材料并且被配置为可插入质谱仪中。

    附图
    图1显示了二氧化硅A和B的扫描电子显微镜(ScanningElectron Microscopy(SEM))图像。
    图2(A)-(C)显示了人血清稀释样品(图2A)；暴露于A型纳米多孔二氧化硅颗粒后保留的人血清蛋白(图2B)；和暴露于B型纳米多孔二氧化硅颗粒后保留的人血清蛋白(图2C)的基质辅助激光解吸电离飞行时间(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time OfFlight(MALDI-TOF))质谱图。
    图3(A)-(C)显示了暴露于A型纳米多孔二氧化硅颗粒后保留的人血清蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图。A、B、C代表一组三次独立实验。
    图4(A)-(C)显示了暴露于B型纳米多孔二氧化硅颗粒后保留的人血清蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。A、B、C代表一组三次独立实验。
    图5(a)-(d)显示了胰岛素在四个不同浓度下的掺杂实验(spiking experiment)的质谱图：a)500ng/mL；b)200ng/mL；c)30ng/mL；和d)15ng/mL。
    图6示意性地显示了：使用纳米多孔硅晶圆，部分贫化血清(partial depletion of serum)的策略。纳米多孔硅晶圆被生产，并与血清一起温浴。温浴期后，所述晶圆被移去，并且将剩余的血清样品点样在弱阳离子交换芯片上进行表面增强激光解吸电离(SurfaceEnhanced Laser Desorption Ionization(SELDI))质谱(MS)分析，并与未暴露于纳米多孔晶圆的对照组血清的质谱图比较。
    图7显示了使用纳米多孔硅晶圆部分消耗血清的质谱分析的结果。如图6中描述，血清与氨基丙基基团包被的纳米多孔硅晶圆一同温浴。温浴后，所述血清被结合到弱阳离子交换芯片上，并随后进行质谱分析。获得了质谱(MS)指纹。天然血清(未暴露于纳米多孔晶圆的血清)与经晶圆消耗的血清比较。一个主峰(红色/右边的箭头)出现在天然血清中，其在相似的m/z范围内，遮蔽了一个较小的峰(蓝色/左边的箭头)。在与纳米多孔晶圆的温浴时部分消耗其蛋白质组成分的血清中，由蓝色/左侧箭头所指的峰与红色/右侧箭头所标记的峰相比，成为主峰。当在蓝色/左侧和红色/右侧的峰之间比较相对峰强度的比例时，在天然血清和用纳米多孔硅晶圆消耗后的血清之间显示出显著的偏移。
    图8示意性地显示了用纳米多孔玻璃珠从血清中收集分子的策略。用氨基丙基基团包被的玻璃珠与血清温浴。温浴期后，移去珠子，清洗，并且将结合的分子洗脱，点样到弱阳离子交换芯片上进行SELDI分析，并与未暴露于纳米多孔珠子的对照血清的质谱图比较。
    图9显示了由纳米多孔玻璃珠收集的分子的质谱分析结果。如图8描述，血清与氨基丙基基团包被的玻璃珠一同温浴。温浴后，所述血清首先结合到弱阳离子交换芯片上，并随后进行质谱分析。天然血清(未暴露于纳米多孔珠子的血清)与用17nm珠子收集的分子比较。在天然血清中，主峰(红色/右边的箭头)在相似的m/z范围内遮蔽了一个较小的峰(蓝色/左边的箭头)。在洗脱的样品中，即暴露于纳米多孔玻璃珠的样品中，由蓝色/左侧箭头所指的峰与红色/右侧箭头所标记的峰相比，成为主峰。蓝色/左侧和红色/右侧的峰之间的相对峰强度的比例，在天然血清和收集并随后从纳米多孔珠子上洗脱的分子之间，显示出显著的偏移。
    图10显示了用70nm孔珠子收集的分子的质谱分析结果。如图8描述，血清与具有70nm孔且被氨基丙基基团包被的玻璃珠一同温浴。温浴后，血清结合到弱阳离子交换芯片上，并随后进行质谱分析。天然血清(未暴露于纳米多孔晶珠子的血清)与用70nm珠子收集的分子比较。在相似的m/z范围内，主峰(红色/右边的箭头)遮蔽了一个较小的峰(蓝色/左边的箭头)。在洗脱的样品中，蓝色箭头所指的峰与红色箭头所标记的峰相比，成为主峰。蓝色/左侧和红色/右侧的峰之间的相对峰强度的比例，在天然血清和收集并随后从该珠子上洗脱的分子之间显示出显著的偏移。
    图11显示了未暴露于纳米多孔材料的天然血清和从孔径为17nm的玻璃珠和孔径70nm的玻璃珠洗脱的分子的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryl Amide GelEletrophoresis(SDS-PAGE))分析的结果。
    图12示出了肽测序结果，其显示了从孔径17nm的玻璃珠和孔径70nm的玻璃珠的洗脱物中获得的蛋白序列。
    图13(A)-(C)比较了使用纳米多孔材料(A)与经典的组织化学技术(B，C)以揭示病理识别体(discriminator)的血清学分级和纯化增强。图13(A)显示了血清暴露于纳米多孔表面提升了某些蛋白峰的检测。图13(B)：Masson的三色染色(右侧图面)显示了胶原沉积，这是为患者进行与慢性丙型肝炎感染相关的肝脏纤维化分阶段的必要信息(左侧图面，常规H&E染色)。
    图13(C)：Bielchowsky银浸渗法揭示了阿尔兹海默病大脑新皮层组织的神经炎斑块(neuritic plaque)(右侧图面)，不能被H&E染色检测的主要病理标志(左侧图面)。
    图14显示了使用透射电子显微镜(Transmission ElectronMicroscopy(TEM))的二氧化硅纳米多孔膜的形态，细节参见下文的实施例3。
    图15(i)-(ii)显示了在特定表面上温浴后的人血浆的MALDI-TOF的图谱。(i)与纳米多孔二氧化硅芯片温浴的血浆；(ii)与固态二氧化硅芯片温浴的血浆。分析的样品是添加有1mg/mL浓度降血钙素的5微升等份的人血浆。所述降血钙素的峰用星号(*)标记。
    图16显示了通过使用纳米多孔二氧化硅芯片收集获得的MALDI-TOF肽图谱的可重复性。
    图17(i)-(iv)显示了掺和有人降血钙素的血浆的低分子量(low molecular weight(LMW))收集。显示了用降低的降血钙素浓度掺杂血浆的四个实验(在降血钙素峰周围的m/z窗口中变化)：(i)1000ng/mL，(ii)200ng/mL，(iii)50ng/mL，(iv)20ng/mL。温浴和质谱条件如下文实验部分的实施例3所述。
    图18示意性地显示了设计一种载体(ship)的策略，该载体用于增强下文实施例4中详细讨论的低分子量蛋白质组(lowmolecular weight proteome(LMWP))的敏感性。
    图19显示了三种不同样品/基质MALDI制备物的MALDI-TOF质谱图。
    图20显示了对照组小鼠血清的MALDI-TOF质谱图。
    图21显示了使用四种不同纳米多孔珠子的小鼠对照血清的MALDI-TOF质谱图。左上图面：小孔径的二氧化硅纳米多孔珠子；右上图面：大孔径的二氧化硅纳米多孔珠子；左下图面：用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropyltrimethoxysilane(MPTMS))修饰的小孔径二氧化硅纳米多孔珠子；右下图面：用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane(APTES))修饰的大孔径二氧化硅纳米多孔珠子。
    图22示出了小孔径二氧化硅珠子洗脱物样品的1D凝胶电泳结果。从与小孔径二氧化硅珠子温浴的合并血清(pooled serum)中获得的珠洗脱物的Tris-甘氨酸梯度凝胶(8-16％丙烯酰胺)。最左端的泳道对应分子量标准，并且余下的泳道从左到右顺序地对应于珠洗脱物样品1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61和67(样品标识的关键字，参见下文实施例5中的表4)。
    图23示出了大孔径二氧化硅珠子洗脱物样品的1D凝胶电泳结果。从与大孔径二氧化硅珠子温浴的合并血清中获得的珠洗脱物的Tris-甘氨酸梯度凝胶(8-16％丙烯酰胺)。最左端的泳道对应分子量标准，并且余下的泳道从左到右顺序地对应珠洗脱物样品4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64和70(样品标识的关键字参见下文实施例5中的表4)。
    图24示出了小孔径APTES修饰的二氧化硅珠子洗脱物样品的1D凝胶电泳结果。从与小孔径APTES修饰的珠子温浴的合并血清中获得的珠洗脱物的Tris-甘氨酸梯度凝胶(8-16％丙烯酰胺)。最左端的泳道对应分子量标准，并且余下的泳道从左到右顺序地对应珠洗脱物样品2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62和68(样品标识的关键字参见下文实施例5中的表4)。
    图25示出了大孔径APTES修饰的二氧化硅珠子洗脱物样品的1D凝胶电泳结果。从与大孔径APTES修饰的珠子温浴的合并血清中获得的珠洗脱物的Tris-甘氨酸梯度凝胶(8-16％丙烯酰胺)。最左端的泳道对应分子量标准，并且余下的泳道从左到右顺序地对应珠洗脱物样品5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65和71(样品标识的关键字参见下文实施例5中的表4)。
    图26示出了小孔径MPTMS修饰的二氧化硅珠子洗脱物样品的1D凝胶电泳结果。从与小孔径MPTMS修饰的珠子温浴的合并血清中获得的珠洗脱物的Tris-甘氨酸梯度凝胶(8-16％丙烯酰胺)。最左端的泳道对应分子量标准，并且余下的泳道从左到右顺序地对应珠洗脱物样品3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63和69(样品标识的关键字参见下文实施例5中的表4)。
    图27示出了大孔径MPTMS修饰的二氧化硅珠子洗脱物样品的1D凝胶电泳结果。从与大孔径MPTMS修饰的珠子温浴的合并血清中获得的珠洗脱物的Tris-甘氨酸梯度凝胶(8-16％丙烯酰胺)。最左端的泳道对应分子量标准，并且余下的泳道从左到右顺序地对应珠洗脱物样品6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和72(样品标识的关键字参见下文实施例5中的表4)。
    图28显示了图27的凝胶中蛋白条带切出图谱。凝胶图像是图27凝胶的副本，带有用于获得串联质谱所用样品的条带切除样式的贴记(overlay)。从每条泳道中切除出低分子量条带，并将第8泳道中的所有蛋白条带切出。样品的编号和标识关键字如下。每条泳道中的条带被从上到下切出，从左侧的第2道开始(第1道对应于分子量标准)并进行到第7道。跳过第8道，继续从第9道切出条带到第13道。从这些泳道中的每一条切出4个条带。从第2泳道开始，顶端的条带对应于A1孔，到底部的条带，对应于D1孔。之后，从第8泳道切出条带，从顶端的条带，E6孔开始，到底部的条带G8。第2泳道，样品孔A1-D1；第3泳道，样品孔E1-H1；第4泳道，样品孔A2-D2；第5泳道，样品孔E2-H2；第6泳道，样品孔A3-D3；第7泳道，样品孔E3-H3；第9泳道，样品孔A4-D4；第10泳道，样品孔E4-H4；第11泳道，样品孔A5-D5；第12泳道，样品孔E5-H5；第13泳道，样品孔A6-D6；第7泳道，样品孔E6-G8。
    图29示出了图25中蛋白条带切出的图谱。凝胶影像是图25中凝胶的低分子量区域，第10泳道到13泳道的副本，带有用于从12泳道和13泳道获得串联质谱所用样品的条带切除样式的贴记。从12泳道和13泳道中切出低分子量条带。样品编号和标识关键字如下。从左边的第12泳道开始，并进行到13泳道，从上到下切出每条泳道中的条带。从这些泳道中的每一条切出5个条带。从第12泳道开始，顶端的条带对应样品孔H8，到对应于样品孔D9的底部条带。从第13泳道切出条带，从顶端条带，孔E9开始，到低端条带A10。
    图30示出了图26中凝胶的蛋白条带切除图谱。凝胶图像是图26的凝胶的副本，具有用于获得串联质谱所用样品的条带切除样式的贴记。仅从第6泳道中切出所有的蛋白条带。样品编号和标识关键字如下。从第6泳道自上向下切出条带。从这一泳道中共切出17个条带。从顶端的条带开始，该样品对应于孔B10，到对应于孔B12的底部条带。从凝胶顶端开始的条带对应于样品孔B10、C10、D10、E10、F10、G10、H10、A11、B11、C11、D11、E11、F11、G11、H11、A12和最后的B12。
    图31示出了合并血清的SELDI质谱图。显示了从合并及稀释的原血清的WCX2芯片获得的SELDI谱。每个样品由一式两份图谱表征。从顶端：图谱1和2，第28天-克隆8的血清；图谱3和4，第28天-克隆10；图谱5和6，第42天-克隆8；及图谱7和8，第42天-克隆10。
    图32示出了合并血清的SELDI质谱图。显示了从合并及稀释的原血清的WCX2芯片获得的SELDI谱。每个样品由一式两份图谱表征。从顶端：图谱1和2，第60天-基质胶(matrigel)对照血清；图谱3和4，第60天-BT474对照；图谱5和6，第60天-MCF7对照细胞系；及图谱7和8，第60天-克隆8。
    图33示出了合并血清的SELDI质谱图。显示了从合并及稀释的原血清的WCX2芯片获得的SELDI谱。每个样品由一式两份图谱表征。从顶端：图谱1和2，第60天-克隆10的血清；图谱3和4，合并对照组A；图谱5和6，合并对照组B；及图谱7和8，合并对照组C。
    图34(A)-(C)示出了珠洗脱物的SELDI谱。
    图35(A)-(C)示出了珠洗脱物的SELDI谱。
    图36(A)-(C)示出了珠洗脱物的SELDI谱。
    图37(A)-(C)示出了珠洗脱物的SELDI谱。
    图38(A)-(C)示出了珠洗脱物的SELDI谱。
    图39(A)-(C)示出了珠洗脱物的SELDI谱。

    发明详述
    除非另有说明，词语“一/一个(“a”)或者一/一个“an”)”用在此处表示“一个或多个”。
    在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其包括提供含有第一组分和第二组分的样品，提供含有纳米多孔材料的基底，并将所述纳米多孔材料暴露于所述样品。暴露时，所述纳米多孔材料保留所述第一组分但不保留所述第二组分。
    优选地，所述样品是生物学样品，即，含有生物分子的样品，如蛋白、肽、抗原、抗体、蛋白片段、RNA或DNA。所述生物样品可以是来自植物；动物，包括哺乳动物，优选地人类；或细胞培养物的样品。所述生物样品可以是生物液体的样品，如血液(blood)、血清(blood serum)、血浆(blood plasma)、尿液(urine)、精液(seminalfluid)、精浆(seminal plasma)、胸膜液(pleural fluid)、腹水(ascites)、乳汁(nipple aspirate)、粪便(feces)或唾液(saliva)。
    所述纳米多孔材料可以是孔径分布以小于1000nm为中心，优选地小于100nm为中心的任何材料。在一些实施方式中，所述纳米多孔材料可以是纳米多孔硅。而在另一些实施方式中，所述纳米多孔材料可以是纳米多孔氧化材料，如纳米多孔二氧化硅或纳米多孔氧化铝。
    所述纳米多孔材料可以通过分子量分离第一组分和第二组分，也即，被纳米多孔材料保留的第一组分，与第二组分相比，具有较小的平均分子量。
    被纳米多孔材料保留的组分可吸附到纳米多孔材料，即，它是可被温和洗涤掉的组分，如用去离子水洗涤去的组分。
    被纳米多孔材料保留的第一组分可以是低分子量组分，即，一种组分，其中几乎所有分子的分子量不高于20kDa，或不高于15kDa，或不高于10kDa，或不高于5kDa或不高于4kDa。
    所述纳米多孔材料可以发挥分子截留(cut off)的作用，即所述纳米多孔材料可以保留分子量等于或小于分子截留重量的所有或基本上所有分子，但不保留分子量大于分子截留重量的所有或几乎所有分子。所述纳米多孔材料的分子截留重量可通过调整该纳米材料的孔径而改变。
    所述纳米材料的表面可以被修饰，例如，通过积累在该表面上的电荷或官能团修饰。这样的修饰可以被用于保留样品的特定组分。例如，可以通过用含氨基的分子，如氨基硅烷，修饰所述表面以提供正电荷。可以通过用含有巯基基团的分子，如巯基硅烷，修饰所述表面以提供负电荷。所述表面也可以通过积累含有长链烷基(大于C10)的分子，如烷基硅烷，用疏水基团修饰。
    所述纳米多孔材料的表面也可用诸如铜或铁的金属修饰，这可以提高该纳米多孔材料对样品特定组分——如磷酸化蛋白——的亲和力。要修饰诸如纳米多孔二氧化硅的纳米多孔氧化物表面，可在该纳米多孔氧化物的合成过程中加入所述金属的盐。例如，对于纳米多孔二氧化硅，不同量的Cu(MeCO2)2H2O可以被加入CTAB(十六烷基三甲基溴化胺(cetyltrimethylammonium bromide))和TEOS(四乙基原硅酸盐(tetraethylorthosilicate))及Na2O和H2O中。之后，可在约200摄氏度和约540摄氏度进行高温处理。纳米多孔硅的表面，可以通过使用化学镀层(electroless plating)，用金属修饰。
    含有纳米多孔材料的基底能够以各种形式提供，包括但不限于薄膜、晶圆、颗粒或微芯片。
    在一些实施方式中，所述基底可用自顶向下的技术制造，如光刻法、电子束蚀刻、X射线蚀刻、深紫外光刻和纳米压印法。
    在一些实施方式中，样品中被纳米多孔材料保留的组分可以从样品中提取，以进行例如进一步的分析或观察。
    而在另一些实施方式中，可在不提取第一组分的情况下对纳米多孔材料保留的样品组分进行进一步分析或观察。
    对第一组分的进一步分析可通过例如凝胶电泳，如SDS-PAGE；色谱；生物分析技术或质谱，如MALDI-TOF质谱、LS/MS质谱、电喷射离子化质谱、串联质谱或SELDI质谱进行。
    在分析前将所述样品暴露于所述纳米多孔材料能够增强该分析的检测水平。例如，将样品暴露于纳米多孔材料，质谱能够检测浓度不高于1000ng/mL，或不高于200ng/mL，不高于100ng/mL，或不高于20ng/mL，或不高于10ng/mL，或不高于5ng/mL，或不高于1ng/mL的低分子量分子的存在。
    含有所述纳米多孔材料的基底也可用于检测和/或识别生理条件的生物标志物，如疾病或疾病的阶段的生物标志物。疾病可以是，例如癌症，如乳腺癌。
    要检测和/或识别生理条件的生物标志物，我们可以将被该生理条件影响的样品暴露于含有纳米多孔材料的基底，分析纳米多孔材料保留的样品的部分，并将分析的结果——如质谱图谱，与对照组的相似的分析结果进行比较，对照组即未被该生理条件影响的样品。
    含有所述纳米多孔材料的基底也可以被用于收集和/或储存生物学样品。例如，在某些实施方式中，含有纳米多孔材料的基底可以是试剂盒的一部分，该试剂盒也包括任何收集生物样品的可行工具。收集到的样品可暴露于所述纳米多孔材料，并随后储存，以便用于以后的分析或观察。
    在一个实施方式中，含有所述纳米多孔材料的基底可以是基于特定分析仪器的分析系统的一部分。在这样的情况下，所述基底可被特定地配置为增强分析仪器对一种或多种分析物，如低分子量生物分子的敏感性。
    对于这样的应用，所述基底可以具有一个或多个含有所述纳米多孔材料的区域。每个这样的区域被不吸附目的分析物的区域包围。包围区域优选地是非纳米多孔区域，即其不含有纳米多孔材料。可用对吸附目的分析物具有抗性的官能团，使包围区域钝化(passified)。在肽和蛋白的情况下，所述包围区域可用亲水官能团，如含有PEG的聚合物进行修饰。
    在一些实施方式中，所述基底可将待分析的样品集中或浓缩在一个或多个含有所述纳米多孔材料的区域。这样的集中或浓缩能够减少暴露于分析的样品量，这又可以增强对目的分析物的敏感性。
    在一些实施方式中，含有所述纳米多孔材料的区域的大小可以被制成符合所述分析仪器离子化源的活性区域的大小。例如，当所述分析仪器分析激光的离子化时，含有所述纳米多孔材料的区域大小可以符合激光束的大小(直径)。这样的基底对使用激光进行离子化的质谱分析仪器特别有用，如MALDI质谱仪或SELDI质谱仪。
    在一些实施方式中，含有纳米多孔材料的基底可被配置为插入质谱仪的探针，如MALDI质谱仪或SELDI质谱仪的探针。
    本发明进一步由以下实施例，但以非限制的方式示出。

