人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽、多核苷酸序列及其应用.pdf

本发明为一种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽、多核苷酸序列及其应用，所述抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：(1)Gln－Leu－Leu－Glu－Gln－Trp－Asn－Leu－Val；(2)Trp－Ser－Phe－Asn－Pro－Glu－Thr－Asn－Ile；(3)Val－Thr－Arg－Pro－Leu－Met－Glu－Ser；(4)Ser－Tyr－Tyr－Lys－Leu－Gly－Ala(5)Val－Gly－Thr－Asp－Ser－Gly－Phe－Ala－Ala－Tyr。本发明的多肽制备的诊断芯片能特异性地识别SARS感染者血清，是理想的诊断工具，而且这类肽及其组合物基本上不含SARS病毒原的其它蛋白及感染体本身，因此把它用作疫苗，可有效地预防SARS病毒感染。

1.  一种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽，为如下五种多肽片段之一，其氨基酸序列分别为：
(1)Gln-Leu-Leu-Glu-Gln-Trp-Asn-Leu-Val；
(2)Trp-Ser-Phe-Asn-Pro-Glu-Thr-Asn-Ile；
(3)Val-Thr-Arg-Pro-Leu-Met-Glu-Ser；
(4)Ser-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ala；
(5)Val-Gly-Thr-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr。

2.  权利要求1所述的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽在制备人类SARS诊断芯片上的应用。

3.  如权利要求2所述的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽在制备人类SARS诊断芯片上的应用，多肽芯片中的多肽包括权利要求1所述的五种多肽之一，或每种多肽重复多次的多肽片段之一，或五种多肽片段之间任意组合以酰胺联锁偶联在一起形成的多肽片段之一，或前述各种多肽之间任意组合而成的多肽组合物。

4.  权利要求1所述的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽在制备人类SARS疫苗上的应用。

5.  如权利要求4所述的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽在制备人类SARS疫苗上的应用，疫苗包括权利要求1所述的五种多肽之一，或每种多肽重复多次的多肽片段之一，或五种多肽片段之间任意组合以酰胺联锁偶联在一起形成的多肽片段之一，或前述各种多肽之间任意组合而成的多肽组合物。

6.  一种编码权利要求1所述的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的多核苷酸序列及与该多核苷酸互补的多核苷酸序列，所述编码人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的多核苷酸序列分别如下：
(1)CAA CTC CTG GAA CAA TGG AAC CTA GTA；
(2)TGG TCA TTC AAC CCA GAA ACA AAC ATT；
(3)GTG ACC AGA CCG CTC ATG GAA AGT；
(4)TCT TAT TAC AAA TTA GGA GCG
(5)GTA GGC ACT GAT TCA GGT TTT GCT GCA TAC。

7.  权利要求6所述的多核苷酸序列在制备人类SARS诊断芯片上的应用。

8.  权利要求6所述的多核苷酸序列在制备人类SARS疫苗上的应用。

人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽、多核苷酸序列及其 应用
技术领域
本发明涉及一种具有人类SARS病毒免疫原性的多肽及相应的多核苷酸序列及它们在制备人类SARS诊断芯片和疫苗上的应用。
背景技术
严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又叫传染性非典性肺炎，是一种于2003年上半年在全球约30多个国家和地区发生的恶性传染性呼吸系统疾病。截至2003年7月，全球共累计报告SARS病例约8000多例，死亡近800人。由于SARS具有发病迅速、传染性强等特点，目前已受到全社会的广泛关注，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。经研究发现几种新型的冠状病毒是主要的病原体，2003年4月16日WHO正式确认冠状病毒亚型的变种即SARS病毒是引起人体产生SARS的主要原因。目前已从世界不同SARS病区分离出7个SARS病毒变种，并进行了SARS病毒的基因组学分析。