    实施例1
    本实施例中括号里的引用，指的是实施例1最后的参考文献列表。

    1.简介
    癌症以及其它疾病早期检测的人血浆/血清的蛋白质组分析，对许多研究小组来说，是一个日益感兴趣的领域[1、2以及其中的参考文献]。更多的关注特别集中在与载体蛋白结合的低分子量分子，其被认为产生和构成含有用于发现生物标志物的独特MS图谱的大部分离子[3-5]。因此，设计为模仿载体蛋白(如白蛋白)结合并进行低分子量蛋白组(low molecular weight proteome(LMWP))收集的颗粒的设计与开发，对生物标志物的发现有很大影响[6-8]。基于SELDI-TOF质谱的来自Ciphergen的蛋白芯片阵列系统(ProteinChip Array System)是发现“分子信号(molecular signature)”的使用最广泛的平台[9、10]。在该领域最近的技术进步中，出现的有前景的方法包括：新肽组学(peptidomics)平台，其将小肽的磁基、自动固相提取与MALDI-TOF质谱读数关联起来[11、12]；在硅的修饰表面解吸/离子化(DIOS)[13]以及硅纳米线(Silicon Nanowires(SiNWs))上的解吸/离子化[14]。对于基于蛋白质组的生物标志物的发现，纳米技术能够提供机会和挑战[15]。要将纳米技术的潜力转化到蛋白质组学上，研究了纳米多孔二氧化硅应用于筛选血浆蛋白，其目的是更有效且高效地收集血浆LMWP。
    对从两种不同的纳米多孔二氧化硅表面提取的血浆蛋白，进行了基质辅助激光解吸电离飞行时间(matrix assisted laser desorptionionization-time of flight(MALDI-TOF))质谱分析。所得的质谱图显示了纳米级二氧化硅颗粒保留上百个肽和小分子量蛋白的能力。

    2.材料和方法

    2.1材料和仪器
    凝胶合成的试剂包括硅酸钠溶液(Sigma，St Louis，MO，美国)、气相二氧化硅(fumed silica)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，美国)、聚氧乙烯(10)异壬基苯基醚(Nonfix 10，Condea，Houston，TX，美国)和十六烷基三甲基溴化胺(CTABr，Aldrich，St.Louis，MO，美国)。MALDI基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)从Sigma公司(St.Louis，MO，美国)获得。蛋白酶抑制剂鸡尾酒(PIC：肝磷脂锂(lithiumheparin)、EDTA、AEBSF、苯丁抑制素(bestatin)、E-64、亮抑酶肽(leupeptin)和抑肽酶(aprotinin))从Sigma公司(St.Louis，MO，美国)购买。牛胰脏胰岛素从Sigma公司(St.Louis，MO，美国)获得。
    所有的样品在Applied Biosystems Voyager-DETM STR质谱仪上(Framingham，MA，美国)用氮激光器发出的337nm的光进行分析。分析以线性模式进行。

    2.2合成步骤
    二氧化硅样品A和B按照两种不同的合成途径获得，如[16、17]中所述。简单地说，二氧化硅样品A和B以加入以下摩尔数的组分的凝胶起始而获得：二氧化硅A SiO2：0.064 Nonfix 10、0.6NaOH、0.8 HCl、58 H2O；二氧化硅BSiO2：0.2 CTABr、0.2 NaOH、0.04Al(OH)3、40 H2O。
    对二氧化硅A，在表面活性剂溶液(2.9g Nonfix 10和4.05gNaOH，溶于57.4g H2O中)完全分散后，加入14.6g硅酸钠。最后，加入5.33g37％wt％的HCl，并且该凝胶在室温下稳定24小时，随后在烤箱中100℃加热24小时。
    二氧化硅B，是通过向含有0.52g Al(OH)3、1.35g NaOH和130g H2O的溶液中加入10g气相二氧化硅获得。所述凝胶在室温下稳定2小时，随后在140℃的烤箱中加热24小时。所述合成凝胶被过滤，用去离子水冲洗，并在80℃干燥12小时。
    在77K下的氮气吸附解吸体积等温线，是在MicrometriticsAsap 2010设备上测量的。样品在真空中300℃烘烤过夜，并且苯甲酰化的(benziylated)样品被在230℃处理到相同的剩余压力。所述样品的表面面积，是通过在0.005到0.2p/P0的压力范围内的Brunauer-Emmet和Teller(BET)线性化获得的[16]。

    2.3血浆收集
    人血浆按照[18]中建议的指导获得。简单地来说，血液被收集到预先加入有300μL PIC的8mL肝磷脂锂血浆分离管(PSTTM367965，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，美国)中，并在抽血的15分钟内，在4℃下，2500g离心15分钟。离心结束30分钟内，将血浆层分成1.0mL的等份；并用干冰/乙醇浴迅速冷冻。

    2.4实验步骤
    二氧化硅颗粒的等份试样(5mg)与500μL人血浆稀释样品(1:5)混合，并在室温下摇动1小时。悬液在2000xg离心2分钟，随后二氧化硅颗粒被从上清液中分离并用去离子水洗涤(4 x 100μL)。二氧化硅表面保留的血浆蛋白按如下步骤提取：二氧化硅颗粒被悬浮在100μL溶液(4.95:4.95:0.1的水/甲醇/0.1％TFA)中，并迅速以2000xg离心5分钟。含有提取蛋白的上清液，用MALDI-TOF-MS分析。1μL上清液与4μ LCHCA基质混合，随后1μL所得溶液被点样在MALDI盘中并风干。

    2.5掺杂实验
    血浆样品用四种不同浓度的胰岛素掺杂：500ng/mL、200ng/mL、30ng/mL和15ng/mL。所述样品是如2.3部分所述暴露于二氧化硅A之后的。最后，5μL血浆提取蛋白被洗脱进3μLCHCA基质中，随后1μL所得溶液被点样在MALDI盘中并风干。

    3-4结果和讨论
    在本研究中，研究了新型纳米多孔二氧化硅颗粒从人血浆中捕获并富集低分子量肽和蛋白的能力。本档案现在被认为含有针对潜在的、疾病特异的生物标志物的未开发资源[3-5]。对这一信息档案迅速归档并丰富的有效途径，可以对生物标志物的发现有显著影响。
    图1显示了二氧化硅A和B的形态。氮气吸附-解吸等温线表明二氧化硅A的表面积是406m2/g并且孔体积为0.3cm3/g。应用于等温线解吸分支的Barret-Joyner-Halenda(BJH)模型显示了孔系统的双峰性(bimodality)，表明孔径以26.8和为中心分布。对于二氧化硅B，表面积是848m2/g并且孔体积为1.21cm3/g。BJH孔径分布以25和为中心。
    探索性试验被设计出来，以评价纳米多孔二氧化硅对血浆蛋白，并且特别地对低分子量蛋白质组蛋白的捕获能力。
    在进行基于MS的分析前，对样品预浓缩的一个快速且简单的方法被开发出来，其允许将生物样品的潜在降解减到最小。与未处理的样品相比，用二氧化硅颗粒处理的人血浆样品的质谱显示出LMWP明显可见的富集，这依靠所使用的特定纳米多孔二氧化硅基底，见图2。
    两个用纳米多孔二氧化硅处理的样品的MALDI-TOF谱都显示了上百个峰，特别是在800到5000道尔顿的低分子量区间。对每一批二氧化硅，实验以一式三份进行，以评价该测试的可重复性。数据表明所述方法产生可重复的高强度信号的总谱图(见图3A-B-C和图4A-B-C)。高质量的谱图可能是清除程序的产物。清洗二氧化硅基底(在提取捕获的蛋白之前)可以去除潜在地引起严重信号抑制的盐、不挥发的和疏水的污染物。有效地产生二氧化硅颗粒保留分子的可重复谱线的能力(图3和4)也归因于二氧化硅基底固有的化学稳定性[16、17]。
    用不同浓度的胰岛素(分子量5733.5Da)进行血浆样品的掺杂，以建立本文描述方法的测试极限(limit of detection(LOD))。人血浆中浓度低至15ng/mL的胰岛素的MALDI-TOF信号，被检测出(图5)。
    与MALDI-TOF技术联合的本方法，对检测每毫升低纳克范围的血浆肽，是足够敏感的。考虑到目前对生物标志物，如结合珠蛋白的α亚基，用MS可识别的最低浓度是1000nmol/L[22、23]，本文的LMWP血浆富集方法将LOD降低了约400倍。
    基于MS谱图，带有不同孔径的两种二氧化硅基底中的每一种，在与相同的血浆样品温浴后，保留了不同的肽/蛋白组合(repertoire)(见图2)。尽管本发明不被其操作理论所限，但是可以假设所观察到的不同是以基底的表面属性及通过静电相互作用将蛋白吸附至亲水表面的倾向为基础的。LMWP结合，可通过附加的化学和结构修饰，使二氧化硅基底的表面属性合适而增强。

    5.结论性评论
    已经显示出：纳米多孔二氧化硅颗粒能够被成功地用作类似载体蛋白的实体，并在血浆/血清或其它生物学液体中富集低分子量分子。结果显示了分子的潜在选择性和选择性结合LMWP的纳米多孔二氧化硅颗粒的分子识别体属性。因此，这些新基底与质谱表面结合，能够提供生物标志物组分自身快速测序以及基于LMWP预测药物的潜在平台的方法。
    6.参考文献列表

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    实施例2

    使用纳米多孔材料分级分离血清组分
    许多前面未表征的属于低分子量循环蛋白质组的分子，可以提供生物体的持续病理生理的持续图片。最近，包括低分子量分子在内的蛋白质组信号，已经通过使用质谱与生物信息学算法相结合进行鉴定。这些证明已经指出存在包含丰富诊断信息来源的信息档案。目前正在试图进行排序并鉴定支持指纹的分子。这样的发现——许多这种低分子量分子可能存在与循环载体蛋白质相关——可能为处在基于质谱的分析之前的分级和分离技术提供新的机会。
    纳米多孔基底代表了容易的和可重现的低分子量生物标志材料的分级和选择性结合的新方法。氨基丙基-包被的纳米多孔硅，当暴露于血清时，可以消耗蛋白血清，并产生不同的MS图像发生改变的血清。此外，具有控制孔径的氨基丙基-包被纳米多孔玻璃珠可以与血清蛋白的小集合结合，并在强力洗脱下释放它们。洗脱的蛋白质具有不同的MS图像，凝胶电泳图像，以及不同的多肽序列标示，这是基于纳米孔的尺寸而改变的。卵巢癌的两种潜在生物学标志物，甲状腺素运载蛋白以及脱辅基脂蛋白A-1，被基于珠的孔径有区别地分离。这种新的血清分级方法的系统使用，当与生物信息学分析结合时，可以增加诊断信息的路径，这与在评价疾病组织过程中病理学家使用无数组织化学染色剂是相似的。纳米多孔材料表面可以在收获和储存血液中那些不稳定的和载体蛋白结合分子中使用。此外，从这些与纳米多孔基底相关的研究中获得的知识可以促进使用难熔性纳米收获剂，其可以监控关于早期疾病相关信号的循环。

    简介
    就其核心而言，病理学是一个医学专业，其建立在对疾病征兆的仔细的系统性观察上，通过对正常和疾病组织变异体的精确比较而有所发现。如每个医学学生所知，病理学诊断领域的原始状态是在身体检查时对皮层组织病理学(underlying tissue pathology)的四种主要状态的识别：肿(tumor)、痛(dolor)、热(calor)、以及红(rubor)。相似地，对组织的初始检查可能以视觉和触觉观察开始。然而，这只是用于完全病理评价的现代组织评估的开始。由于显微镜和实验室方法的引入产生了现代医学病理学实践，技术进步揭示了对疾病过程的提高的灵敏和深入观察。通过现代临床试验检测和组织处理，大量的测试为当代病理学家提供了工具，以便给向其咨询的医生提供有意义的诊断。带着全部这些测试，辨别并解释迹象和迹象的形式是病理学家专业的中心。某些组织学形式，如给定组织对苏木精和曙红(H&E)不同的摄取，与特定的疾病状态和预后结果的相关性是持续发展的过程，其成为了病理学咨询的基础。组织的组织化学方法可以被认为是不同染料、抗体、探针等的组织分级方法。然而，组织的组织化学方法仅揭示了所选择组织的亚成分，而允许其它亚成分逃过检测。
    按照病理学持续将新技术整合进其实践这一有意义的传统，现代病理学是评价新测试平台在基于患者的诊断中的适用性。一方面，新型的、灵敏度更高的质谱仪被用于发掘患者体液和组织样品中的潜在诊断信号(Rosenblatt等，2004，见实施例2末的参考文献列表)。这些努力是新学科的一部分，称为组织蛋白质组学，其中生成患者组织内分子多种组合量度，并与疾病状态和结果相关。由于使用组合标志的方法使特异性和灵敏度都有效提高，在其自身发作成肿、痛、热或者红之前，及早地检测并发现致命疾病是可能的。
    使用与生物信息分析相关联的质谱的蛋白质组指纹方法，已经在血液和组织蛋白质组的低分子量范围内产生了关于存在潜在的诊断信息内容的线索(Chaurand和Caprioli，2002；Hingorani等，2003；Paweletz等，2000；Petricoin等，2002a；Petricoin等，2002b；Schwartz等，2004；Stoeckli等，2001；Yanagisawa等，2003)。既然这些信息档案已经被这些研究涉及，努力是对于疾病相关的指纹的基础组分进行测序和表征。
    联合形成诊断形象的分子可以是各种小蛋白和蛋白片段，其由多个组织流入到组织间隙液中并与血管内小室建立了平衡。由体内细胞持续合成并降解蛋白质，可能反应了总体的健康状况。宿主内表达的蛋白质组可代表所有细胞(正常和疾病细胞)之间复杂的相互关系，因此体液，如血清，可能是疾病生物标记的发现及诊断测试方法的开发信息的丰富来源。最近的工作表明携带疾病指纹的低分子量分子与较大的载体分子结合(Mehta等，2003)。所以，这些低分子量分子的分离，以及容纳并保护它们不受肾脏清除的驻留载体蛋白的分离，是用于新生物标记发现及测序的基于质谱的组织蛋白质组学的目标。
    对与载体蛋白结合的低分子量蛋白的更加全面和广泛的分析可能需要开发新的分级方法，新方法能够揭示使用现今形式无法获得的潜在有用诊断信息。纳米多孔材料表面的制造可以是有条理地分析循环系统内出现的蛋白和蛋白片段的各种子集的一个策略。所述纳米多孔材料具有通过特定的化学衍生化过程(derivitizataion)而被修饰和被功能上操纵的能力，从而使选择性和自定义的结合及分级能够进行。而且，纳米多孔性显著增加了表面积，使得选择性分级和结合能够以潜在地较高效率和速度发生。选择性分级的方法和材料可以对组织蛋白质组学领域有贡献，这在某种意义上类似于临床化学家在创造世界各地的病理学实验室每天使用的组织固定和组织化学试剂工具库(arsenal)的过程中所作的创新。
    在本实施例中，显示了纳米多孔材料表面用作基于血清的分析与生物标记发现中的分级的工具。在一个实验中，纳米多孔硅晶圆用于选择性地耗尽血清的高丰度蛋白。另一种方法是用纳米多孔的、孔径受控的玻璃珠从血清中收集不同的蛋白质组断面状况，以进行后续的洗脱和评估。

    材料和方法

    血清样品
    所述血清样品是储存在-80摄氏度，来自正常捐献者的单一合并物。

    化学试剂
    化学试剂：乙腈(acetonitrile(ACN))(HPLC级)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、碘乙酰胺(97％)、甲醇(99+％)和二硫苏糖醇(DTT)从Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)购买。甲酸(88％)、醋酸(冰)从Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)购买。H2O在室内用Kontes高纯度水系统(Kontes High Purity Water System)双蒸馏。测序级修饰猪胰蛋白酶从Promega(Madison，WI)购买。
    其它材料：牛血清白蛋白从Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO购买。 Ruby蛋白胶染料从Molecular Probes，Eugene，OR购买。预制的4-12％ Bis-tris 1D凝胶、LDS样品和跑胶缓冲液、抗氧化剂及预染色基准蛋白梯度，从Invitrogen公司购买。熔融石英(fusedsilica)从Polymicro Technology Phoenix，AZ购买。

    纳米多孔硅晶圆的制造
    从Silicon Quest公司购买的，电阻率<0.005ohm-cm的，硼掺杂的、(100)定向硅晶圆被用作基底。晶圆在120℃的piranha溶液(H2SO4:H2O＝1:1)中清洗30分钟，随后在HF:H2O＝1:10的氢氟酸溶液中去除氧化物，并用去离子水冲洗。多孔硅表面通过电化学刻蚀在自制的Teflon元件中制备。所述晶圆放在Teflon元件的底部，其下垫铝箔(0.1mm厚)以提供电接触。白金网被置于元件的腔室中作为反电极。电解液是体积比1:1混合的49％的HF和乙醇。施加72mA/cm2的恒定电流密度65秒。在多孔硅形成后，立即用去离子水冲洗该样品，并将其置于真空中以除去湿气。所述多孔硅在10％APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)的甲苯溶液中被硅烷化。为了要从纳米孔中去除气泡，所述多孔硅被置于真空中3分钟。反应溶液在室温下的密封盘中回流3小时。所述多孔硅用甲苯、丙酮冲洗若干次，并在N2气流中干燥。应用于等温线氮气解吸分支的Barret-Joyner-Halenda(BJH)模型表明：孔径分布以2-20nm为中心。

    用纳米多孔硅晶圆部分消耗血清
    氨基丙基包被的纳米多孔硅晶圆被置于1.5ml试管中并在去离子水中润洗4次。用去离子水1:5稀释的500μl合并血清样品随后被加入到晶圆上，并且将该混合物在室温下温浴1.5小时。温浴后，稀释血清的上清液被移去并储存在-80摄氏度，以便进行后面的MS分析。对于对照组，稀释的血清样品同样被冷冻。作为进一步对照组，所述晶圆也与代替稀释血清的去离子水一同温浴。

    用孔径可控的纳米多孔玻璃珠收集蛋白
    氨基丙基包被的孔径受控的玻璃珠，孔径为70nm或者17nm，从Sigma公司，St.Louis，MO购买。氮气吸附-解吸等温数据表明17nm珠的表面积为30.8m2/g并且孔体积为0.032cm3/g。
    对于70nm珠，表面积为130.5m2/g并且孔体积为0.93cm3/g。
    对于每一个实验，称量出10mg珠子置入1.5ml试管中。珠子用去离子水润洗4次。用去离子水以1:5稀释的合并血清随后被应用于珠子样品中，并且该混合物在室温下温浴1.5小时。温浴后，所述稀释血清的上清液被移除并保存。珠子用1ml去离子水润洗两次。润洗后，500μl洗脱缓冲液(5ml乙腈，5ml水，10μl三氟乙酸)被应用于样品上，其随后在室温下摇动0.5小时。之后，洗脱物被收集并储存在-80摄氏度，以便进行随后的MS分析。