冠状病毒(Coronavirus)是一个较大的RNA病毒家族，而SARS冠状病毒属于这一家族中新出现的类群。它的宿主是非常广泛的(包括哺乳动物、鸟类等)。对SARS病毒基因组全序列分析，发现SARS冠状病毒是由29736-Nucleotide，polyadenylated RNA组成，基因组大约可编码20多个不同的蛋白质，其中主要的结构蛋白有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)、S蛋白(spike protein)、E蛋白(envelopprotein)、M蛋白(membrane protein)，N蛋白(nucleocapsid protein)等。
SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白，E蛋白，M蛋白，和N蛋白)是相对保守的分子，同时也是病毒形态建成和感染的主要相关组分，其中S蛋白和M蛋白可能是SARS病毒导致细胞感染，引起人体严重病理反应的最重要致病因素。SARS病毒S蛋白是SARS病毒侵染人体过程中的关键蛋白。正因如此，目前国际上对SARS病毒的研究大多集中在S蛋白上。S蛋白的羧基端含有一个半胱氨酸富集区和一个穿膜区，另外在氨基端还存在一个13个氨基酸的信号肽区域。与现有已知冠状病毒蛋白序列的对比分析，发现S蛋白的保守性相当高，是研究开发SARS药物重要药物靶点，但过高的同源性对开发应用于诊断的试剂是不利的。M蛋白是一个膜蛋白，一级结构序列约含有221个氨基酸，分子量在25Kd左右。二级结构分析显示，M蛋白有3个疏水性α螺旋区组成的跨膜区，N端处于膜外，可能由三个结构域组成，是一个决定并影响病毒出芽的重要结构蛋白。研究表明抗M糖蛋白包膜外区的抗体，在补体的协助下，可以抑制病毒的感染；此外，冠状病毒的M糖蛋白还可以诱导α-IFN的产生，因此SARS病毒的M样蛋白也作为研发疫苗候选分子筛选的靶标分子。
目前SARS诊断主要有两种途径：一种是利用RT-PCR技术针对SARS病毒检测的方法，它能够在早期临床检测中及时发现SARS患者，但目前这种方法应用到临床上还需完善。一方面PCR试剂盒在特异性、敏感性、试剂规范性上需要提高，另一方面在病人标本的采集上需要摸索，如在病人感染后什么时间采标本？采什么地方的哪类标本最适合做PCR分析等都还是问题。第二种途径就是采用抗体检测。由于目前SARS病毒的传代培养极为困难，而且SARS病毒具高度传染性，在病原体制备灭活抗原过程中存在SARS疾病的传播危险，所以通过大量培养SARS病毒来制备抗原的方法是非常困难的。因此，通过人工合成或重组DNA技术来制备SARS病毒的抗原决定簇多肽，对SARS进行诊断和预防是最理想的，但有一个前提就是要进行SARS病毒的抗原多肽和疫苗候选分子的筛选，这正是本发明专利所涉及的问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对上述人类SARS诊断和预防的现状，提供能促使人体产生保护性抗体的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽，并应用于制备人类SARS多肽诊断芯片和多肽疫苗。
本发明的第二个目的在于提供一种编码人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的多核苷酸序列及与该多核苷酸互补的多核苷酸序列，并应用于制备人类SARS诊断芯片和疫苗。
本发明的目的是这样实现的：本发明的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽，为如下五种多肽片段之一，其氨基酸序列分别为：
(1)ln-Leu-Leu-Glu-Gln-Trp-Asn-Leu-Val；
(2)Trp-Ser-Phe-Asn-Pro-Glu-Thr-Asn-Ile；
(3)Val-Thr-Arg-Pro-Leu-Met-Glu-Ser；
(4)Ser-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ala；
(5)Val-Gly-Thr-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr。
编码上述五种多肽片段的相应核苷酸序列分别为：
(1)CAA CTC CTG GAA CAA TGG AAC CTA GTA；
(2)TGG TCA TTC AAC CCA GAA ACA AAC ATT；
(3)GTG ACC AGA CCG CTC ATG GAA AGT；
(4)TCT TAT TAC AAA TTA GGA GCG
(6)GTA GGC ACT GAT TCA GGT TTT GCT GCA TAC。
上述五种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽片段的筛选过程如下：
(1)SARS病毒表面膜蛋白亲水性分析：
SARS病毒表面膜蛋白由221个氨基酸组成，其氨基酸序列如下(Monroe等2003，NCBI Sequence AAP13444)：1 madngtitve elkqlleqwn lvigflflaw imllqfaysn rnrflyiikl vflwllwpvt61 lacfvlaavy rinwvtggia iamacivglm wlsyfvasfr lfartrsmws fnpetnilln121 vplrgtivtr plmeselvig aviirghlrm aghplgrcdi kdlpkeitva tsrtlsyykl181 gasqrvgds gfaaynryri gnyklntdha gsndniallv q
用Gene-tyx-MAC9.0分析SARS病毒表面膜蛋白的亲水性，在SARS病毒表面膜蛋白内，亲水性区域主要在两个部分：一部分是1-52氨基酸片段，另一部分是101-221氨基酸片段，中间部分第53-100氨基酸是疏水部分，如图1所示。本发明所筛选的抗原表位主要在亲水区域。
(2)SARS病毒表面膜蛋白亲水性区域线性重叠肽链文库制备：
线性重叠肽链文库是筛选新的疫苗候选分子及其诊断抗原、多肽疫苗的合成和单克隆抗体的制备的重要工具。
将SARS病毒表面膜蛋白亲水性区域1-52和101-221的氨基酸输入到Auto-spot-Robot计算机内，编辑制备6个氨基酸为1个肽链单位，且每相邻两个肽链单位之间仅有一个氨基酸差异的线性重叠肽链库。SARS病毒表面膜蛋白亲水性区域肽链文库如下所示：
1  M A D N G T  2  A D N G T I   3  D N G T I T
4  N G T I T V  5  G T I T V E   6  T I T V E E
7  I T V E E L  8  T V E E L K   9  V E E L K Q
10 E E L K Q L  11 E L K Q L L   12 L K Q L L E
13 K Q L L E Q  14 Q L L E Q W   15 L L E Q W N
16 L E Q W N L  17 E Q W N L V   18 Q W N L V I
19 W N L V I G  20 N L V I G F   21 L V I G F L
22 V I G F L F  23 I G F L F L   24 G F L F L A
25 F L F L A W  26 L F L A W I   27 F L A W I M
28 L A W I M L  29 A W I M L L   30 W I M L L Q
31 I M L L Q F  32 M L L Q F A   33 L L Q F A Y
34 L Q F A Y S  35 Q F A Y S N   36 F A Y S N R
37 A Y S N R N  38 Y S N R N R   39 S N R N R F
40 N R N R F L  41 R N R F L Y   42 N R F L Y I
43 R F L Y I I  44 F L Y I I K   45 L Y I I K L
46 Y I I K L V  47 I I K L V F   48
49 L F A R T R  50 F A R T R S   51 A R T R S M
52 R T R S M W  53 T R S M W S   54 R S M W S F
55 S M W S F N  56 M W S F N P   57 W S F N P E
58 S F N P E T  59 F N P E T N   60 N P E T N I
61 P E T N I L  62 E T N I L L   63 T N I L L N
64 N I L L N V  65 I L L N V P   66 L L N V P L
67 L N V P L R  68 N V P L R G   69 V P L R G T
70 P L R G T I  71 L R G T I V   72 R G T I V T
73 G T I V T R  74 T I V T R P   75 I V T R P L
76 V T R P L M  77 T R P L M E   78 R P L M E S
79 P L M E S E  80 L M E S E L   81 M E S E L V
82 E S E L V I   83 S E L V I G   84 E L V I G A
85 L V I G A V   86 V I G A V I   87 I G A V I I
88 G A V I I R   89 A V I I R G   90 V I I R G H
91 I I R G H L   92 I R G H L R   93 R G H L R M
94 G H L R M A   95 H L R M A G   96 L R M A G H
97 R M A G H S   98 M A G H S L   99 A G H S L G
100 G H S L G R  101 H S L G R C  102 S L G R C D