    质谱
    低分辨率质谱产生的谱图，被用作一般化无偏差的读数去评价分级效果。弱阳离子交换的表面增强激光解吸电离(SELDI)芯片用Biomek 2000生物处理器(WCX2 Ciphergen Biosystems，Inc.)处理。加入100μl10mM的HCl到芯片上，接着温浴5分钟。然后，HCl通过抽吸除去并随后用100μl水温浴1分钟。水被吸去并加入新鲜的水，进行另外的1分钟。接下来加入100μl10mM醋酸铵与0.1％Triton X到芯片上并温浴5分钟。所述醋酸铵混合物随后被吸去并抛弃，接下来使用醋酸铵混合物再次温浴5分钟。这些准备步骤之后，所述芯片用真空干燥。5μl样品，如血清，随后被加入到芯片点上并温浴55分钟。所述芯片先用150μl磷酸盐缓冲液再用150μl水润洗3次。该芯片随后被真空干燥并加入1.0μl30％的肉桂酸在50％(v/v)乙腈中的溶液，0.5％的三氟乙酸被加到每个蛋白点上两次，并在每次加入之间干燥。该芯片随后用PBS-II质谱(Ciphergen Biosystems，Inc.)分析。每个点的谱图用以下设置收集：检测器电压1,800V；聚焦质量为6,000Da；质量上限(the hi mass limit)为20,000Da；敏感度增益设为5；激光强度为145；每个位置采集15份激光照片；位置的编号在20到80的范围内变化，每5个位置增加一次。创建一个能等同地处理所有样品的流程。

    蛋白测序研究
    蛋白质分析：从17nm和70nm孔珠子得到的珠分级样品通过常规的Bradford分析测定，用200μg/mL到1mg/mL范围内的牛血清白蛋白(BSA)标准，在595nm下、在UV-VIS分光光度计(Plus 384，Molecular Devices)上监测的。
    1D凝胶分离和消化：每种珠分级样品15g和3μL原血清，在30μL LDS样品缓冲液中稀释并在95℃煮沸5分钟。该组分在1D预制凝胶(4-12％Bis-tris)上电泳，以分离复合蛋白混合物的期望分子量区域。所述凝胶用ddH2O彻底清洗，在50％甲醇/10％醋酸溶液中固定30分钟，用红色染料染色过夜，并在紫外激发和观察之前在ddH2O中脱色3小时。该凝胶被切成1mm2的胶块并且所述凝胶条带在50％的甲醇中脱色。凝胶条带用10mM二硫苏糖醇(DTT)和55mM碘乙酰胺还原并烷基化，在4℃的胰蛋白酶(20ng/μL)中温浴1小时，并允许在37℃的25mM NH4HCO3中消化过夜(16小时)。第二天早晨，用70％ ACN/5％甲酸溶液反复温浴，将蛋白从凝胶中提取出来。
    μLC/MS/MS分析：所述样品被冻干至接近干燥，并在6.5μL的HPLC缓冲液A(95％H2O，5％ ACN，0.1％ FA)中重建，以进行质谱分析。用与带有改良型纳米喷射源的ThermoFinnigan LCQ经典离子阱质谱(San Jose，CA)在线连接的Dionex的LC Packings液相色谱系统，进行微毛细管反相LC/MS/MS分析。反相分离用内部的，充满浆体的毛细管柱进行。C18二氧化硅结合柱的内径为75μm，外径为360μm，是填充有带有300埃孔的5μm珠子的10cm长熔融石英(Vydac，Hesperia，CA)。一个5mm的μ-前置柱PepMap，C18柱体(cartridge(Dionex))发挥脱盐柱的功能。样品以μL拾取模式注入，并在线性梯度洗脱之前用缓冲液A洗5分钟，线性梯度洗脱使用浓度达85％的缓冲液B(95％ACN/5％H2O/0.1％甲酸)，在200nL/min的流速下洗脱95分钟。全面的MS扫描之后是四次对最丰富肽离子的MS/MS扫描(以数据依赖模式)，并且碰撞诱导解离(collision induced dissociation(CID))在38％的碰撞能量下进行，离子喷射电压设置在2.00kV，毛细管电压和温度分别为22.80V和180℃。
    数据分析：数据分析通过Sequest Biowork Browser(ThermoFinnigan)，在欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticsInstitute)的非冗余蛋白质组的Swiss-Prot、TrEMBL和Ensembl条目中，搜索MS/MS谱来进行。在过滤掉相关分数(表1)并手工检查MS/MS数据后，肽被认为是合理发现(legitimate hits)。用于过滤数据的条件至少与大多数文献引用的一样严格。

    表1

    电荷   Xcorr     DeltaCN   离子     Rsp

    +1     >1.9      >0.1      >50％    ＝1

    +2     >2.5      >0.1      >50％    ＝1

    +3     >3.5      >0.1      >50％    ＝1
    可接受的肽发现相对于数据库中所有其它的肽需要具有Xcorr评定＝1。

    结果

    用纳米多孔硅消耗血清
    分级血清的一个策略是损耗血清自身蛋白的一部分，随后分析剩余的蛋白种类，见图6。为了尝试这种方法，从硅生产出一种纳米多孔基底。具有非对称表面的纳米多孔硅晶圆与合并的血清样品温浴。1.5小时温浴后，所述晶圆被除去且血清中的剩余蛋白接受MS评估，见图7。由表面增强的激光解吸电离(surface enhanced laserdesorption ionization(SELDI))质谱得出的新离子峰样式的出现，起因于分级技术。整个谱与单独的未分级血清相比，显示出明显的不同。在消耗实验的情况中，MS谱中的两个峰明显变化。当与原血清样品，即为分级的血清样品比较时，耗尽样品中8122m/z处的峰显著增强。另一方面，当与原血清样品中其主峰相比时，耗尽样品中8927m/z的峰显著降低。因此，温浴伴随随后除去纳米多孔颗粒改变了血清的谱质量，将谱中原先的小峰曲线增强至主要的强度区域。

    使用纳米多孔的孔受控玻璃进行分子收集
    作为测量消耗血清的蛋白质组信号的替代方案，开发出珠收集策略，以分离用于后续洗脱及分析的分子种类，见图8。不同孔径的(17nm对70nm)氨基丙基包被的玻璃珠与血清温浴，以进行选择性分子分离并释放。与血清温浴之后，这些珠子用水温和清洗，并且随后结合的分子用苛刻溶液(harsh solution)洗脱。洗脱的种类随后通过SEDLI MS分析，并与未分级的血清谱比较，见图9。与未处理的血清相比，对17nm珠洗脱物的直观检查揭示了独特的MS谱图图形。而且，当比较收集的样品与原(未处理)血清时，直观检查足以检测到在7762m/z处显著的差异。尽管8927m/z峰在正常血清的谱图中占优势，但7762m/z的峰在收集的子集中被认为是主导性的角色。
    为了评价纳米孔径在产生独特的谱信号中的作用，70nm孔径的孔受控的玻璃珠被用在相同的试验中。令人吃惊地，使用较大孔径的孔受控玻璃珠产生了明显不同的SELDI MS谱，见图10。在6629m/z处，一个新的主峰在从珠中洗脱出的谱样中占主导。正常的血清峰在相同的m/z处几乎不能分辨。相反地，正常血清中的8927峰在从较大孔珠上洗脱的蛋白种类中被认为是次要地位。
    要进一步表征从17nm孔径珠或70nm孔径珠上洗脱的分子组分的性质，每种样品中15μg蛋白在4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上电泳，接着用 Ruby Red染色，见图11。在整个分子量谱中，注意到两种类型珠子的洗脱物间明显的差异。这一发现与基于SELDI的分析中注意到的明显差异一致。通过一维电泳对洗脱物分子成分的分析提供了对珠子不同地分级血清中分子成分的进一步确认。
    为了进一步表征从17nm孔径珠和70nm孔径珠上洗脱物之间的性质，从SDS-PAGE凝胶中切下条带，并且用胰蛋白酶消化这些凝胶带中的蛋白质成分。产生的肽段用电喷射离子化质谱分析。在对谱数据进行调查之后，肽身份(peptide identity)被分配到该凝胶的蛋白质组的成分上，见图12。从70nm孔径大小的珠子的洗脱物中识别出25种肽，而从17nm-孔径大小的珠子的洗脱物中识别出13种肽。尽管识别出的肽种类有一些重叠(六种肽是共有的)，但是观察到了差异，这表明发生了明显的分级。因此，三种不同的分析表明具有不同孔径的玻璃珠提供了分离血清组分的方法。

    讨论
    使用质谱连同生物信息学数据挖掘方法的蛋白质组分析(proteomic profiling)，揭示了复杂且激动人心的信息档案，其被包含在循环蛋白质组的低分子量区域内，这可能含有重要的诊断信息。纳米多孔材料表面，如硅晶圆及孔受控的玻璃珠，提供了分离和操作体液中——诸如血清中所包含的低分子量生物信息的战略性的新方法。纳米多孔材料表面结合MS分析及生物信息查问的系统评估，能揭示带有增强的疾病检测性能的某些分级分离方案，识别扩充的用于病情检查的分子集合，并提供分子本身纯化、分离及肽/蛋白测序的容易且强大的方法。
    最后，本研究中使用纳米多孔材料表面进行血清分离能够导致谱图的显著改变、改变的1-D电泳分析结果及不同的序列标示。这些参数中的每一个都表明使用17nm孔径珠或70nm孔径珠产生了显著的、独特的分级。尽管ESI MS识别出的六种肽是使用任一类型的珠子收集的，但是有仅能用一种类型的珠子分离的独特的肽。被测序的肽包含高度丰富的血浆蛋白以及不太丰富的种类。例如，在70nm孔径的珠子中，分离出了被称为RNA聚合酶II转录调控因子第8亚基同源体介体的蛋白。在17nm孔径的珠子组分中，收集到了组蛋白4和高尔基自身抗原。这些非传统认识中的血清蛋白的分子种类的出现可能支持了如下假设：生物体蛋白的片段进入血清，并提供该生物体整体状况的一个潜在描绘。用70nm孔径大小的珠分离的一种蛋白，脱脂载脂蛋白A-1，最近被报道为卵巢癌的潜在标志(Zhang等，2004)。此外，在刚才提到的研究中，甲状腺素运载蛋白，也被报道为卵巢癌潜在标志，是用17nm孔径大小的珠收集的。
    增强从血液中获得生物标志物信息的特殊技术的使用，可能与在解剖病理诊断中使用特殊组织化学研究相类似。解剖病理学是症候学(semiology)，其鉴别是通过患病和正常组织标本间的差异分析产生的。疾病的标志是通过对常规染色的组织切片的大量的直观比较之后，以及通过新组织化学技术的应用之后发现的。后一种研究病理学/组织信息挖掘的方法有时成果丰富，以致促进了许多疾病和状况的递归重分类；因此，许多病理状况的诊断变得依赖于主要由组织化学特殊研究揭示的信息，见图13。尽管超越常规研究的特定组织分析——如H&E切片——不增加组织的信息目录种类(information content ofthe tissue)，但它能够显著地增加可获得信息，导致疾病分类和预后预测中的新改进，并为疾病起源和基础生物学提供额外的线索。
    血清及循环蛋白质组可以是高丰度和低丰度分子的混合物，这些分子具有携带重要的诊断信息的大多数生物标记，这些信息可能存在于该浓度范围的低丰度区域。临床蛋白质组学的一个挑战是；开发出在复杂的生物样品中快速识别出这些低丰度分子的工具。一种方法是开发液流通过表面(flow through surfaces)或消耗结构(depletionarchitectures)，以进行快速、有效(robust)且容易的分级和选择性纯化。纳米多孔材料可进行物理修饰(physicomodification)，借此不同的孔径及电荷特征可被加到孔表面。这些可分辨的特征能够允许对血清中蛋白分级的微调。此外，亲和蛋白可以被附加到材料表面，以进一步改善所述基底的分级性能。
    上述实验表明使用带有纳米多孔的材料表面进行血清分级可以产生明显改变的谱图，这表明了分级方法的效果。所述纳米多孔材料的一个用途是血清样品的收集设备。随着血清中作为生物标记的不稳定分子日益成为研究兴趣所在，可以开始标准化的收集流程。纳米多孔基底，能够提供一种以血清收集程序容易适用的形式螯合不稳定小分子的方法。在这种类型的应用中，专门的纳米多孔基底变得与专门的组织固定剂类似，所述固定剂根据选定情况而选择，以保存特定的组织属性，以便进行随后的分析和/或观察。
    因为硅可以被制造成微米尺寸的颗粒，纳米多孔基底可以在血细胞的大小范围内开发。这样的颗粒可以被设计成具有一定范围的孔径和其它物理化学性质，以分离充足的血清蛋白以及它们携带的低分子量载体(low molecular weight cargo)。作为附加的性质，所述微米尺寸的颗粒可以用识别标签编码，如金属标签或量子点(quantumdots)。这一策略能够允许血液被收集，并允许经历分选或富集处理从血细胞中分离颗粒，其与Bruchez等，1998；Han等，2001；Nicewarner-Pena等，2001中所描述的处理类似。
    本研究显示了：对于低分子量分子，基于纳米多孔的分离和纯化作为选择性分级、提纯和分析循环蛋白质组的一种方式方法的可行性。

    参考文献
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    实施例3
    本实施例中上标式引用，参见实施例3末的参考文献列表。

    概述
    血清/血浆蛋白质组中的低分子量区域(the low-molecularweight region of the serum/plasma proteome(LMWP))作为疾病诊断标记物的潜在来源正不断获得关注1-3。通过质谱(mass spectrometry(MS))进行血清LWM蛋白分析4通常依靠表面增强的激光解吸/电离飞行时间(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight(SELDI-TOF))5，这包括对先前对特定芯片表面吸附的被分析物的质谱分析6-9。但是，生物体液中存在的高分子量、丰富蛋白的干扰，会限制敏感性并可能影响分析的可重复性10。通过在MS分析前使用允许特定地捕获LMW多肽的设备来提高基于MS分析的选择性，能够将这种干扰减到最小。在这篇报告中，纳米多孔表面被用于选择性地从人血浆中捕获LMW肽(<15,000Da)。使用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desor ption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF))作为检测和评估结合分子的方法，对收集到的肽进行质谱分析(mass spectrometry(MS))。由于所述分析增强的选择性，实现了对人血浆中ng/mL浓度水平的小肽(<4,000Da)的检测。

    结果和讨论
    本研究工作的目的是开发出：基于尺寸排阻(size-exclusion)原理，分离体液中所含LMW肽的方法。要达到这一目标，具有合适孔隙率的纳米多孔表面被用于进行分子截留。通过用500nm厚的二氧化硅纳米多孔膜包被硅芯片，制成一种设备。使用Lorentz-Lorenz模型测定折射率，通过椭圆光度法(ellipsometry)确定所述膜的空隙率。估计的空隙率为57％。使用氮气吸附-解吸等温测量确定的膜的Brunauer-Emmett-Teller(布龙瑙尔-埃梅特-特勒BET)表面积为670m2/g。平均孔径约为7nm。图14显示了二氧化硅纳米多孔膜在透射电镜(Transmission Electron Microscopy(TEM))下的形态。
    所制备的芯片被用于从人血浆中收集LWM肽。用异丙醇和去离子水顺序清洗润湿所述纳米多孔表面后，一滴(5μL)人血浆直接滴加到所述芯片表面并随后温浴，以捕获肽/蛋白种类。用去离子水进行一系列顺序清洗之后，通过加入含有高百分比有机溶剂(50％v/v)的酸性MALDI基质溶液(α-氰基-4-羟基肉桂酸，α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)将结合的种类从所述表面上释放。一份1μL的提取液被置于MALDI盘上并用于MS分析。图15中，对使用纳米多孔硅表面与固体非纳米多孔二氧化硅的对照表面获得的MALDI-TOF谱之间进行比较。在前者中，检测到大约70种低分子量肽，包括人降血钙素，其在温浴血浆时已经被以1μg/mL的浓度掺入。与之相反，从所述对照组表面分析得到的MS谱中没有检测到肽。使用芥子酸——一种对大蛋白更特异的基质，对相同的纳米多孔样品进行了补充的MALDI-TOF分析。在这种情况下，尽管检测到了提取物中少量的白蛋白和若干其它丰富的血浆蛋白——它们将以另外的方式在MALDI-TOF谱中占主导，但是几乎所有MS信号都集中在小于15,000m/z的区域中。因此，15kDa是通过实际实验条件和所用表面的纳米孔隙率获得的大致截留质量值。
    尽管本发明不受理论限制，但是如图15所示，血浆中LMW肽的分离和检测可能是由于所述芯片表面的特定纳米尺寸的孔隙率。只有那些小到可以轻易穿过所述孔的分析物，能够被定量地吸附到所述芯片表面。因此，这一方法可被有选择地用于LMW的富集和分析。
    所述芯片表面对分析物的吸附需要足够强，以在捕获后抵抗温浴步骤过程中对芯片的大量冲洗。在这种具体的情况下，LMW分析物与存在于所述二氧化硅纳米多孔层上的硅醇基团的离子相互作用，是分析物结合的原因。
    为了要评估所产生谱图的可重复性，对相同的血浆样品进行了五次重复分析。所获得的MALDI-TOF谱显示在图16中，其中可以观察体会到LMW谱的可重复性。
    本方法的检测极限(detetion limit(DL))可通过向人血浆中以不同浓度加入可购买得到的肽，降血钙素，来进行估计。人降血钙素在分析前被掺杂进入血浆，以模拟体内的条件。该分析通过在所述纳米多孔二氧化硅表面温浴经过掺杂的血浆，以及随后的MALDI-TOF分析来进行。图17显示了对应于四种不同浓度水平，低至20ng/mL的降血钙素质子化分子(理论上m/z＝3421.0)的峰强度。相对于文献中11最近报道的使用类似方法的数据，这一浓度检测极限代表了显著的改善。
    具有最低降血钙素浓度——20ng/mL——的一滴掺杂血浆，含有降血钙素的绝对量为100pg(5μL加至所述纳米多孔表面)。考虑到1/3的提取溶液被置于MALDI盘上分析，MALDI-TOF检测的最大值为33pg降血钙素。这样的一个量对应于标准条件下(标准肽溶液与CHCA基质混合，1μL置于MALDI目标上进行分析)由MALDI-TOF分析的降血钙素的实际检测极限。这表明：即使在所分析的最低浓度下，大部分掺入的降血钙素被所述纳米多孔表面从血浆中有效地收集，并使其在LMW肽提取后能够用于MS检测。
    硅基纳米多孔表面也能够产生这样的分子截留。纳米多孔硅由电化学刻蚀制造，产生介观形态(mesoscopic topography)(纳米尺寸孔的膜，与纳米多孔二氧化硅类似，覆盖微小尺寸的硅腔)。所述纳米多孔硅在上述流程中已经被用作收集试剂，替代二氧化硅包被的芯片。由质谱观察到在强超量大蛋白白蛋白存在的情况下，两种低分子量标准肽的螯合。

    方法

    纳米多孔表面的制造
    所述纳米多孔氧化物膜按如下方法制备。8.71g表面活性剂EO106PO70EO106(普朗尼克(Pluronic)F127，BASF)被加入到23g乙醇中。接着，在激烈搅拌下，加入10g四乙基原硅酸盐(tetraethylorthosilicate(TEOS)，Aldrich)、0.1006g盐酸(20％)、10g乙醇和10.629g水的混合物18。室温下稳定3-6小时后，前体溶液以1900rpm被旋转包被(spin-coated)在所述硅晶圆上，达30s。旋转包被后，所述膜在100℃下烘烤12小时，随后在炉中，于400℃下烘烤2小时。

    样品准备
    所述芯片表面用异丙醇润湿。水洗后，来自健康志愿者的5μL人血浆(按照公开的准则19收集)在其同意并在机构审查委员会(Institutional Review Board)对人类受试者保护的监察下，加到所述芯片表面，并允许其在室温、100％的湿度下温浴30分钟。所述样品用移液器移出。之后，用每份5μL水将该表面顺序清洗5次，每次允许水滴在该表面上停留1分钟。最后一次清洗后，将在乙腈与0.1％四氟乙酸(TFA)(v/v)1:1混合物中含有3mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA，Sigma)的3μL MALDI基质溶液，用于提取结合到所述芯片表面的分析物。1μL提取物被置于MALDI样品盘上并在质谱分析前允许其干燥。

    质谱测定
    MALDI-TOF在配备有在337nm下发光的氮气激光的Voyager-DETM STR MALDI-TOF(Applied Biosystems)质谱仪上进行。使用700纳秒延迟提取时间和20kV加速电压，在线性正模式下获得谱。通常平均500-600张激光影像，以产生最终的样品谱图。
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    实施例4

    收集并靶向血管新生蛋白的蛋白质组纳米芯片
    本实施例中圆括号内的引用，参见实施例4末的参考文献列表。
    质谱(mass spectrometry(MS))是定性和定量辨别分子量小于20kDa的肽的强有力的技术。提到灵敏度，激光解吸质谱最近显示出能够检测到低渺摩尔(attamole)水平肽的灵敏度(7)。因此，原则上，MS允许使用仅几微升可用样品，对在溶液中以pg/mL水平存在的肽进行分析取数。检测人血清和组织中如此低水平的肽种类，代表了生物标记物发现的极其有力的工具。然而，这样水平的灵敏度还不能通过对人血清和组织的常规MS分析得到。这主要是由于MS分析有限的动态范围，其在最好的情况下能够在最大10,000倍过量的干扰种类，如其它蛋白/肽存在的条件下，检测到肽分析物。以mg/mL水平存在的高分子量载体蛋白的干扰，允许检测比量级最多低至3-4个数量级的浓度存在的肽，即在低μg/mL范围内存在的肽的检测。
    近期关注的焦点集中在人血清中低分子量蛋白质组(low-molecular weight proteomen(LMWP))作为诊断标志物的潜在来源(3，8-11)。使用MS分析血清和组织中以非常低的水平存在的LMWP意味着：广泛的样品分离对增强我们检测这一重要的信息来源的能力是必要的。一种降低待分析肽的复杂度的方法是分离整个蛋白质组中的具有特殊生理化学性质的一部分，例如，基于大小对肽进行分级分离。
    具有一定孔径和空隙率的纳米多孔二氧化硅/硅基表面允许血清样品中低分子量肽的吸附。使用带有确定性质的这样的表面产生分子截留或分子筛。因此几微升血清可以直接加到纳米多孔表面上，以收集LMWP。清洗所述纳米多孔表面后，结合的分析物可以被收集，并通过基质辅助的激光解吸电离时间飞行质谱(matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight(MALDI-TOF MS))曲线分析。由本方法提供的使用纳米多孔表面提高特定大小蛋白检测的灵敏度，允许研究血清和组织中以ng/mL浓度存在的LMWP。
    除了开发纳米多孔颗粒作为增强捕获和识别血清及肿瘤组织中存在的肽的灵敏度，本实施例关注开发并改善集成的二氧化硅/硅芯片以提高灵敏度。所述芯片的表面构建有若干形成样式的“活性”纳米多孔斑点，其分布在钝化、无孔、不吸附的芯片表面上。所述二氧化硅/硅芯片表面性质的修饰，允许被置于芯片上的5-10μL血清或组织提取物的样品中所含有的LMW肽在“斑点”区域吸附、浓缩和限制。在MS分析前，在最小体积(100-200nL)中提取结合的分析物能够增强灵敏度。而且，从具有所述纳米多孔点表面的芯片直接质谱电离，能够避免进一步的样品稀释。通过结合芯片上浓缩法(an on-chipup-concentration approach)与直接“斑点”电离，灵敏度上的提高能够超过现存的pg/mL范围的分析极限。
    在标准条件下(如1μL样品/基质溶液应用于目的物上)，仅有非常小部分产生的晶体被激光实际轰击，并用于获得MS数据(通常0.1-1％)。可通过调整所述芯片的表面性质，获得对表面上、预先浓缩的目的肽分析物的灵敏度的提高。硅芯片表面(silicon chip surfaces)可被构建，以便呈现若干形成样式的“活性”纳米多孔斑以及用于激光电离的无孔、钝化(因此是不吸附的)芯片表面。这样的方法允许被置于芯片上的5-10μL血清样品中含有的LMW肽在限定区域(即纳米多孔“斑点”)中吸附和浓缩，条件是初始的样品滴是以钝化表面包围的纳米多孔“斑点”为中心。MS分析之前，将结合的分析物以最小体积(100-200nL)提取，对增强分析物检测的灵敏度也是有利的。而且，从所述纳米多孔斑点表面直接质谱电离，能够避免进一步处理样品/用基质稀释。所述纳米多孔斑点的直径可以被限制，或者被i)在结合肽从所述纳米多孔表面提取并被置于MALDI样品台上的情况下，微量移液器能够操作的最小体积；ii)在试图从所述芯片直接电离的情况下，激光点的直径所限制。在第一种选择中，可以测试直径在0.5-1mm范围内的纳米多孔斑点，这要求提取溶液的体积在几百纳升的范围内。在第二种情况下，可以检测低至0.1-0.2mm斑点直径。结合芯片上浓缩和直接“斑点”电离，能够为血清或组织样品中LMWP分析中的分析物检测提供数量级(orders-of-magnitude)的灵敏度提高，并能够推动这些分析物的MS分析极限到ng/mL范围以下。

    试验方法
    纳米多孔表面的制造：所述纳米多孔氧化物膜按如下方法制备。8.71g表面活性剂EO106PO70EO106(普朗尼克()F127，BASF)被加入到23g乙醇中。接着，在激烈搅拌下加入10g四乙基原硅酸盐(tetraethylorthosilicate(TEOS)，Aldrich)、0.1006g盐酸(20％)、10g乙醇和10.629g水的混合物。室温下稳定3-6小时后，前体溶液以1900rpm被旋转涂布(spin-coated)在所述硅晶圆上，为时30s。旋转涂布后，所述薄膜在100℃烘烤12小时，随后在炉中400℃烘烤2小时。薄膜的厚度大致是500nm。估计的空隙率为57％且平均孔径约为7nm。使用氮气吸附-解吸等温测量确定的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积，估计为670m2/g。
    蛋白质组芯片的制备：硅芯片制备的过程包括4个光刻法步骤和1次使用软接触的表面处理。标准清洁步骤后，激光斑点区域被设计并用活性离子刻蚀法(Reactive Ion Etching，RIE，LamCl2:He＝180:440sccm 100W 300mT)进行刻蚀。10nm/50nm的薄钛/金层用e-束挥发器(Denton Vaccum，电流100mA，沉积率0.1nm/min)沉积，并通过光致抗蚀剂(photoresist)的起离过程而被形成图案。所述纳米多孔表面使用前面章节所述的流程进行旋转涂布，并在400℃退火。所述纳米多孔表面由光刻法界定，并用缓冲氧化刻蚀剂进行刻蚀。所述芯片的点样孔用极具负电荷的，光敏电阻SU-8(来自MicroChemInc)制造。暴露、烘烤、暴露后烘烤以及用制造商建议的流程发展后，形成了25μm的SU-8微结构。氧等离子体(MicroRIE 100W，O2 100sscm)用于聚乙二醇(PEG)处理前的清洁。PEG在预先浓缩步骤中用于降低无孔硅表面上蛋白的吸附。该晶圆在含有三乙基胺和四氯化硅添加剂的1％PEG(Mw1000Da，在甲苯中)中沾湿，以在二氧化硅表面形成共价键。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS，Dow Corning)在具有浮雕图案(pattern relief)的模具中被浇筑成弹性体印章(elastometricstamp)。该印章在5％的氯(二甲基)十八烷基硅烷的甲苯溶液中浸湿，干燥，并与所述基底接触。50℃加热过夜并移除该印章。线性十八烷基碳氢链(C18)为激光斑点区域提供了优良的结合能力。
    表面修饰：所述芯片由单独的孔组成，每个孔具有两个具有特定表面组成的不同区域。所述表面在氧等离子体(O2 100sccm，50W)中被羟基化。通过用异丙醇(IPA)中的0.5％v/v3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)在室温下硅烷化30分钟，将正电荷、氨基引入该表面。负电荷、硫基用IPA中的0.5％v/v3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)和0.5％v/v H2O覆盖于该表面。亲水的羟基用含有三乙基胺和四氯化硅添加剂的1％聚乙二醇(PEG)处理。疏水表面由5％氯(二甲基)十八烷基硅烷(C18)衍生化的(derivatized)。硅烷化后，该颗粒可通过溶剂中清洗5次，并在110℃干燥2小时。物理的(电荷)和官能团可以被测量。例如，APTES处理的表面上的电荷量可通过ζ电势的测量来测定，而功能化的氨基密度可通过Fmoc法，用例如0.4ml哌啶、0.4ml DCM和1.6ml MeOH，进行测定。未处理的和疏水的纳米多孔表面都可以被用作对照组，来研究官能团对LMWP富集的贡献。
    重组蛋白的制备：由于这些实验是VEGF转录体在小鼠系统中不同表达的首次鉴定，VEGF144和VEGF205*的序列被克隆并确认。制备重组蛋白，来分析新鉴定的VEGF144和VEGF205*的剪接变异体的功能活性。
    低分子量蛋白的分级分离：所述芯片表面用异丙醇润湿。水洗后，5μL血清/肿瘤样品被加到所述芯片表面，并允许其在室温、100％的湿度下温浴30分钟。多余样品用微量移液器移除。之后，用每份5μL无菌、去离子、不含表面活性剂的HPLC级的水将该表面顺序清洗5次，每次允许水滴在该表面上停留1分钟。最后一次清洗后，将含有在乙腈与0.1％四氟乙酸(TFA)(v/v)1:1混合物中的3mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA，Sigma)的3μLMALDI基质溶液，用于提取结合到所述芯片表面的分析物。1μL提取物被置于MALDI样品盘上并在质谱分析前允许其干燥。
    质谱：MALDI-TOF在配备有发出337nm氮气激光的Voyager-DETM STR MALDI-TOF(Applied Biosystems)质谱仪上进行。使用700纳秒延迟提取时间和20kV加速电压在线性正模式下获得谱。通常对500-600张激光影像进行平均，以产生最终的样品谱图。
    蛋白测序研究：蛋白质分析：从17nm和70nm孔珠子得到的珠分级样品通过常规的Bradford分析测定，用200μg/mL到1mg/mL范围内的牛血清白蛋白(BSA)标准，在595nm、UV-VIS分光光度计Plus 384，Molecular Devices)上进行监测。
    1D凝胶分离和消化：每种珠分级样品15g和3μL原血清，在30μLLDS样品缓冲液中稀释并在95℃煮沸5分钟。该分级组分在1D预制凝胶(4-12％Bis-tris)上电泳，以分离复合蛋白混合物的期望分子量区域。所述凝胶用ddH2O彻底清洗，在50％甲醇/10％醋酸溶液中固定30分钟，用红色染料染色过夜，并在紫外激发和观察之前在ddH2O中脱色3小时。该凝胶被切成1mm2的胶块并且所述凝胶条带在50％的甲醇中脱色。凝胶条带用10mM二硫苏糖醇和55mM碘乙酰胺还原并烷基化，在4℃的胰蛋白酶(20ng/μL)中温浴1小时，并允许在37℃的25mM NH4HCO3中消化过夜(16小时)。第二天早晨，用70％ACN/5％甲酸溶液反复温浴，将蛋白从凝胶中提取出来。
    LC/MS/MS分析：所述样品被冻干至接近干燥，并在6.5μL的HPLC缓冲液A(95％H2O，5％ACN，0.1％FA)中重建，以用于质谱分析。用与带有改进型纳米喷射源的ThermoFinnigan LCQ经典离子阱质谱(San Jose，CA)在线连接的Dionex的LC Packings液相色谱系统，进行微毛细管反相LC/MS/MS分析。反相分离用内部的，充满浆体的毛细管柱进行。C18二氧化硅结合柱的内径为75μm，外径为360μm，是充满带有300埃孔的5μm珠子的10cm长熔融石英(Vydac，Hesperia，CA)。一个5mm的μ-前置柱PepMap，C18柱体(cartridge)(Dionex)发挥脱盐柱的功能。样品以μL拾取模式注入，并在线性梯度洗脱之前用缓冲液A洗5分钟，线性梯度洗脱使用浓度达85％的缓冲液B(95％ACN/5％H2O/0.1％甲酸)，在200nL/分钟的流速下洗脱95分钟。全面的MS扫描之后，是四次对最丰富肽离子的MS/MS扫描(以数据依赖模式)，并且碰撞诱导解离(collision induced dissociation(CID))在38％的碰撞能量下进行，离子喷射电压设置在2.00kV，毛细管电压和温度分别为22.80V和180℃。
    数据分析：数据分析通过Sequest Biowork Browser(ThermoFinnigan)在欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticsInstitute)的非冗余蛋白质组的Swiss-Prot、TrEMBL和Ensembl条目搜索MS/MS谱来进行。在过滤掉相关分数(见表2)并手工检查MS/MS数据后，肽被认为是合理击中。用于过滤数据的条件至少与大多数文献引用的一样严格。

    表2

    电荷      Xcorr        DeltaCN     离子        Rsp

    +1     >1.9     >0.1      >50％＝1

    +2     >2.5     >0.1      >50％＝1

    +3     >3.5     >0.1      >50％＝1
    可接受的肽击中，相对于数据库中所有其它的肽需要具有Xcorr评定＝1。
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    实施例5

    用于收获蛋白水解片段的纳米多孔颗粒
    发展利用纳米技术和质谱法(MS)相结合的方法，能对在乳癌患者的血清中存在的低分子重量的蛋白质组(low-molecular weightproteome(LMWP)；<20kDa或<15kDa)中的熟知的和新的蛋白质进行快速地识别抱有希望。这样任务的挑战能降低更大血清载体蛋白质的掩蔽效应，例如白蛋白的掩蔽效应，而增加更低分子量的浓度，更低的丰度蛋白(lower abundance protein)——其作为个体患者对于不同类型治疗的反应的预测或评价的预报因子(predictors)，对于发现和诊断疾病例如乳癌是有用的。在这些研究中，发展了基于纳米结构二氧化硅/硅的芯片，其具有特定的孔尺寸和特定的表面特征，例如或者是正电荷，或者是负电荷或疏水特征，其能增强在不同分子量范围内的蛋白质的差别性吸附，这些蛋白质存在于从携带有人乳癌瘤异种移植物的裸小鼠所分离的血清中。血清从人MCF-7/环加氧酶-2(MCF-7/Cox-2)乳癌瘤异种移植物被分离，与MCF-7/载体对照细胞相比较，其产生50-倍更高水平的前列腺素E2(PGE2)和5-倍增加的雌二醇水平。MCF-7/Cox-2人乳腺肿瘤细胞被注射到雌性、8-10周大小的、切除卵巢的裸小鼠的乳腺脂肪垫中，裸小鼠被植入β-雌二醇的持续释放颗粒。在肿瘤细胞注射后的第15天、第28天、第42天、和第60天，血液通过心脏穿刺被分离，并被处理成分离的血液样品，在纳米芯片上洗脱，其随后与基质辅助激光解吸电离飞行时间蛋白质组分析和质谱/微量测序(MS/MS)联合。在相同的时间点，乳腺肿瘤异种移植物被测量，并且被分离用于蛋白质组分析以及用于组织学评估。这些研究证明了在联合MS方法中具有特定表面特征的二氧化硅/硅纳米芯片的效用，其可以对携带有人乳腺肿瘤异体移植物的小鼠的血清中的低分子量蛋白质，提供可重复的和灵敏的谱图象，以及用于对由乳腺肿瘤在它们早期的发展、侵入、和转移过程中所产生的蛋白质的灵敏检测。至此，在从带有人肿瘤异种移植物的小鼠分离而来的血清的LMWP中，已经识别79种独特的蛋白质。

    实验设计和方法
    依据下面用于肿瘤发展而建立的程序表，从小鼠中收集测试动物血液(TEST ANIMALS Blood)。
    样品包括：

    15只对照小鼠——0.8-1.5ml血液(0.4-0.75ml血清)

    15只携带有人乳腺肿瘤异种移植物28天的小鼠——0.8-1.5ml血液(0.4-0.74ml血清)

    15只携带有人乳腺肿瘤异种移植物42天的小鼠——0.8-1.5ml血液(0.4-0.74ml血清)

    15只携带有人乳腺肿瘤异种移植物60天的小鼠——0.8-1.5ml血液(0.4-0.74ml血清)
    所有的分析可以在从血液样品中取得的血清上进行。

    血清收集和贮藏
    血液可以通过心脏穿刺取得并被收集到红色盖子的试管中，在4℃时凝固2小时，并移走凝块。
    在离心之后，来自每个小鼠的血清可以被收集并被等分分装到冷冻管(cryoviles)中，如下储存在-80℃中。从每个时间点的小鼠，随意地被分成三组A，B，C，每组包含5只小鼠。在血清收集之后，在A组(A1，A2，A3，A4，A5)中，从每只老鼠收集的相同体积的血清被合并，并且以100μl等份试样被储存。在B组和C组的动物中，一组相似的样品可以被收集。从组A、B、C中混合的血清，可以被用于分析和与纳米珠温育。所有的分析可以在从冷冻原料直接解冻的样品上进行，经历第二次或重复冷冻解冻循环的样品不能被认为是这些研究的组成部分。

    样品分配和加工
    收集的400μl合并血清可以被用于实验。剩余的混合血清被储存在-80℃中，并用于后续的分析。

    样品贮藏
    在离心之后，来自每个小鼠的血清可以被收集并被整分分配到冷冻管中，如下储存在-80℃中。所有的分析可以在从冷冻原料直接解冻的样品上进行。指定用于加工和分析的血清样品可以在干冰上运送。

    用纳米多孔珠进行温育(MW截留值16kDa)
    等份试样的原血清(20μl)可以被解冻，并通过加入80μl的去离子水(1：5)(总的样品体积100μl)而被稀释。稀释的血清，可以在室温下与1毫克的纳米珠温育一个小时，纳米珠用去离子水预洗4次，(在温育过程中，就珠悬浮液而言，样品可以被监控；并且如有需要，在温育过程中，每隔15分钟，纳米珠可以在稀释的血清中被重新悬浮)。在温育之后，珠可以通过台式微量离心(30秒，10,000rpm)从血清中被分离，经过珠消耗的稀释血清可以被移走，用于分析和/或在-80℃中储存；并且珠可以用100μl的在去离子水中的0.1％TFA冲洗3次(在常温下，每次5分钟)。在最后冲洗之后，珠可以在常温下用80μl的乙腈/0.1％TFA(75：25)温育30分钟；并且移出洗脱物，等份分装，并且储存在-80℃下。对于每种被检查的不同的纳米珠，可以进行这个过程。
    收集的每个血清样品可以用一共12种的不同纳米珠制备物进行温育，纳米珠包括：具有7nm或20nm孔尺寸的颗粒；具有不同化学氧化物，NH2，PEG-NHS的颗粒；和具有直径为5μm或20μm的颗粒。具有完整系列的纳米珠的单一血清样品的完整的分析，可需要大约300μl的血清(12珠×25μl血清/温育)。

    样品的SELDI分析
    对于每个合并的血清样品，可以取得SELDI-TOF质谱图，并且可以与纳米珠消耗的血清(nanobead depleted serum)和纳米珠洗出液的谱图相比较。弱阳离子交换芯片(WCX2蛋白质芯片，CiphergenBiosystems，Inc)，可以被用于取得结合蛋白质的图像(profiles)。芯片可以如以下所述被加工。在室温(room temperature(RT))下，放置在生物反应器中的芯片，可以用100μl的10mM HCl温育5分钟。在吸去HCl之后，在室温下，用100μl的去离子水冲洗芯片斑点二次，每次一分钟。芯片随后在含有0.1％Triton X-100的100μl的10mM醋酸铵中被温育二次，每次5分钟。最后的醋酸铵漂洗液被吸走，并且使芯片干燥。5μl的样品随后被应用到芯片斑点上；并在室温下，在加湿箱中，温育55分钟。芯片用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次(每次150μl)，随后用150μl的去离子水作一次漂洗。干燥之后，在50％(v/v)乙腈中的1.0μl30％的肉桂酸，0.5％的三氟乙酸在每个斑点上被应用二次，在应用之间进行干燥。干燥之后，使用PBS-II质谱仪(CiphergenBiosystems，Inc)检验芯片。在同样条件下所取得的谱图，被用于比较的目的。使用下面的设备设置可以收集谱图：使用1800伏的检测器电压，6000道尔顿的焦点质量(focus mass)，20000道尔顿的上限，灵敏度增益设置为5，以及激光强度为145。在5个位置增量下，每个位置可以取得15个激光照片(laser shot)(范围从20到80)。