103 L G R C D I  104 G R C D I K  105 R C D I K D
106 C D I K D L  107 D I K D L P  108 I K D L P K
109 K D L P K E  110 D L P K E I  111 L P K E I T
112 P K E I T V  113 K E I T V A  114 E I T V A T
115 I T V A T S  116 T V A T S R  117 V A T S R T
118 A T S R T L  119 T S R T L S  120 S R T L S Y
121 R T L S Y Y  122 T L S Y Y K  123 L S Y Y K L
124 S Y Y K L G  125 Y Y K L G A  126 Y K L G A S
127 K L G A S Q  128 L G A S Q R  129 G A S Q R V
130 A S Q R V G  131 S Q R V G T  132 Q R V G T D
133 R V G T D S  134 V G T D S G  135 G T D S G F
136 T D S G F A  137 D S G F A A  138 S G F A A Y
139 G F A A Y N  140 F A A Y N R  141 A A Y N R Y
142 A Y N R Y R  143 Y N R Y R I  144 N R Y R I G
145 R Y R I G N  146 Y R I G N Y  147 R I G N Y K
148 I G N Y K L  149 G N Y K L N  150 N Y K L N T
151 Y K L N T D  152 K L N T D H  153 L N T D H A
154 N T D H A G  155 T D H A G S  156 D H A G S N
157 H A G S N D  158 A G S N D N  159 G S N D N I
160 S N D N I A  161 N D N I A L  162 D N I A L L
163 N I A L L V  164 I A L L V Q
肽链库的合成方法如下：用活化剂1-Methyl-2-Pyrroliclon(NMP)溶解用于肽链库构建所需要的氨基酸，在第一个氨基酸点样前，必须将固相地纤维素膜用Fmocβ-alamine进行脱保护处理，再用Auto-spotRobot(Gilson，Villiers le Vile，France)全自动点样机进行第一个氨基酸的点样，并分别用20％piperdine洗膜15-20min，脱去Fmoc基团，用DMF(N，N-Dimethyl formamide)洗涤纤维素膜4-5遍，每次3min；用膜染色液BPB(Bromophenol Blue)染色2min；用无水酒精洗涤膜2次，每次5min；冷风干燥，再进行第二个氨基酸的点样，每个氨基酸点样完后都需按前面的程序进行洗涤、染色和干燥等过程，待最后的氨基酸点样完毕后需经过5％phenol、50％TFA、2.5％ethan-dithiol、5％thioanisole，5％水和0.5ml DCM进行侧链的脱保护处理。
(3)人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇筛选：
来自中国广东省深圳市SARS病人阳性血清库的8份阳性血清与本发明制备的人类SARS病毒表面膜蛋白线性重叠肽链库芯片进行DOT-ELISA反应。具体方法如下：将肽链芯片用封闭缓冲液BlockingBuffer封闭，在4℃的条件下过夜，用冲洗缓冲液Washing Buffer洗三次，每次5分钟。将上述处理后的肽链芯片与SARS患者血清在37℃下孵化1小时，与标记的抗人免疫球蛋白在37℃下孵化1小时，用Washing Buffer洗三次，再用DAB发色，蒸馏水冲洗并干燥。
肽链库与SARS阳性血清DOT-ELISA反应的结果发现，在五个共同位点上发生了强烈的杂交阳性反应，而对照血清均没有在肽链芯片的这些位点起反应，如图2所示。用计算机数字识别系统定量测定DOT-ELISA反应的强度，测定得到5个共同的B细胞表位，这就是本发明所涉及的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇，其氨基酸序列和编码的相应核苷酸序列如下所示：
MKY1：Gln-Leu-Leu-Glu-Gln-Trp-Asn-Leu-Val
      CAA CTC CTG GAA CAA TGG AAC CTA GTA
MKY2：Trp-Ser-Phe-Asn-Pro-Glu-Thr-Asn-Ile
      TGG TCA TTC AAC CCA GAA ACA AAC ATT
MKY3：Val-Thr-Arg-Pro-Leu-Met-Glu-Ser
      GTG ACC AGA CCG CTC ATG GAA AGT
MKY4：Ser-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ala