    在将与纳米珠温育之前的血清相似的5μl稀释的原血清(用1：5去离子水稀释)点样之后，还可以收集SELDI谱图，并且从用每种纳米珠温育之后的5μl稀释血清(纳米珠贫化(消耗)血清)收集SELDI谱图，以便直接比较珠子温育之前和之后的血清蛋白质峰的强度和轮廓形状。从相同体积的每种纳米珠洗出液(总计4μl)得到的SELDI光谱，可以与这些光谱相比较。

    珠洗出液的蛋白质分析
    使用标准的微型蛋白质试验(Bradford或BCA试验)，采用牛血清白蛋白(bovine serum albumin(BSA))作为蛋白质标准，可以确定纳米珠内的蛋白质浓度。

    1D凝胶分离
    在蛋白质测定后，样品可以通过1D凝胶分离被分析。15μg的每种纳米珠洗出液分级组分可以在30μl的SDS样品缓冲液器中被温育，并且在95℃下煮沸5分钟。使用预制凝胶(4-12％ Bis-Tris)，通过1D电泳法，这些分级组分随后可以被分离。在电泳之后，凝胶可以在去离子水中被冲洗，在50％甲醇/10％乙酸溶液中固定30分钟，并用红色染料进行染色过夜。在使用Versadoc 3000图像分析系统成像之前，凝胶可以在去离子水中进行去染色3小时。低于20KDa的凝胶区域可以被检测，并且使用BioRad凝胶斑点切胶系统取出选择带的中心部分。切割出的凝胶片被放置在96-孔复板中。凝胶片可以被转移到CCC Protemics Core(CCC蛋白质组学中心取样分析器)上进行处理，以及用于由LC/MS/MS进行的分析。

    LC/MS/MS
    凝胶片可以在50％甲醇/5％乙酸溶液中洗一个小时。在凝胶片在乙腈中被脱水之前，洗涤步骤可以重复一次。凝胶片可以在处于0.1M的碳酸氢铵中的10mM二硫苏糖醇(DTT)中再水合，并且在室温下还原0.5小时。移走DTT溶液，样品可以在室温下、用处于0.1M的碳酸氢铵中的50mM碘乙酰胺进行烷基化。移走碘乙酰胺试剂，凝胶碎片在5分钟增量中、在乙腈溶液中干燥之前，其可以用100mM碳酸氢铵冲洗。凝胶碎片在用乙腈脱水5分钟之前，可以在100mM碳酸氢铵中再次冲洗5分钟。凝胶可以被干燥5分钟。在加入20μl的50mM碳酸氢铵之前，通过将凝胶碎片在以20μg/mL存在于50mM碳酸氢铵中的25μl的测序级(sequencing grade)修饰胰蛋白酶中再水合10分钟，迫使蛋白酶进入凝胶碎片中。样品在40℃被温育6小时。形成的肽用50％的乙腈/5％甲酸的溶液冲洗二次，每次20分钟，从而从聚丙烯酰胺中被提取出来。这些提取物在干净的96-孔复板中被混合，并被干燥90分钟。
    毛细管-液相色谱-纳喷雾串联质谱法(Capillary-liquidchromatography-nanospray tandem mass spectrometry，Nano-LC/MS/MS)，可以在装配有以正离子方式运作的纳喷雾源的TgermoFinnigan LTQ质谱仪上进行。LC系统可以是来自LC-Packings A Dionex Co(sunnyvale，加利福尼亚州)的UltiMateTM Plus系统与Famous自动取样器和Switchos柱转换器。溶剂A可以是含有50mM乙酸的水以及溶剂B可以是乙腈。5微升的每种样品首先被注入到捕获柱(trappingcolumn)(LC-Packings A Dionex Co，Sunnyvale，加利福尼亚州)，并用50mM乙酸冲洗。注射器口可以被转换到注射，肽可以从捕获器洗脱离去，从而到达柱上。被直接安装在纳喷雾顶端的5厘米、75毫米的ID ProteoPepII C18柱(New Objective，Inc.Woburn，MA)可以被用于色谱分离。肽可以以300nl/min的流速，使用2-80％的B的梯度，直接地，从柱中被洗涤30分钟而离去，从而进入LTQ系统中。总计运行时间是58分钟。质谱仪的扫描序列可以被程序化设计成：一个完整的扫描，决定肽的电荷的图像放大扫描，以及在谱图上的最大量的丰富峰处的MS/MS扫描。动态排除(dynamic exclusion)可以被使用，用于排除相同肽的多重MS/MS。
    从MS/MS数据而来的序列信息，可以使用形成峰列表的MascotDistiller并使用BioWorks 3.1软件中的Turbo SEQUEST运算法则被处理。数据处理过程可以依照Molec.Cell.Proteomics知道进行。指配峰具有最小的10个计数(S/N为3)。前体离子的质量精确度可以被设为1.5道尔顿，以适应C13离子的附属选择；以及片段质量精确度可以被设为0.5道尔顿。考虑的修饰(变化)为甲硫氨酸氧化和脲基甲基半胱氨酸。

    实验结果

    I质谱法MALDI-TOF
    用于这些试验的是纳米多孔珠。
    可以使用的是4×12等份试样的二氧化硅珠(4种不同的表面化学特性：二氧化硅小的和大的孔洞，APTES和MPTMS小的孔洞)。

    MALDI-TOF分析方案
    萃取的肽与α-氰基-4-羟基苯乙烯酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA))溶液进行混合，该溶液是在50％(v/v)乙腈、0.1％TFA中的4mg/mL溶液。对于每个独立的试验，基质/样品的比率是特定的。1μl的样品/基质溶液被点在不锈钢MALDI目标盘中，并且空气干燥。在延时的萃取中，MALDI-TOF谱图可以在 STR质谱仪(应用生物系统(AppliedBiosystems)，Framingham，MA)上取得。线性正离子模式使用下面的设置：加速电压20000V，栅极电压91.5％，萃取延迟时间200纳秒，获得质量范围800-20000m/z，激光强度范围2100-2300。每个谱图为在100个连续照相系列中得到的400-1000个单个激光照相的平均值。外部设备调准使用标准的肽混合物(应用生物系统calimx 2+calimx 3)每日进行。线性的6-点校准被使用(大约分子量(approx.Mw)：1300、2090、3600、5700、8100、11000道尔顿)。

    用于MS MALDI斑点的方案的最优化
    三个不同的样品/基质比率被测试：(i)1：8；(ii)1：4；以及(iii)5：3。用200ng/mL的二种标准肽——肾素和降血钙素，对小鼠对照血清进行掺杂，并被分析。在图19中的三个谱图显示出5：3比率可能是最好的试验设置，考虑到下面的因素：(i)从小鼠血清而来的谱图中的可检测到的峰的数目；(ii)峰的总体绝对强度；和(iii)掺杂肽的信噪比(降血钙素和肾素)。
    目标在于灵敏度改进的一个可替代的方案也被测试。二氧化硅小孔珠被使用。在最后一次冲洗之后，4μl的MALDI基质溶液被加入到珠中，并且1.5μl的所得悬浮液被点滴到MALDI目标板上。相对于标准的经干燥的小滴制备物，所得到的MALDI-TOF谱图产生出众的信号强度。
    由于(i)存在于基质悬浮液中的珠子，可能影响基质结晶的均匀性，以及可能使测量的质量精确度变得更差；(ii)在质谱仪中引入二氧化硅颗粒，这可能由于这些颗粒在质谱仪内部(电压栅极等)的位置中的沉积，使伴随时间的一些性能损失，因此决定采用标准的萃取条件和5：3样品/基质比率，以便用于小鼠血清的随后分析。
    在本文下面，报道了用所描述的方法得到的对照小鼠血清的MALDI-TOF谱图。进行了二种不同的肽掺杂，以便具有附加的参考峰，从而用于与其它的MALDI样本相比较，例如，参考图20。来自降血钙素(100ng/mL，被掺杂在小鼠血清中)的信号强度比用标准的制备方法得到的信号强度更高。

    用纳米多孔珠温育对照血清样品
    采取下面的方案，用于小鼠血清分析。
    珠子预冲洗：4×100μl H2O。
    温育：在室温下，用1毫克的珠温育100μl的稀释血清，一小时。
    珠的冲洗：2×100μl H2O，随后在0.1％TFA中，用100μl冲洗一次。
    萃取：80μl的75/25CH3CN/0.1％TFA，在室温下温育30分钟。
    MALDI的制备：样品/基质比率为5:3.
    MALDI-TOF分析如在这个实施例中早期描述。
    在图21中所显示的谱图为在小鼠对照血清上、使用四种不同的珠取得的，(二氧化硅小的和大的孔，APTES小的孔以及MPTMS小的孔)。
    有关重复性的实验
    为评估珠制备物的重复性，小鼠对照血清的五份副本温育在使用5×大孔二氧化硅珠试剂盒条件下予以进行。对于每次温育的副本进行两次MALDI-TOF分析，产生10个谱图。自动地被峰采摘软件(应用生物系统(Applied Biosystems))所发现的28个最高强度峰——对于所有的10个谱图是共同的——被用于统计学分析。对有关总信号强度(峰高)标准化之后，标准化强度的变化系数被计算(28个峰，10个复制本)。结果在表3中报告，在一起的还有所取得的典型MS谱图。有关m/z测定的平均CV为0.02％。关于峰高的平均CV为21.8。
    表3二氧化硅珠LMWP收集和MS分析的十次复制试验(5次重复温育，两个重复的MALDI-TOF分析)的峰高。

     Peak m/zCV on m/zvaluePeak heightIn exp 1Peak heightI nex p2Peak heightin exp 3Peak heightIn exp 4Peak heightIn exp 5Peak heightIn exp 6Peak heightIn exp 7Peak heightIn exp 8Peak heightIn exp 9Peak heightIn exp 10Averagepeak heightCV value905.40.0549154152847039839347550246247647310.21061.60.04262328632768269628442738265531232168257127059.11823.20.0227728935332038338441137351953338422.51979.50.022260189724962625329032932972274028052655270316.02082.40.0237347330829764460547459530033244031.12482.50.02514472617479856765696718.62640.20.01403851473133423641374015.42707.90.02625159685244594846405317.0275550.0215015316715911813417212614713214612.1282250.01312945383740423646403814.43413.60.013193222732751721952121673453042582573497.90.011371411181217486837614211610924.93581.10.02554981724848686071596118.83907.30.02413946427069554684765728.94040.60.02897671675149595566506320.34061.80.0268861551164141041854444646040251320.34069.10.0226625023127313414519718917814420125.94104.80.021751601271331071207210612010412224.04283.80.0230303430272631252829298.04360.90.02243040292326362841373121.24533.20.02918154554445474747455630.06785.50.03363854382628312866564034.76827.80.0240046739936422327630122657956338033.76996.20.021481741651347987968021819913837.0812550.0387786670774948547465460372369668320.08212.20.021801951541271021086711015615813629.18571.10.03323140322426282936363115.89069.60.03546048393031323340414125.4

    Peakm/z：峰m/z；CV on m/v value：CV在m/v上的值；Peak Heightinexp 1：实施例1的峰高度；Peak Heightin exp2：实施例2的峰高度；PeakHeightin exp 3：实施例3的峰高度；Peak Heightin exp：实施例4的峰高度；Peak Heightin exp 5：实施例5的峰高度；Peak Heightin exp 6：实施例6的峰高度；Peak Heightin exp 7：实施例7的峰高度；Peak Heightinexp 8：实施例8的峰高度；Peak Heightin exp 9：实施例9的峰高度；Peak Heightin exp 10：实施例10的峰高度；Average peak height：平均峰高度；CV value：CV值

    II质谱SELDI
    来自负载有肿瘤的动物的血清的处理：如下面所述，从12组动物中提供混合血清的样品：

    1.对照混合血清A

    2.对照混合血清B

    3.对照混合血清C

    4.第28天的患瘤血清(从MCF7细胞的克隆8衍生的肿瘤)

    5.第28天的患瘤血清(从MCF7细胞的克隆10衍生的肿瘤)

    6.第42天的患瘤血清(从MCF7细胞的克隆8衍生的肿瘤)

    7.第42天的患瘤血清(从MCF7细胞的克隆10衍生的肿瘤)

    8.第60天的血清阴性对照(用基质胶(matrigel)注射的动物)

    9.第60天的患瘤血清对照1(从细胞系BT-474衍生的肿瘤)

    10.第60天的患瘤血清对照2(从基线MCF7细胞线衍生的肿瘤)

    11.第60天的患瘤血清(从MCF7细胞的克隆8衍生的肿瘤)

    12.第60天的患瘤血清(从MCF7细胞的克隆10衍生的肿瘤)
    6组珠子被用于与合并的血清样品进行温育。每组珠子包含12个单一的珠试剂盒，12个合并血清的每个用一个试剂盒。使用的每组珠子如下：

    组A.10μm直径，小孔，二氧化硅

    组B.10μm直径，小孔，APTES衍生化的，(+)电荷

    组C.10μm直径，小孔，APTES衍生化的，(-)电荷

    组D.10μm直径，大孔，二氧化硅

    组E.10μm直径，大孔，APTES衍生化的，(+)电荷

    组F.10μm直径，大孔，APTES衍生化的，(-)电荷

    [217]血清样品与如下的珠试剂盒温育。在用血清温育之前，所有的珠试剂盒首先在HPLC级水中被冲洗4次。血清样品被解冻并用HPLC级水稀释1：5，并且在室温下，100μl的稀释血清与珠试剂盒温育1小时。例如，上述的100μl的稀释血清样品1(合并的对照血清A)，与六组珠子类型A到F中的每一组一起进行温育，分别产生样品1到6(参看表4)。相似地，每一个存留的12组血清样品也与独立的珠子组温育，产生一共72个样品(参看表4)。
    在与血清温育之后，珠被沉淀下来，并且移出经过消耗的血清(depleted serum)。随后在室温下、在0.1％TFA/乙腈(25：75)中洗脱珠子之前，将珠子在HPLC级水中冲洗2次，以及在0.1％TFA中冲洗1次。最终的洗出液(～80μl)被收集(一共72个样品，参看表4)并且被保存在-80℃下，直到进一步的处理。

    表4 珠样品和洗出液的关键字(样品号)
    在温育5天之后，洗出液被解冻；并且移出60μl的洗出液，并且在SpeedVav中浓缩到大约25μl的总体积，用于1D凝胶分析。浓缩洗出液和存留的原始洗出液样品均被存储在-80℃下，直到接受进一步处理，分别用于1D凝胶分析和SELDI分析。
    所有的浓缩珠洗出液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，并且在8-16％Tris-甘氨酸梯度凝胶上分离并用Sypro ruby染色。在脱色之后，使用BioRadVersadoc系统给凝胶成像。在图22到图30中呈现了凝胶结果。

    用于串联质谱的洗出液凝胶蛋白质带切除物
    珠洗出液的1D SDS-PAGE凝胶显示了相似的蛋白质成带带型(protein banding patterns)，参看图22-27。与来自三个对照动物样品的合并血清相比较，凝胶的分析没有揭示任何新的蛋白质带，其归属于来自患瘤动物的血清。也注意到，蛋白质加载量从样品到样品有所变化，其中一些个别泳道包含明显更高量的蛋白质(参看凝胶6，泳道8(表4中的样品42)。基于这些结果，90个带被识别，用于切割和提交，并采用串联质谱进行鉴定。
    凝胶6——其分离从大孔MPTMS珠中所取得的洗出液样品，被选择出，用于作最完全分析。四个低分子量的带被从每个泳道中切割出来，以决定是否带的蛋白质组成随珠子而变化，并且所有的主要带存在于泳道8中(样品号42对应于从第42天的克隆10肿瘤荷载动物中所收集的合并血清)。另外的低分子量带切割自凝胶4，大孔APTES修饰珠，泳道12和13，其分别对应于从克隆8和克隆10的第60天肿瘤荷载动物所收集的合并血清。最后，按照从凝胶的上部到下部，从凝胶5的泳道6中切割出附加带，其对应于从小孔MPTMS珠所取得的洗出液，样品号27(从第28天克隆10动物收集的血清)。带被识别，并且使用BioRad Gel切割机器人(BioRad Gel cutting robot)切割。切割下来的样品被放置在96孔的微量滴定板的孔中，并被传送至CCIC蛋白质组学取芯器，用于串联质谱。凝胶切割的模式显示在图28、29和30中，连同表4中的索引。
    从这些样品的串联质谱分析中取得的蛋白质鉴定结果，通过CCIC蛋白质组学取芯器在这个实施例的其它地方中予以报道。

    合并血清的SELDI分析
    合并血清样品从-80℃储存中被移出，融解，并且150μl等份试样的原血清被移出，通过加入600μl的HPLC级水稀释以产生储存的1∶5稀释的血清样品。25μl的稀释原血清被移出，在液氮中快速冷冻，并被放入-80℃中储存直到用于SELDI分析的处理。WCX2芯片被填充到生物反应器中，并且在室温下，将样品斑点用100μl的10mMHCl冲洗5分钟。溶液被吸出，斑点用100μlHPLC级水冲洗2次，每次漂洗1分钟。斑点随后用100μl的10mM醋酸铵+0.1％Triton X-100冲洗2次，每次漂洗5分钟。在最后的缓冲液被吸出之后，WCX2芯片被从生物反应器(Bioreactor)中移出，并且在室温下空气干燥。干燥的WCX2芯片被放入生物反应器中并且5μl的稀释血清样品被加入到样品斑点中，并且在室温下，芯片在潮湿室中温育55分钟。在与血清样品温育55分钟后，WCX2芯片斑点用150μl的PBS冲洗3次。每个斑点随后用150μl的HPLC级水漂洗，以及从生物反应器中移出芯片，并在室温下进行空气干燥。基质(处于50％乙腈和0.5％TFA中的1μl α-CHCA)被施加用于每个斑点，并被干燥。基质应用被重复，并且芯片在PBSII SELDI质谱仪中被分析。得到的SELDI谱图在图31到33中呈现。

    珠洗出液的SELDI分析
    从每个珠温育物中回收而来的洗出液材料，使用SELDIGoldChip进行检验。洗出液样品(1μl)被应用于芯片斑点中，并允许空气干燥。基质如上面所描述被加入；并且样品使用下面的设备参数被分析。在LMW范围中的洗出液AU芯片读出参数，与在用于WCX2芯片分析方案中所明示的一样。样品组如上面应用于1D SDS-PAGE梯度凝胶中的相同序列被分析。所有72个洗出物样品以被分析，并且取得两个谱图。

    珠洗出液的SELDI谱图的关键字
    样品号码，在谱图的右侧显示，是指代样品号码，对应于在表4中所呈现的那些号码。每个珠洗出液以双复制品被分析，如在谱图中用样品号X-1和样品号X-2所明确显示的那样。应用于个体的1D凝胶的每个组的样品，被应用于凝胶的序列而予以分析(参看图22到27)。因此，图34A、34B、和34c代表应用于凝胶1的洗出液样品的SELDI谱图(图22)；图35A、35B和35C代表应用于凝胶号码2的洗出液样品的SELDI谱图(图23)；图36A、36B和36C代表应用于凝胶号码3的洗出液样品的SELDI谱图(图24)；图37A、37B和37C代表应用于凝胶号码4的洗出液样品的SELDI谱图(图25)；图38A、38B和38C代表应用于凝胶号码5的洗出液样品的SELDI谱图(图26)；图39A、39B和39C代表应用于凝胶号码6的洗出液样品的SELDI谱图(图27)。

    III质谱法LC/MS(OSU CCIC)

    在凝胶消化和纳米LC/MS/MS蛋白质鉴定中。

    [227]来自1D SDS-PAGE的总计100个带被消化，并且用纳米LC/MS/MS分析。详细的结果在表5中被总结。从被检查的100个带中，识别出707种蛋白质。在它们之中，225个角蛋白(keratin)或角蛋白相关蛋白(keratin related proteins)被标识。胰蛋白酶被用于消化过程，因此，胰蛋白酶(trypsin)和胰蛋白酶相关蛋白(trypsin relatedproteins)也在样品中被标识，有总计145种胰蛋白酶或胰蛋白酶相关蛋白被鉴定出来。最后，溶菌酶被用作固有标准(internal standard)，以确保设备的性能；并且被鉴定80次(表6)。在除去对应于角蛋白、溶菌素和胰蛋白酶的匹配物之后，来自所鉴定的100个凝胶带中的显著蛋白质的总计数目为257。
    如表5中所示，大多数蛋白质在不同泳道/带中被多次发现。例如，血红蛋白β-1链在不同的泳道/带中被识别了几次。在对每种蛋白质ID(身份)仅仅计数一次之后，确定了154众独特蛋白质(参看表6)。在它们之中，64种被确定为角蛋白或角蛋白相关蛋白质，5种被确定为胰蛋白酶或胰蛋白酶相关蛋白质，以及6种被确定为溶菌酶。因此，79种独特血清蛋白质被明显地确认(表7)。
    按照制造商所推荐的方案，将凝胶用来自于Promega(Madison WI)的测序级胰蛋白酶进行消化，使用来自Millipore(Bedford MA)的Montage In-Gel Digestion Kit(Montage胶中消化试剂盒)。简而言之，带被尽可能整理到靠近状态，以使背景聚丙烯酰胺材料最小化；并切成2mm×mm碎片。凝胶碎片随后在50％甲醇/5％乙酸中冲洗一个小时。在凝胶碎片在乙腈中被去水合之前，冲洗步骤被重复一次。在加入处于100mM碳酸氢铵溶液中的15mg/ml碘乙酰胺之前，凝胶带被再次水合；并且，用二硫苏糖醇(dithiothertol(DTT))溶液(在100mM碳酸氢铵中的5mg/ml)温育30分钟。在移出之前，使碘乙酰胺和带在黑暗中温育30分钟。凝胶带再一次用乙腈和碳酸氢铵(100mM)的循环洗涤，以5分钟增量间距进行。在凝胶于速比韦克(speed vac)中被干燥之后，通过将它们在50μl的测序级改性胰蛋白酶中再水合10分钟，蛋白酶被送到凝胶碎片中，其中测序级改性胰蛋白酶以20μg/mL存在于50mM的碳酸氢铵中。20μl的50mM的碳酸氢铵随后被加入到凝胶带中，并且混合物在室温下被温育过夜。从聚丙烯酰胺凝胶碎片，用50％的乙腈和5％的甲酸萃取几次肽，并且合并在一起。萃取的混合物在速比韦克中被浓缩到大约25μl，以用于纳米LC/MS/MS分析。
    毛细管-液相色谱-纳喷雾串联质谱法

    (capillary-liquid chromatography-nanospray tandem mass spectrometry(Nano-LC/MS/MS))可以在装配有纳喷雾源的TgermoFinnigan LTQ质谱仪上进行，是以正离子方式运作的。LC系统可以是(LC-Packings ADionex Co，Sunnyvale，加利福尼亚州)的具有Famous自动取样器和Switchos柱转换器的UltiMateTM Plus系统。5微升的每种样品首先被注入到捕获柱(trapping column)(LC-Packings A Dionex Co，Sunnyvale，加利福尼亚州)，并用50mM乙酸冲洗。然后，注射器口可以被转换到注射，肽可以从该捕集获洗脱离去，而进入到柱中。5厘米、75微米的ID ProteoPep II C18柱(New Objective，Inc.Woburn，MA)可以被用于色谱分离。溶剂A是含有50mM乙酸的水以及溶剂B是乙腈。肽以300nl/min的流速，被直接地从该柱中洗涤离去，进入LTQ系统中。梯度以2％的B开始，并且，B在最初的3分钟保持在2％。随后B从3-30分钟增加到50％；并从30-45分钟进一步增加到80％。B保持在80％持续5分钟，然后在0.1分钟内变回到2％。随后，在下一次注射之前，柱用98％的A冲洗14.9分钟。总计运行时间为65分钟。质谱仪的扫描序列被编程，用于进行一个全扫描(full scan)和在谱图中对10个最丰富的肽峰的MS/MS扫描。在检测和进行肽的MS/MS3次之后，动态排除被用于排除同一肽的多重MS/MS。
    来自MS/MS数据的序列信息被处理，是使用Mascot Batch以形成峰值列表(peaklist)(.mgf文件)和通过使用MASCOT MS/MS搜索(MASCOT MS/MS search)进行的。数据处理；按照在Mole.Cell.Proteomics(分子生物学蛋白质组学)中的指导方针进行。指定的峰值具有最小的10个计数(S/N为3)。前体离子的质量精确度被设为1.8Da，以适应C13离子的偶然选择；以及，碎片质量精确度被设为0.5Da。被考虑的修饰(变化)是甲硫氨酸氧化作用和脲基甲基半胱氨酸。

     样品蛋白质身份(ID)分值Swiss-Prot登记号(Ascension)A1具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析234gi|2781269

     血红蛋白β182gi|229301血红蛋白β-1链[小鼠(Mus musculus)]176gi|1183932α-球蛋白[智人(Homo musculus)]74gi|28549A2角蛋白1[智人]545gi|17318569角蛋白10[智人]534gi|40354192血红蛋白β-1链[小鼠]499gi|1183932血红蛋白β-2链[小鼠]297gi|1183933α-球蛋白[小鼠]279gi|49900具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析235gi|2781269预测：与角蛋白6irs异构体12相似[犬科]209gi|73996330角蛋白6B[智人]162gi|21961227β-球蛋白链[智人]141gi|66473265血小板因子4[小鼠]87gi|13560695膜结合转录调节子LytR[蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987]56gi|42784428A3血红蛋白β-1链[小鼠]509gi|1183932角蛋白1[智人]500gi|17318569血红蛋白β-2链[小鼠]348gi|1183933预测：与角蛋白1；角蛋白-1；细胞角蛋白-1；头发α蛋白质相似[黑猩猩(Pan troglodytes)]265gi|55638031角蛋白10[家兔(Oryctolagus cuniculus)]258gi|87045985具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析197gi|2781269预测：与角蛋白6irs异构体12相似[犬科]172gi|73996330α-球蛋白[小鼠]171gi|49900胰蛋白酶前体169gi|136429血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)(β-球蛋白)165gi|122643β-球蛋白链[智人]157gi|66473265胰蛋白酶原10[小鼠]71gi|2358087细胞角蛋白9[智人]66gi|435476A4胰蛋白酶前体211gi|136429角蛋白1，型II，细胞骨架的-人类112gi|7428712α-球蛋白[智人]98gi|28549溶菌酶96gi|229157细胞角蛋白9[智人]72gi|435476血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)(β-球蛋白)58gi|122606A5血红蛋白β-1链[小鼠]515gi|1183932血红蛋白β-2链[小鼠]351gi|1183933胰蛋白酶前体265gi|136429α-球蛋白[智人]147gi|28549

     表皮细胞角蛋白2[智人]75gi|181402溶菌酶65gi|229157A6血红蛋白β-1链[小鼠]399gi|1183932角蛋白1[智人]370gi|7331218胰蛋白酶前体263gi|136429α-球蛋白[小鼠]213gi|49900角蛋白10[智人]192gi|40354192溶菌酶67gi|229157胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087A7铁传递蛋白[小鼠]304gi|17046471角蛋白1[智人]244gi|17318569内α-胰蛋白酶抑制剂，重链4[小鼠]201gi|9055252胰蛋白酶前体162gi|136429凝溶胶蛋白，胞浆-小鼠112gi|90508富组氨酸醣蛋白[小鼠]111gi|11066003硫氧还蛋白[大肠埃希氏菌(Escherichia coli)]98gi|148071脱脂载脂蛋白A-I前体-小鼠61gi|109571α-甲胎蛋白53gi|191765A8细胞角蛋白9[智人]1282gi|435476角蛋白1[智人]1235gi|7331218链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物294gi|3318722预测：类似于角蛋白6irs异构体12[犬科]288gi|73996330角蛋白10[智人]219gi|40354192表皮角蛋白亚基II130gi|293686脱脂载脂蛋白A-I前体-小鼠112gi|109571溶菌酶97gi|229157胰蛋白酶原7[小鼠]61gi|2358072短链脱氢酶/还原酶SDR[伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.).383]59gi|77965219A9血红蛋白β-1链[小鼠]469gi|1183932血红蛋白β-2链[小鼠]448gi|1183933角蛋白1[智人]293gi|17318569α-球蛋白[小鼠]256gi|49900胰蛋白酶前体208gi|136429预测：与角蛋白6irs异构体12相似[犬类]168gi|73996330具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析103gi|2781269角蛋白10[智人]87gi|40354192膜结合转录调节子LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]59gi|42784428A10角蛋白1[智人]223gi|17318569具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析218gi|2781269胰蛋白酶前体115gi|136429溶菌酶C(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶C)94gi|47117006A11型I角蛋白16；K16[智人]1301gi|1195531角蛋白14[智人]1134gi|17512236角蛋白型II492gi|386849角蛋白6B[智人]435gi|21961227

     角蛋白1[智人]367gi|7331218角蛋白5[智人]349gi|4557890预测：与角蛋白6irs异构体12相似[犬类]257gi|73996330预测：与角蛋白15相似[牛]209gi|61813798胰蛋白酶前体179gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析149gi|2781269预测：与角蛋白8相似型II细胞骨架-人体[黑猩猩]90gi|55638407细胞角蛋白9[智人]88gi|435476胰蛋白酶10[小鼠]66gi|2358087A12具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析204gi|2781269胰岛素前体178gi|136429表皮细胞角蛋白2[智人]72gi|181402胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087B1胰蛋白酶前体180gi|136429脱脂载脂蛋白C-III小鼠]129gi|15421856具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析111gi|2781269补体成分C3前体97gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]54gi|2358087B2角蛋白1[智人]195gi|17318569胰蛋白酶前体176gi|136429脱脂载脂蛋白C-III小鼠]124gi|15421856具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析99gi|2781269补体成分C3前体72gi|192392胰蛋白酶原7[小鼠]67gi|2358072胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087B3胰蛋白酶前体275gi|136429脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]129gi|15421856具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析123gi|2781269补体成分C3前体76gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087B4胰蛋白酶前体265gi|136429脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]125gi|15421856溶菌酶74gi|229157补体成分C3前体71gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087B5胰蛋白酶前体212gi|136429脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]120gi|15421856补体成分C3前体75gi|192392溶菌酶72gi|229157胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087B6胰蛋白酶前体176gi|136429角蛋白1，型II，细胞骨架-人体142gi|7428712脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]122gi|15421856具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析95gi|2781269补体成分C3前体88gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087B7白蛋白1[小鼠]1536gi|29612571角蛋白1[智人]1518gi|17318569细胞角蛋白9[智人]649gi|435476

     胰蛋白酶前体272gi|136429预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]259gi|73996330补体成分C3前体(HSE-MSF)[包括：补体C3 β链；补体C3α链；C99gi|1352102胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087假定蛋白质SAV6338[阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)MA-4680]62gi|29832880B8角蛋白1[智人]913gi|17318569角蛋白10[智人]592gi|40354192细胞角蛋白9[智人]390gi|435476血红蛋白β-1链[小鼠]350gi|1183932血红蛋白，β成人主链[小鼠]349gi|31982300预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]271gi|73996330胰蛋白酶前体263gi|136429预测：与血红蛋白相似，型II细胞骨架5(细胞角蛋白5)(K5)(CK 5)(58kDa细胞角蛋白262gi|73996312具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析260gi|2781269型I角蛋白16；K16[智人]252gi|1195531预测：与角蛋白1异构体2相似[牛]243gi|76617876血红蛋白β-2链[小鼠]217gi|1183933α-球蛋白[小鼠]152gi|49900抑制蛋白1[小鼠]111gi|56206029预测：与胰蛋白酶原7异构体4相似[犬类]102gi|73978531胱蛋白C前体[小鼠]98gi|11762010转甲状腺素蛋白[小鼠]95gi|56541070型I角蛋白10[肺鱼]85gi|57335414小白蛋白[小鼠]77gi|509139溶菌酶73gi|841217Flp菌毛装配蛋白质CpaB家族[伯克氏菌属E264]57gi|83719123血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)β(-球蛋白)55gi|122643B9角蛋白10[智人]1068gi|40354192角蛋白1[智人]926gi|7331218表皮细胞角蛋白9[智人]700gi|181402细胞角蛋白9[智人]551gi|435476预测：与角蛋白6胰岛素受体底物相似[黑猩猩]435gi|55638029预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]319gi|73996330胰蛋白酶前体237gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析230gi|2781269脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]129gi|15421856补体成分C3前体89gi|192392型I角蛋白10[肺鱼]83gi|57335414角蛋白19[智人]71gi|7594734胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087腺苷酸激酶[华支睾吸虫]59gi|22652628非共生性血红蛋白[Alnus firma]58gi|84993584B10角蛋白1[智人]1448gi|17318569细胞角蛋白9[智人]1294gi|435476角蛋白6A[智人]653gi|14250682角蛋白10[智人]568gi|40354192

     预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架14(细胞角蛋白14)(K14)(CK14)异构体3[Bos445gi|76649703预测：与角蛋白6胰岛素受体底物相似[黑猩猩]410gi|55638029预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]399gi|73996330型I角蛋白16；K16[智人]377gi|1195531表皮角蛋白亚基II347gi|293686角蛋白复合物，酸性的，基因14[小鼠]311gi|21489935胰岛素前体118gi|136429预测：与胰蛋白酶原7异构体4相似[犬类]108gi|73978531具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析94gi|2781269型IIα-角蛋白IIB[红色野鸡(Gallus gallus)]89gi|46399075预测：与角蛋白相似，型II细胞骨架8(细胞角蛋白8)(细胞角蛋白内A)[褐家鼠]87gi|62657929胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087短链脱氢酶/还原酶SDR[伯克霍尔德菌383]66gi|77965219B11补体C3前体(HSE-MSF)[包含：补体C3 β链；补体C3 α链；C358gi|1352102链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物291gi|3318722具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析216gi|2781269角蛋白1型II，细胞骨架-人175gi|7428712角蛋白15[智人]166gi|30583361硫氧还蛋白[大肠杆菌]69gi|148071胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087B12角蛋白10[智人]872gi|40354192角蛋白1[智人]827gi|17318569角蛋白6A[智人]632gi|14250682角蛋白17[智人]516gi|48735384细胞角蛋白9[智人]465gi|435476预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架14(细胞角蛋白14)(K14)(CK14)异构体3[Bos444gi|76649703角蛋白437gi|386848角蛋白K5390gi|386850预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]310gi|73996330角蛋白型16283gi|186685胰蛋白酶前体275gi|136429钙调素-类似物5[智人]195gi|55859601预测：与角蛋白17相似[黑猩猩]184gi|55644941型I角蛋白10[肺角]84gi|57335414预测：与角蛋白相似，型II细胞骨架8(细胞角蛋白8)(CK8)(Keraton-8)(K8)[Homo]80gi|88988823甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶[智人]62gi|31645假定蛋白质FG03380.1[玉蜀黍赤昌(PH-1)]57gi|46115076C1链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物193gi|3318722血小板碱性蛋白质[小鼠]156gi|13560694预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]110gi|73996330脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]99gi|21618837泛素85gi|223061C2角蛋白10[家兔]288gi|87045985角蛋白1[智人]224gi|17318569胰蛋白酶前体179gi|136429

     血小板基础蛋白质[小鼠]166gi|13560694脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]162gi|21618837溶菌酶99gi|229157细胞角蛋白9[智人]75gi|435476泛素65gi|223061脱脂载脂蛋白C-I(Apo-CI)(ApoC-I)63gi|114017C3胰蛋白酶前体241gi|136429血小板基础蛋白质[小鼠]160gi|13560694脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]105gi|21618837溶菌酶67gi|229157泛素64gi|223061膜结合转录调节子LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]56gi|42784428C4胰蛋白酶前体172gi|136429血小板基础蛋白质[小鼠]126gi|13560694胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]61gi|21618837具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析57gi|2781269C5胰蛋白酶前体167gi|136429血小板基础蛋白质[小鼠]127gi|13560694角蛋白1[智人]125gi|7331218胰蛋白酶原10[小鼠]58gi|2358087脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]56gi|21618837C6具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析251gi|2781269胰蛋白酶前体225gi|136429血小板碱性蛋白质[小鼠]160gi|13560694脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]92gi|21618837胰蛋白酶(EC3.4.21.4)前体-牛88gi|67549膜结合转录调节子LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]55gi|42784428C7角蛋白1[智人]1151gi|17318569细胞角蛋白9[智人]1009gi|435476角蛋白6C[智人]539gi|17505189角蛋白K5375gi|386850预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]348gi|73996330型II角蛋白Kb1[褐家鼠]319gi|57012354胰蛋白酶前体224gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析215gi|2781269角蛋白10[智人]215gi|40354192内α-胰蛋白酶抑制剂，重链4[小鼠]162gi|9055252α-甲胎蛋白61gi|191765硫氧还蛋白[大肠杆菌]61gi|148071C8血红蛋白β-1链[小鼠]553gi|1183932血红蛋白β-2链[小鼠]493gi|1183933血红蛋白，β成人主链[小鼠]451gi|31982300β-1球蛋白[小鼠]432gi|4760586未命名的蛋白质产物[小鼠]352gi|12845853α-球蛋白[小鼠]321gi|49900

     胰蛋白酶前体245gi|136429血红蛋白α亚基(血红蛋白α链)(α-球蛋白)172gi|122474β球蛋白链[智人]134gi|66473265β球蛋白[白领伶猴]124gi|33415435具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析104gi|2781269血红蛋白α亚基(血红蛋白α链)(α-球蛋白)96gi|122405C9脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]228gi|21618837胰蛋白酶前体186gi|136429α-球蛋白[小鼠]138gi|49900血小板基础蛋白质[小鼠]127gi|13560694具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析122gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087脱脂载脂蛋白C2[小鼠]67gi|817943泛素64gi|223061腺苷酸激酶[华支睾吸虫]55gi|22652628C10角蛋白1[智人]1055gi|7331218细胞角蛋白9[智人]508gi|435476角蛋白10[智人]414gi|40354192表皮细胞角蛋白2[智人]252gi|181402预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]176gi|73996330胰蛋白酶前体166gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析129gi|2781269表皮角蛋白亚基II86gi|293686硫氧还蛋白[大肠杆菌]73gi|148071胰蛋白酶原7[小鼠]69gi|2358072C11脱脂载脂蛋白E374gi|192005角蛋白1[智人]303gi|7331218胰蛋白酶前体266gi|136429预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]167gi|73996330具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析85gi|2781269D1胰蛋白酶前体216gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析104gi|2781269溶菌酶83gi|229157胰腺角蛋白1[褐家鼠]65gi|6981420假定蛋白质LOC338797[智人]55gi|70673359D2链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物139gi|3318722表皮细胞角蛋白2[智人]93gi|181402胰蛋白酶原10[小鼠]64gi|2358087D3胰蛋白酶前体279gi|136429D4角蛋白1[智人]302gi|7331218链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物300gi|3318722未知蛋白质MGC：116262)[褐家鼠]190gi|71051822预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]179gi|73996330具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析78gi|2781269未命名蛋白质产物[粳稻日本晴]59gi|34906342D5具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析256gi|2781269角蛋白1[智人]230gi|7331218胰蛋白酶前体178gi|136429细胞角蛋白9[智人]121gi|435476胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087