      TCT TAT TAC AAA TTA GGA GCG
MKY5：Val-Gly-Thr-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr
      GTA GGC ACT GAT TCA GGT TTT GCT GCA TAC。
把上述人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽应用于制备人类SARS疾病快速诊断多肽芯片：
多肽芯片中的多肽包括前述的五种多肽之一，或每种多肽重复多次的多肽片段之一，或五种多肽片段之间任意组合以酰胺联锁偶联在一起形成的多肽片段之一，或前述各种多肽之间任意组合而成的多肽组合物。
制备人类SARS诊断多肽芯片的第一步是五种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的制备。其制备方法有两种：(1)化学合成法：利用CEM生产的微波多肽合成仪(The First Microwave PeptideSynthesizer)，通过固相法合成抗原决定簇多肽，具体方法和步骤见文献(Jonathan M.Collins，Michael J.Collins，Rebecca C.Steorts.Novel Method for Solid Phase Peptide Synthesis Using MicrowaveEnergy.Prensented at American Peptide Symposium，July，2003)。各种肽的纯度用薄层色谱和反相高效液相色谱进行评定，并测定抗原多肽的浓度。(2)利用重组DNA技术原核表达法：利用重组DNA技术构建重复抗原多核苷酸序列的表达载体(图4)，利用原核表达系统，高效表达抗原决定簇多肽，经过表达产物的后加工和纯化，制备抗原决定簇多肽。
制备人类SARS诊断多肽芯片的第二步，是利用多肽点样仪将前述多肽芯片中的多肽点样在硝酸纤维素膜上面，并通过固定Buffer将该多肽固定在膜上，制成人类SARS疾病诊断芯片。
使用上述人类SARS诊断多肽芯片来诊断人类SARS疾病的操作程序和基本方法如图3所示。将该膜芯片应用于中国广东深圳市的SARS病人阳性血清，在10份阳性血清和10份阴性血清的对照实验中，发现诊断膜芯片上五个肽位点均能与阳性血清反应，而阴性血清(包括乙肝、甲肝等患者和正常人的血清)则没有出现五个位点同时反应的情况。这说明本发明的诊断膜芯片在SARS诊断中的准确率是非常高的。
把本发明的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽应用于制备人类SARS病毒多肽疫苗：
如前所述，本发明的五种抗原决定簇多肽可直接合成或通过融合蛋白制得，这类肽基本上不含SARS病毒原的其它蛋白及感染体本身，因此可把它用作疫苗而不担心传入疾病。本发明的多肽疫苗包括前述的五种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽之一，或每种多肽重复多次的多肽片段之一，或五种多肽片段之间任意组合以酰胺联锁偶联在一起形成的多肽片段之一，或前述各种多肽之间任意组合而成的多肽组合物，以及合适的载体或佐剂。
用25μg人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽组合物(由五种多肽同比例组成)和等量的CpG单核苷酸(5`-tcc atg acg ttc acgtt-3`)混合，免疫6周的BALB/c雌鼠，免疫2周后用25μg多肽组合物和等量的CpG单核苷酸再进行一次加强免疫，免疫两周后从小鼠的心脏中采血，并进行血清学分析。结果表明：免疫动物有高滴度的IgG抗体产生。本发明的人类SARS抗原决定簇多肽无论是免疫融合多肽还是合成肽，均显示出了一定程度的免疫力，能充分诱发产生中和SARS病毒抗体，因此本发明的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽组合物用作疫苗，可用于人类免疫抵抗SARS病毒感染。
本发明的抗原决定簇多肽、每种多肽重复多次的多肽片段、五种多肽片段之间任意组合以酰胺联锁偶联在一起形成的多肽片段在作为疫苗时常常与诸如双偶氮化的联甲苯键等相关载体物质结合，也可与诸如弗氏佐剂、德氏佐剂等组合，成为疫苗组合物以提高抗原多肽的免疫效果。
编码上述人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的多核苷酸序列及与该多核苷酸互补的多核苷酸序列，均可应用于制备人类SARS诊断核苷酸芯片以及应用于制备人类SARS核苷酸疫苗。多核苷酸的合成方法及核苷酸诊断芯片及核苷酸疫苗的制备方法均为成熟的技术。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是SARS病毒表面膜蛋白的亲水性分析图。
图2是使用DOT-ELISA在人类SARS病毒表面膜蛋白肽链库中筛选的B细胞表位图。
图3是用本发明的SARS诊断多肽芯片诊断SARS疾病的操作程序与方法流程图。