     胰蛋白酶原7[小鼠]68gi|2358072膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]56gi|42784428D6胰蛋白酶前体211gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析178gi|2781269胰蛋白酶原7[小鼠]70gi|2358072胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087D7角蛋白6A[智人]491gi|14250682角蛋白6B[智人]435gi|21961227预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架14(细胞角蛋白14)(K14)(CK 14)异构体3[Bos372gi|76649703角蛋白K5359gi|386850细胞角蛋白9[智人]317gi|435476角蛋白1[智人]312gi|7331218胰蛋白酶前体259gi|136429预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]251gi|73996330具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析144gi|2781269硫氧还蛋白[大肠杆菌]79gi|148071Countertrypin＝胎球蛋白型胰蛋白酶抑制剂[小鼠，血浆，部分肽，20aa，4个片段中的第4个]73gi|407619Countertrypin＝胎球蛋白型胰蛋白酶抑制剂[小鼠，血浆，部分肽，23aa，4个片段中的第1个]64gi|407613胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087胎球蛋白[小鼠]60gi|2546995D8血红蛋白，β成人主链[小鼠]324gi|31982300胰蛋白酶前体260gi|136429α-球蛋白[小鼠]140gi|49900脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]129gi|15421856补体成分C3前体102gi|192392溶菌酶66gi|229157脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]64gi|21618837胰蛋白酶原10[小鼠]64gi|2358087非共生血红蛋白[Alnusfirma]64gi|84993584D9胰蛋白酶前体178gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析116gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]69gi|2358087膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]55gi|42784428D10角蛋白1[智人]500gi|17318569内α-角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]400gi|9055252胰蛋白酶前体261gi|136429预测：与角蛋白4异构体2相似[牛]222gi|76617900型II角蛋白Kb18[褐家鼠]182gi|57012352预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]175gi|73996330角蛋白复合物2，碱性的，基因1[小鼠]165gi|6678643型II角蛋白Kb1[褐家鼠]165gi|57012354预测：与角蛋白25A相似[犬类]163gi|73965965细胞角蛋白9[智人]150gi|435476幼虫角蛋白XLK[非洲爪蟾]141gi|13111394硫氧还蛋白[大肠杆菌]141gi|148071

     角蛋白，型II细胞骨架4(细胞角蛋白-4)(CK-4)(角蛋白-4)(K4)(细胞骨架57kDa角蛋白)135gi|82654948大肠杆菌硫氧还蛋白的三维空间结构-S2，2.8埃分辨率133gi|230335TPA：TPA_exp：角蛋白Kb40[小鼠]125gi|46485130内α抑制剂H4重链[褐家鼠]116gi|9506819预测：与角蛋白24异构体1相似[牛]112gi|76644680未命名蛋白质产物[小鼠]109gi|26324736TPA：TPA_exp：型II角蛋白Kb36[小鼠]103gi|46485128型I角蛋白15[肺鱼]102gi|57335394硫氧还蛋白1(TRX1)(TRX)[发光杆菌subsp.laumondii TTO1]100gi|36787919具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析100gi|2781269LOC495267蛋白质[非洲爪蟾]98gi|54261576假定蛋白质LOC77055[小鼠]98gi|85701680角蛋白6胰岛素受体底物3[智人]96gi|27901522硫氧还蛋白[费氏弧菌ES114]90gi|59478765Zgc：92061[斑马鱼]90gi|49902693角蛋白9[犬类]79gi|62122767磷酸丝氨酸磷酸酶[嗜苦古菌DSM9790]79gi|48431085胰腺蛋白酶1[鼠]78gi|6981420Zgc：92035[斑马鱼]74gi|49904349预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架18(细胞角蛋白18)(K18)(CK18)[牛]71gi|76617986角蛋白19[野鸡]70gi|45384356角蛋白复合物2，碱性的，基因8[小鼠]70gi|13624315胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087假定蛋白质LOC496627[热带爪蟾]62gi|58332100转录调节器LytR家族[苏云金杆菌血清型亚种(Bacillusthuringiensis serovarisraelensis)ATCC 35646]58gi|75760497预测：与角蛋白5b相似[犬类]57gi|73996461合并到对蓝藻的特异性的N-末端的未定性区域的丝氨酸肽酶(α/β水解酶超家族)[海洋细菌菌株(Prochlorococcus marinusstr.)NATL2A]55gi|72002395预测：与细胞角蛋白相似，部分[野鸡]54gi|50795725D11未命名蛋白质产物[小鼠]369gi|74146433胰蛋白酶前体182gi|136429硫氧还蛋白[大肠杆菌]69gi|148071溶菌酶63gi|229157E1血红蛋白，β成人主链[小鼠]639gi|31982300血红蛋白β-1链[小鼠]636gi|1183932血红蛋白β-1链[小鼠]453gi|1183933α-球蛋白[小鼠]285gi|49900胰蛋白酶前体274gi|136429β球蛋白链[智人]131gi|66473265具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析101gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087E2血红蛋白β-1链[小鼠]476gi|1183932血红蛋白，β成人主链[小鼠]475gi|31982300血红蛋白β-1链[小鼠]334gi|1183933胰蛋白酶前体186gi|136429α-球蛋白[小鼠]184gi|49900

     重组细胞血小板因子454gi|209286E3血红蛋白β-1链[小鼠]606gi|1183932血红蛋白，β成人主链[小鼠]590gi|31982300血红蛋白β-2链[小鼠]474gi|1183933α-球蛋白[小鼠]287gi|49900胰蛋白酶前体279gi|136429β球蛋白链[智人]89gi|66473265具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析66gi|2781269E4血红蛋白，β成人主链[小鼠]440gi|31982300血红蛋白β-1链[小鼠]396gi|1183932胰蛋白酶前体310gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析249gi|2781269α-球蛋白[小鼠]106gi|49900溶菌酶C(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶C)100gi|47117006表皮细胞角蛋白2[智人]75gi|181402膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC 10987]56gi|42784428E5血红蛋白β-1链[小鼠]477gi|1183932血红蛋白，β成人主链[小鼠]464gi|31982300血红蛋白β-2链[小鼠]346gi|1183933角蛋白10[智人]300gi|40354192α-球蛋白[小鼠]247gi|49900角蛋白1[智人]225gi|17318569胰蛋白酶前体174gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析155gi|2781269表皮细胞角蛋白2[智人]132gi|181402β球蛋白链[智人]93gi|66473265溶菌酶C-3(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶)74gi|126595主要表面糖蛋白[卡氏肺孢子虫]59gi|3560519角蛋白19[智人]58gi|7594734E6角蛋白1[智人]845gi|17318569胰蛋白酶前体296gi|136429链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物291gi|3318722具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析267gi|2781269预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]194gi|73996330细胞角蛋白9[智人]158gi|435476溶菌酶C-3(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶)76gi|126595E7型I角蛋白16；K16[智人]1177gi|1195531角蛋白14[智人]887gi|17512236脱脂载脂蛋白4蛋白质[小鼠]475gi|14789706胰蛋白酶前体178gi|136429预测：与角蛋白1异构体2相似[牛]140gi|76617876表皮细胞角蛋白2[智人]104gi|181402突变异种角蛋白9[智人]102gi|1890020溶菌酶87gi|229157凝溶胶蛋白胞质-小鼠68gi|90508E8胰蛋白酶前体227gi|136429未知[莱氏泰勒虫]207gi|82622379血小板基础蛋白质[小鼠]158gi|13560694具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析116gi|2781269

     脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]115gi|21618837血红蛋白β112gi|229255脱脂载脂蛋白C-I(Apo-CI)(ApoC-I)67gi|114017E9胰蛋白酶前体251gi|136429凝血因子II[小鼠]160gi|15489100具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析105gi|2781269脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]59gi|21618837E10预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架14(细胞角蛋白14)(K14)(CK14)异构体3[Bos311gi|76649703凝溶胶蛋白胞质-小鼠228gi|90508胰蛋白酶前体113gi|136429硫氧还蛋白[大肠杆菌]81gi|148071E11胰蛋白酶前体180gi|136429溶菌酶86gi|229157胰蛋白酶原10[小鼠]61gi|2358087F1胰蛋白酶前体210gi|136429血红蛋白β136gi|229255脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]129gi|15421856具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析77gi|2781269补体成分C3前体72gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]64gi|2358087脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]60gi|21618837F2胰蛋白酶前体215gi|136429脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]120gi|15421856补体成分C3前体83gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]60gi|21618837F3角蛋白1[智人]264gi|7331218具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析247gi|2781269胰蛋白酶前体182gi|136429角蛋白10[智人]179gi|40354192脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]119gi|15421856补体成分C3前体79gi|192392脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]62gi|21618837F4莲E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物336gi|3318722具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析236gi|2781269脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]112gi|15421856表皮细胞角蛋白2[智人]72gi|181402补体成分C3前体69gi|192392F5胰蛋白酶前体258gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析148gi|2781269脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]122gi|15421856角蛋白1，型II，细胞骨架-人117gi|7428712补体成分C3前体104gi|192392α-球蛋白[小鼠]69gi|49900脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]63gi|21618837F6角蛋白1[智人]749gi|17318569细胞角蛋白9[智人]443gi|435476角蛋白10[家兔]277gi|87045985胰蛋白酶前体195gi|136429

     具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析124gi|2781269硫氧还蛋白[大肠杆菌]112gi|148071白蛋白1[小鼠]69gi|29612571凝溶胶蛋白胞质-小鼠58gi|90508酪氨酰-tRNA合成酶[清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)subsp.sakei 23K]56gi|81428383F7补充C3前体(HSE-MSF)[包括：补充C3 β链；补充tC3 α链；C540gi|1352102内α角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]275gi|9055252细胞角蛋白9[智人]175gi|435476胰蛋白酶前体171gi|136429预测：与角蛋白1异构体2相似[牛]141gi|76617876具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析103gi|2781269脱脂载脂蛋白J；SGP-2；TRPM-2[小鼠]94gi|6273853脱脂载脂蛋白A-I前体-老鼠85gi|109571胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087凝溶胶蛋白胞质-小鼠55gi|90508F8角蛋白1[智人]451gi|7331218细胞角蛋白9[智人]387gi|435476角蛋白10[智人]275gi|40354192预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]188gi|73996330胰蛋白酶前体175gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析105gi|2781269F9血红蛋白，β成人主链[小鼠]317gi|31982300角蛋白1[智人]247gi|7331218胰蛋白酶前体190gi|136429α-球蛋白[小鼠]186gi|49900具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析127gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087F10角蛋白1[智人]2235gi|7331218细胞角蛋白9[智人]1608gi|435476型II角蛋白亚基蛋白质1400gi|386854预测：与角蛋白1相似；角蛋白-1；细胞角蛋白1；头发α蛋白质[黑猩猩]697gi|55638031角蛋白10[智人]633gi|40354192角蛋白5[褐家鼠]469gi|33519156预测：与角蛋白4异构体2相似[牛]428gi|76617900表皮细胞角蛋白2[智人]394gi|181402预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]376gi|73996330预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架14(细胞角蛋白14)(K14)(CK14)异构体3[Bos307gi|76649703胰蛋白酶前体264gi|136429表皮角蛋白亚基II222gi|293686溶菌酶94gi|229157白蛋白1[小鼠]87gi|29612571胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087短链脱氢酶/还原酶SDR[伯克霍尔德属.383]66gi|77965219F11血红蛋白，β成人主链[小鼠]495gi|31982300血红蛋白β-1链[小鼠]427gi|1183932角蛋白1[智人]333gi|7331218

     胰蛋白酶前体268gi|136429血红蛋白β-2链[小鼠]216gi|1183933细胞角蛋白9[智人]184gi|435476α-球蛋白[小鼠]141gi|49900具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析100gi|2781269膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]56gi|42784428G1胰蛋白酶前体267gi|136429角蛋白1[智人]198gi|7331218脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]164gi|21618837血小板基础蛋白质[小鼠]134gi|13560694泛素121gi|223061具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析93gi|2781269G2角蛋白1[智人]621gi|17318569角蛋白10[智人]344gi|40354192细胞角蛋白9[智人]338gi|435476表皮角蛋白2[智人]293gi|181402具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析270gi|2781269胰蛋白酶前体261gi|136429预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]179gi|73996330血小板基础蛋白质[小鼠]143gi|13560694脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]130gi|21618837溶菌酶C(1，4-βN-乙酰胞壁质酶C)124gi|47117006表皮角蛋白亚基II92gi|293686泛素66gi|223061胰蛋白酶原10[小鼠]64gi|2358087α球蛋白[智人]62gi|28549G3具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析197gi|2781269胰蛋白酶前体173gi|136429脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]147gi|21618837血小板基础蛋白质[小鼠]139gi|13560694泛素78gi|223061胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC 10987]55gi|42784428G4胰蛋白酶前体184gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析150gi|2781269预测：与角蛋白1异构体2相似[牛]139gi|76617876血小板基础蛋白质[小鼠]128gi|13560694脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]96gi|21618837膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC 10987]54gi|42784428G5胰蛋白酶前体172gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析147gi|2781269血小板基础蛋白质[小鼠]127gi|13560694泛素63gi|223061脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]60gi|21618837G6内α-角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]1044gi|16741341角蛋白1[智人]736gi|17318569细胞角蛋白9[智人]483gi|435476胰蛋白酶前体253gi|136429预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]177gi|73996330

     硫氧还蛋白[大肠杆菌]114gi|148071未命名蛋白质产物[智人]111gi|28317具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析107gi|2781269凝溶胶蛋白胞质-小鼠74gi|90508胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087G7脱脂载脂蛋白E814gi|192005胰蛋白酶前体245gi|136429内α角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]213gi|9055252具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析149gi|2781269脱脂载脂蛋白A-I前体-mouse86gi|109571G8链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物390gi|3318722具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析74gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087G9胰蛋白酶前体271gi|136429脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]116gi|15421856补体成分C3前体80gi|192392胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]57gi|21618837非共生血红蛋白[Alnusfirma]55gi|84993584G10角蛋白6A[智人]1409gi|15559584角蛋白6C[智人]1346gi|17505189角蛋白6B[智人]1295gi|5031841角蛋白6异构体K6e[智人]1245gi|27465517角蛋白6B[智人]1240gi|21961227角蛋白1[智人]1182gi|17318569角蛋白10[智人]938gi|40354192预测：与角蛋白6胰岛素受体底物相似[黑猩猩]765gi|55638029细胞角蛋白9[智人]440gi|435476预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]387gi|73996330胰蛋白酶前体180gi|136429角蛋白19[智人]85gi|7594734假定蛋白质FG03380.1[玉蜀黍赤霉PH-1]61gi|46115076G11胰蛋白酶前体219gi|136429脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]119gi|15421856补体成分C3前体94gi|192392H1具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析232gi|2781269胰蛋白酶前体183gi|136429H2具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析214gi|2781269胰蛋白酶前体188gi|136429H3胰蛋白酶前体182gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析96gi|2781269未命名蛋白质产物[黑青斑河豚]63gi|47227197H4胰蛋白酶前体161gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析100gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]66gi|2358087H5胰蛋白酶前体259gi|136429具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析148gi|2781269胰蛋白酶原10[小鼠]62gi|2358087膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]56gi|42784428H6Gsn蛋白质[小鼠]1111gi|18606238

     角蛋白1[智人]404gi|7331218细胞角蛋白9[智人]399gi|435476内α角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]399gi|9055252胰蛋白酶前体178gi|136429硫氧还蛋白[大肠杆菌]103gi|148071溶菌酶70gi|229157胰蛋白酶原10[小鼠]64gi|2358087H7未命名蛋白质产物[小鼠]856gi|74146433角蛋白1[智人]273gi|17318569表皮细胞角蛋白2[智人]269gi|181402链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物211gi|3318722角蛋白10[家兔]156gi|87045985硫氧还蛋白[大肠杆菌]84gi|148071血小板反应蛋白65gi|554390H8胰蛋白酶前体305gi|136429凝血因子II[小鼠]185gi|15489100预测：与角蛋白1异构体2相似[牛]135gi|76617876具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的分析127gi|2781269脱脂载脂蛋白A-I前体-小鼠107gi|109571预测：与胰蛋白酶原7异构体4相似[犬类]96gi|73978531胰蛋白酶原10[小鼠]68gi|2358087膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC 10987]56gi|42784428H9角蛋白1[智人]426gi|7331218脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]280gi|21618837胰蛋白酶前体267gi|136429细胞角蛋白9[智人]156gi|435476血小板基础蛋白质[小鼠]103gi|13560694胰蛋白酶原10[小鼠]69gi|2358087H10角蛋白6A[智人]1851gi|15559584角蛋白6C[智人]1802gi|17505189TPA：TPA_exp：型II角蛋白K6h[智人]1665gi|32964837角蛋白6异构体K6e[智人]1650gi|27465517角蛋白6B[智人]1581gi|21961227角蛋白10[智人]1196gi|40354192角蛋白1[智人]1190gi|17318569角蛋白5[智人]1076gi|18999435型II角蛋白亚基蛋白质871gi|386854表皮角蛋白亚基II603gi|293686预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相似[犬类]601gi|73996330细胞角蛋白9[智人]575gi|435476角蛋白3[智人]458gi|42760012型IIα-角蛋白IIA[野鸡]326gi|46399073链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物315gi|3318722K15中间细丝型I角蛋白[绵羊279gi|3550539型I角蛋白10[肺鱼]100gi|57335414预测：与胰蛋白酶原7异构体4相似[犬类]97gi|73978531角蛋白19[智人]91gi|7594734胰蛋白酶原7[小鼠]74gi|2358072假定蛋白质FG03380.1[玉蜀黍赤霉PH-1]61gi|46115076膜结合转录调节器LytR[蜡状芽胞杆菌群ATCC 10987]56gi|42784428

    H11胰蛋白酶前体85gi|136429血小板基础蛋白质[小鼠]80gi|13560694可能的糖基转移酶[聚球藻WH 8102]65gi|33632163角蛋白10[智人]57gi|40354192脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]56gi|21618837

    表6

                                                               Swiss-Prot登    时间标

    样品    蛋白质ID                                    分值   记号            识

    B9      腺苷酸激酶[华支睾吸虫]                      59     gi|22652628     2

    B7      白蛋白1[小鼠]                               1536   gi|29612571     3

    A5      α球蛋白[智人]                               147    gi|28549        4

    C7      α-甲胎蛋白                                  61     gi|191765       2

    C8      α-球蛋白[小鼠]                              321    gi|49900        16

            具有螺旋偶极子和电荷侧链的Hen溶菌酶稳定性的

    G2      分析                                        270    gi|2781269      59

    E7      Apoa4蛋白[小鼠]                             475    gi|14789706     1

    A8      脱脂载脂蛋白A-I前体-老鼠                    112    gi|109571       5

    H9      脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]                      280    gi|21618837     22

    C9      脱脂载脂蛋白C2[小鼠]                        67     gi|817943       1

    E8      脱脂载脂蛋白C-I(Apo-CI)(ApoC-I)             67     gi|114017       2

    F1      脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]                     129    gi|15421856     15

    G7      脱脂载脂蛋白E                               814    gi|192005       2

    F7      脱脂载脂蛋白J；SGP-2；TRPM-2[小鼠]          94     gi|6273853      1

    C8      β球蛋白[白领伶猴]                           124    gi|33415435     1

    C8      β球蛋白链[智人]                             134    gi|66473265     6

    C8      β-1-球蛋白[小鼠]                            432    gi|4760586      1

    B12     钙调素-类似物5[智人]                        195    gi|55859601     1

    F4      链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物 336    gi|3318722      10

    H8      凝血因子II[小鼠]                            185    gi|15489100     2

            补充C3前体(HSE-MSF)[包括s：补充C3 β链；

    F7      补充C3 α链；C                               540    gi|1352102      3

    F5      补充成分C3前体                              104    gi|192392       15

            countertrypin＝胎球蛋白型胰蛋白酶抑制剂[鼠，血浆，

    D7      肽部分，20aa，4的片段4]                     73     gi|407619       2

    B8      胱蛋白C前体[小鼠]                           98     gi|11762010     1

    F10     细胞角蛋白9[智人]                           1608   gi|435476       27

    B9      表皮的细胞角蛋白2[智人]                     700    gi|181402       12

    H10     表皮的角蛋白亚基II                          603    gi|293686       6

    D7      胎球蛋白[小鼠]                              60     gi|2546995      1

    B8      Flp菌毛装配蛋白质CpaB家族[伯克氏菌属E264]   57     gi|83719123     1

    E10     凝溶胶蛋白胞质-小鼠                         228    gi|90508        6

    B12     3-磷酸甘油醛脱氢酶[智人]                    62     gi|31645        1

    H6      Gsn蛋白质[小鼠]                             1111   gi|18606238     1

    C8      血红蛋白β-2链[小鼠]                         493    gi|1183933      11

    E1      血红蛋白β-1链[小鼠]                         636    gi|1183932      14

    C8      血红蛋白α亚基(血红蛋白α链)(α-球蛋白)        96     gi|122405       1

    C8      血红蛋白α亚基(血红蛋白α链)(α-球蛋白)        172    gi|122474       1

    F1      血红蛋白β                                   136    gi|229255       2

    A1      血红蛋白β                                   182    gi|229301       1

    A4   血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)(β-球蛋白)                  58     gi|122606      1

    A3   血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)(β-球蛋白)                  165    gi|122643      2

    E1   血红蛋白，β成人主链[小鼠]                             639    gi|31982300    10

    A7   富含组氨酸糖蛋白[小鼠]                                111    gi|11066003    1

    H10  假定蛋白质FG03380.1[玉蜀黍赤霉PH-1]                   61     gi|46115076    3

    D1   假定蛋白质LOC338797[智人]                             55     gi|70673359    1

    D10  假定蛋白质LOC496627[热带爪蟾]                         62     gi|58332100    1

    D10  假定蛋白质LOC77055[小鼠]                              98     gi|85701680    1

    B7   假定蛋白质SAV6338[阿维链霉菌MA-4680]                  62     gi|29832880    1

    G6   内α-角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]                         1044   gi|16741341    1

    D10  内α-角蛋白抑制剂，重链4[小鼠]                         400    gi|9055252     6

    D10  内α-角蛋白抑制剂，重链[鼠]                            116    gi|9506819     1

    H10  K15中间细丝型I角蛋白[绵羊]                            279    gi|3550539     1

    B12  角蛋白                                                437    gi|386848      1

    B7   角蛋白1[智人]                                         1518   gi|17318569    21

    F10  角蛋白1[智人]                                         2235   gi|7331218     18

    B6   角蛋白1，型II，细胞骨架-人                            142    gi|7428712     4

    H10  角蛋白10[智人]                                        1196   gi|40354192    18

    C2   角蛋白10[家兔]                                        288    gi|87045985    4

    A11  角蛋白14[智人]                                        1134   gi|17512236    2

    B11  角蛋白15[智人]                                        166    gi|30583361    1

    B12  角蛋白17[智人]                                        516    gi|48735384    1

    D10  角蛋白19[野鸡]                                        70     gi|45384356    1

    H10  角蛋白19[智人]                                        91     gi|7594734     4

    H10  角蛋白3[智人]                                         458    gi|42760012    1

    H10  角蛋白5[智人]                                         1076   gi|18999435    1

    A11  角蛋白5[智人]                                         349    gi|4557890     1

    F10  角蛋白5[褐家鼠]                                       469    gi|33519156    1

    D10  角蛋白6胰岛素受体底物3[智人]                          96     gi|27901522    1

    H10  角蛋白6异构体K6e[智人]                                1650   gi|27465517    2

    B10  角蛋白6A[智人]                                        653    gi|14250682    3

    H10  角蛋白6A[智人]                                        1851   gi|15559584    2

    H10  角蛋白6B[智人]                                        1581   gi|21961227    5

    G10  角蛋白6B[智人]                                        1295   gi|5031841     1

    H10  角蛋白6C[智人]                                        1802   gi|17505189    3

    D10  角蛋白9[犬类]                                         79     gi|62122767    1

    B10  角蛋白复合物1，酸性的，基因14[小鼠]                   311    gi|21489935    1

    D10  角蛋白复合物2，碱性的，基因1[小鼠]                    165    gi|6678643     1

    D10  角蛋白复合物2，碱性的c，基因8[小鼠]                   70     gi|13624315    1

    B12  角蛋白K5                                              390    gi|386850      3

    B12  角蛋白型16                                            283    gi|186685      1

    A11  角蛋白型II                                            492    gi|386849      1

         角蛋白，型II细胞骨架4(细胞角蛋白-4)(CK-4)

    D10  (角蛋白-4)(K4)(细胞骨架57kDa角蛋白)                   135    gi|82654948    1

    D10  larval角蛋白XLK[非洲爪蟾]                             141    gi|13111394    1

    D10  LOC495267蛋白质[非洲爪蟾]                             98     gi|54261576    1

    C2   溶菌酶                                                99     gi|229157      15

    B8   溶菌酶                                                73     gi|841217      1

    G2   溶菌酶C(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶C)                       124    gi|47117006    3

    E6   溶菌酶C-3(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶)                      76     gi|126595      2

    E5   主要表面糖蛋白[卡氏肺孢子虫]                          59     gi|3560519     1

         膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC

    H8   10987]                                           56      gi|42784428     13

    E7   突变体角蛋白9[智人]                              102     gi|1890020      1

    D8   非共生血红蛋白[Alnus firma]                      64      gi|84993584     3

    D10  胰腺胰蛋白酶1[褐家鼠]                            78      gi|6981420      2

    B8   小白蛋白[小鼠]                                   77      gi|509139       1

    D10  磷酸丝氨酸磷酸酶[嗜苦古菌DSM 9790]               79      gi|48431085     1

    C2   血小板碱性蛋白质[小鼠]                           166     gi|13560694     15

    A2   血小板因子4[小鼠]                                87      gi|13560695     1

    H11  可能的糖基转移酶[聚球藻WH 8102]                  65      gi|33632163     1

    B8   预测：与角蛋白1异构体2相似[牛]                   243     gi|76617876     5

         预测：与角蛋白1相似；角蛋白-1；细胞角蛋白1；头

    F10  发α蛋白质[黑猩猩]                                697     gi|55638031     2

    A11  预测：与角蛋白15相同[牛]                         209     gi|61813798     1

    B12  预测：与角蛋白17相似[黑猩猩]                     184     gi|55644941     1

    D10  预测：与角蛋白24异构体1相似[牛]                  112     gi|76644680     1

    D10  预测：与角蛋白25A相似[犬类]                      163     gi|73965965     1

    F10  预测：与角蛋白4异构体2相似[牛]                   428     gi|76617900     2

    D10  预测：与角蛋白5b相似[犬类]                       57      gi|73996461     1

    G10  预测：与角蛋白6胰岛素受体底物相似[黑猩猩         765     gi|55638029     3

         预测：与角蛋白6胰岛素受体底物异构体12相

    H10  似[犬类]                                         601     gi|73996330     24

         预测：与角蛋白8，型II细胞骨架相似-人[黑猩

    A11  猩                                               90      gi|55638407     1

         预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架14(细胞角蛋白

    B10  14)(K14)(CK14)异构体3[Bos                        445     gi|76649703     5

         预测：与角蛋白相似，型I细胞骨架18(细胞角蛋白

    D10  18)(K18)(CK18)[牛]                               71      gi|76617986     1

         预测：与角蛋白相似，型II细胞骨架5(细胞角蛋白

    B8   5)(K5)(CK 5)(58kDa cytokerat                     262     gi|73996312     1

         预测：与角蛋白相似，型II细胞骨架8(细胞角蛋白

    B10  8)(细胞角蛋白内A)[鼠                             87      gi|62657929     1

         预测：与角蛋白相似，型II细胞骨架8(细胞角蛋白

    B12  -8)(CK-8)(Keraton-8)(K8)[智人]                   80      gi|88988823     1

    D10  预测：与角蛋白相似，部分[野鸡]                   54      gi|50795725     1

    B10  预测：类似于胰蛋白酶原7异构体4[犬类              108     gi|73978531     4

    B8   抑制蛋白1[小鼠]                                  111     gi|56206029     1

    E2   重组细胞血小板因子4                              54      gi|209286       1

         合并到对蓝藻的特异性的N-末端的未定性区域丝氨

         酸肽酶(α/β水解酶超家族)[海洋细菌菌株

    D10  (Prochlorococcus marinus str.)NATL2A]             55      gi|72002395     1

    F10  短-链脱氢酶/还原酶SDR[伯克霍尔德氏菌383]         66      gi|77965219     3

    D10  硫氧还蛋白[大肠杆菌]                             141     gi|148071       12

    D10  硫氧还蛋白[弧菌属细菌ES114]                      90      gi|59478765     1

         硫氧还蛋白1(TRX1)(TRX)[发光杆菌subsp.

    D10  laumondii TTO1]                                  100     gi|36787919     1

         大肠杆菌硫氧还蛋白的三维空间结构-S2，2.8埃分

    D10  辨率                                             133     gi|230335       1

    H7   凝血栓蛋白                                       65      gi|554390       1

    D10  TPA：TPA_exp：角蛋白Kb40[小鼠]                   125     gi|46485130     1

    H10  TPA：TPA_exp：型II角蛋白K6h[智人]                1665    gi|32964837     1

    D10  TPA：TPA_exp：型II角蛋白Kb36[小鼠]               103     gi|46485128     1

          转录调节器，LytR家族[苏云金杆菌血清型亚种

    D10   ATCC35646]                                 58     gi|75760497    1

    A7    转铁蛋白[小鼠]                             304    gi|17046471    1

    B8    转甲状腺素蛋白[小鼠]                       95     gi|56541070    1

    C6    胰蛋白酶(EC3.4.21.4)前体-牛                88     gi|67549       1

    E4    胰蛋白酶前体                               310    gi|136429      79

    A3    胰蛋白酶原10[小鼠]                         71     gi|2358087     41

    H10   胰蛋白酶原7[小鼠]                          74     gi|2358072     6

    H10   型I角蛋白10[肺鱼]                          100    gi|57335414    4

    D10   型I角蛋白15[肺鱼]                          102    gi|57335394    1

    A11   型I角蛋白16；K16[智人]                     1301   gi|1195531     4

    H10   型IIalpha-角蛋白IIA[野鸡]                  326    gi|46399073    1

    B10   型IIalpha-角蛋白IIB[野鸡]                  89     gi|46399075    1

    C7    型II角蛋白Kb1[褐家鼠]                      319    gi|57012354    2

    D10   型II角蛋白Kb18[褐家鼠]                     182    gi|57012352    1

    F10   型II角蛋白亚基蛋白质                       1400   gi|386854      2

    F6    酪氨酰-tRNA合成酶[清酒乳杆菌subsp.sakei23K]56     gi|81428383    1

    G1    泛素                                       121    gi|223061      8

    D4    未知(蛋白质，MGC：116262)[褐家鼠]          190    gi|71051822    1

    E8    未知[莱氏泰勒虫]                           207    gi|82622379    1

    G6    未知蛋白质产物[智人]                       111    gi|28317       1

    C8    未知蛋白质产物[小鼠]                       352    gi|12845853    1

    D10   未命名蛋白质产物[小鼠]                     109    gi|26324736    1

    H7    未命名蛋白质产物[小鼠]                     856    gi|74146433    2

          未知蛋白质产物[水稻(单子叶植物粳稻(japonica

    D4    cultivar-group，日本晴)]                   59     gi|34906342    1

    H3    未知蛋白质产物[黑青斑河豚]                 63     gi|47227197    1

    D10   Zgc：92035[斑马鱼]                         74     gi|49904349    1

    D10   Zgc：92061[斑马鱼]                         90     gi|49902693    1

    总数目                                                                 707

          角蛋白或角蛋白有关的蛋白质                                       225

          角蛋白或角蛋白有关的蛋白质                                       145

          溶菌酶或溶菌酶有关的蛋白质                                       80

    不含角蛋白/胰岛素/溶菌酶的总的蛋白质数目                               257

    单一蛋白质数目                                                         154

          角蛋白或角蛋白有关的蛋白质                                       64

          角蛋白或角蛋白有关的蛋白质                                       7

          溶菌酶或溶菌酶有关的蛋白质                                       6

    不含角蛋白/胰岛素/溶菌酶的单一蛋白质数目                               77

                                                            Swiss-Prot登

    样品  蛋白质ID                                   分值   记号           时间标识

    H9    脱脂载脂蛋白A-II[小鼠]                     280    gi|21618837    22

    C8    α-球蛋白[小鼠]                             321    gi|49900       16

    C2    血小板碱性蛋白质[小鼠]                     166    gi|13560694    15

    F1    脱脂载脂蛋白C-III[小鼠]                    129    gi|15421856    15

    F5    补充成分C3前体                             104    gi|192392      15

    E1    血红蛋白β-1链[小鼠]                        636    gi|1183932     14

    H8    膜结合转录调节器LytR[蜡状芽孢杆菌ATCC10987]56     gi|42784428    13

    D10    硫氧还蛋白[大肠杆菌]                       141      gi|148071   12

    C8     血红蛋白-2β链[小鼠]                        493      gi|1183933  11

    E1     血红蛋白，β成人主链[小鼠]                  639      gi|31982300 10

    F4     链E，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶复合物336      gi|3318722  10

    G1     泛素                                       121      gi|223061   8

    D10    内α-胰蛋白酶抑制剂，重链4[小鼠]            400      gi|9055252  6

    E10    凝溶胶蛋白，胞质-小鼠                      228      gi|90508    6

    C8     球蛋白链[智人]                             134      gi|66473265 6

    A8     脱脂载脂蛋白A-I前体-小鼠                   112      gi|109571   5

    A5     α球蛋白[智人]                              147      gi|28549    4

    B7     白蛋白1[小鼠]                              1536     gi|29612571 3

           补体C3前体(HSE-MSF)[包括：补体C3 β链；补

    F7     体C3链；C                                  540      gi|1352102  3

    F10    短-链脱氢酶/还原酶SDR[伯克霍尔德菌383]     66       gi|77965219 3

    D8     非共生血红蛋白[Alnus firma]                64       gi|84993584 3

    H10    假定蛋白质FG03380.1[玉蜀黍赤昌PH-1]        61       gi|46115076 3

    H7     未命名蛋白质[小鼠]                         856      gi|74146433 2

    G7     脱脂载脂蛋白E                              814      gi|192005   2

    H8     凝血因子II[小鼠]                           185      gi|15489100 2

    A3     血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)(β-球蛋白)       165      gi|122643   2

    F1     血红蛋白β                                  136      gi|229255   2

           countertrypin＝胎球蛋白型胰蛋白酶抑制剂[鼠，血浆，

    D7     肽部分，20aa，4的片段4]                     73      gi|407619   2

    E8     脱脂载脂蛋白C-I(Apo-CI)(ApoC-I)             67      gi|114017   2

    C7     α-甲胎蛋白                                  61      gi|191765   2

    B9     腺苷酸激酶[华支睾吸虫]                      59      gi|22652628 2

    H6     Gsn蛋白质[小鼠]                             1111    gi|18606238 1

    G6     内α-胰蛋白酶抑制剂，重链4[小鼠]             1044    gi|16741341 1

    E7     Apoa4蛋白质[小鼠]                           475     gi|14789706 1

    C8     β-1-球蛋白[小鼠]                            432     gi|4760586  1

    C8     未命名蛋白质产物[小鼠]                      352     gi|12845853 1

    A7     转铁蛋白[小鼠]                              304     gi|17046471 1

    E8     未知[莱氏泰勒虫]                            207     gi|82622379 1

    B12    钙调素-类似物5[智人]                        195     gi|55859601 1

    D4     未知(蛋白质，MGC：116262)[褐家鼠]           190     gi|71051822 1

    A1     血红蛋白β                                   182     gi|229301   1

    C8     血红蛋白α亚基(血红蛋白α链)(α-球蛋白)        172     gi|122474   1

           大肠杆菌硫氧还蛋白的三维-空间结构S2，2.8埃分辨

    D10    率                                          133     gi|230335   1

    C8     β球蛋白[白领伶猴]                           124     gi|33415435 1

    D10    内-α-抑制剂H4重链[鼠]                       116     gi|9506819  1

    A7     富含组氨酸的糖蛋白[小鼠]                    111     gi|11066003 1

    B8     抑制蛋白1[小鼠]                             111     gi|56206029 1

    G6     未命名蛋白质产物[智人]                      111     gi|28317    1

    D10    未命名蛋白质产物[小鼠]                      109     gi|26324736 1

           硫氧还蛋白1(TRX1)(TRX)[发光杆菌subsp.

    D10    laumondii TTO1]                             100     gi|36787919 1

    B8     胱蛋白C前体[小鼠]                           98      gi|11762010 1

    D10    假定蛋白质LOC77055[小鼠]                    98      gi|85701680 1

    D10    LOC495267蛋白质[非洲爪蟾]                   98      gi|54261576 1

    C8     血红蛋白α亚基(血红蛋白α链)(α球蛋白)         96      gi|122405   1

    B8     转甲状腺素蛋白[小鼠]                        95      gi|56541070 1

    F7     脱脂载脂蛋白J；SGP-2；TRPM-2[小鼠]          94     gi|6273853    1

    D10    硫氧还蛋白[费氏弧菌ES114]                   90     gi|59478765   1

    D10    Zgc：92061[斑马鱼]                          90     gi|49902693   1

    A2     血小板因子4[小鼠]                           87     gi|13560695   1

    D10    磷酸丝氨酸磷酸酶[嗜苦古菌DSM 9790]          79     gi|48431085   1

    B8     小白蛋白[小鼠]                              77     gi|509139     1

    D10    Zgc：92035[斑马鱼]                          74     gi|49904349   1

    C9     脱脂载脂蛋白C2[小鼠]                        67     gi|817943     1

    H11    可能的糖基转移酶[聚球藻WH 8102]             65     gi|33632163   1

    H7     血小板反应素                                65     gi|554390     1

    H3     未命名的蛋白质产物[黑青斑河豚]              63     gi|47227197   1

    B12    3-磷酸甘油醛脱氢酶[智人]                    62     gi|31645      1

    B7     假定蛋白质SAV6338[阿维链霉菌MA-4680]        62     gi|29832880   1

    D10    假定蛋白质LOC496627[热带爪蟾]               62     gi|58332100   1

    D7     胎球蛋白[小鼠]                              60     gi|2546995    1

    D4     未命名蛋白质产物[水稻(日本晴)]              59     gi|34906342   1

    E5     主要表面糖蛋白[卡氏肺孢子虫]                59     gi|3560519    1

    A4     血红蛋白β亚基(血红蛋白β链)(β-球蛋白)        58     gi|122606     1

           转录调节子，LytR家族[苏云金杆菌血清型亚种ATCC

    D10    35646]                                      58     gi|75760497   1

    B8     Flp菌毛装配蛋白质CpaB家族[伯克氏菌属E264]   57     gi|83719123   1

    F6     酪氨酰-tRNA合成酶[清酒乳杆菌subsp.sakei 23K]56     gi|81428383   1

    D1     假定蛋白质LOC338797[智人]                   55     gi|70673359   1

           合并到对蓝藻的特异性的N-末端的未定性区域丝氨酸

           肽酶(α/β水解酶超家族)[海洋细菌菌株

    D10    (Prochlorococcus marinus str.)NATL2A]       55     gi|72002395   1

    E2     重组细胞血小板因子4                         54     gi|209286     1

    总数目                                                                  257

    独特蛋白质数目                                                          77
    尽管前述指代特别优选的实施方式，但是可以认为本发明不是如此被限制的。对于那些本领域的普通技术人员来说，对公开的实施方式可以做多种改进；并且这样的改进拟在本发明的范围之内。
    在本说明书中引用的所有的公开出版物、专利申请和专利，在此并入它们的全部，以作参考。