图4是用于人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽原核表达的大肠杆菌表达质粒pET-H2的结构示意图。
图5本发明实施例中SARS快速诊断多肽芯片的正面结构图。
图6是本发明实施例中用SARS诊断多肽芯片检测结果示意图。
一、人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的制备：
本实施例采用化学合成法制备本发明的人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽。化学合成法是利用CEM公司生产的The FirstMicrowave Peptide Synthesizer，通过Fmoc固相法合成抗原决定簇多肽，具体方法和步骤见文献(Jonathan M.Collins，MichaelJ.Collins，Rebecca C.Steorts.Novel Method for Solid PhasePeptide Synthesis Using Microwave Energy.Prensented atAmerican Peptide Symposium，July，2003)。
本发明也可以利用重组DNA技术原核表达法制备人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽。具体步骤如下：根据五种SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，获得相应的五种核苷酸序列，在五种核苷酸序列两端加上NheI和SpeI的核酸内切酶限制位点，通过DNA合成仪分别合成多核苷酸片段，酶切后，将每一种片段定向克隆到大肠杆菌表达质粒pET-H2中，然后利用NheI和SpeI酶切后的粘性突出未端均为CATG的特点，在该质粒上构建多串重复片段序列，经测序确认，质粒转化大肠杆菌E.coli BL21，培养诱导，获得的重组产物为带His-tag的多串抗原表位多肽的融合肽链，通过亲和层析纯化获得五种SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇重复多次的多肽，根据进一步的应用需求，制备成SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽或重复多次的多肽片段，并利用高压液相色谱和质谱测定分离鉴定重组表达的五种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽。
二、将人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽制备成SARS诊断多肽膜芯片：
上一步通过化学合成法得到纯度为95％的五种抗原决定簇多肽，将其用多肽固定缓冲液(组成成分为：Na₂CO₃ 795g+NaHCO₃1.465g+NaN₃ 0.1g+500ml水)溶解，并使多肽浓度稀释到1μg/μl。利用多肽点样仪将SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽点样在带方格的长方形硝酸纤维素膜上面，每个样品点1μl，每次点样后在室温下放置数分钟，让膜片自然干燥后再进行第二次点样，重复3次，制成SARS诊断多肽膜芯片，如图5所示。图5中标号1至5分别表示MKY1、MKY2、MKY3、MKY4、MKY5五种人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽，6为阳性对照，为人免疫球蛋白，7为阴性对照。
三、SARS诊断多肽膜芯片的使用：
在SARS诊断多肽膜芯片使用前，先用封闭缓冲液(BlockingBuffer)即5％的除脂奶粉对膜片上的多肽进行封闭，用冲洗缓冲液(Washing Buffer)(主要组分为：PBS(pH 7.4)+0.05％tween20)冲洗三遍，每次5分钟。在37℃条件下与疑似病人血清1ml孵化1小时，再用Washing Buffer冲洗三次，每次5分钟。在37℃条件下与辣根过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白(1μg/μl)孵化1小时，用Washing Buffer冲洗三次，每次5分钟，用邻苯二氨(DAB)发色，并用双蒸水冲洗，观察反应结果。将该膜芯片应用于中国广东深圳市的SARS阳性血清库，在10份阳性血清和10份阴性血清的对照实验中，发现诊断膜芯片上五个肽位点均能与阳性血清反应，而阴性血清(包括乙肝、甲肝等患者和正常人的血清)则没有出现五个抗原表位多肽同时反应的情况，结果如图6所示，图6中黑色斑点表示阳性结果，绿色斑点表示阴性结果。这说明本发明的诊断膜芯片在SARS诊断中特异性地识别SARS感染者血清，是SARS诊断和鉴别诊断的有效方法。
四、将人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽制备成人类SARS病毒抗原多肽疫苗及其免疫方法：
用25μg人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽组合物(由五种多肽同比例组成)，加入细菌非甲基化含CpG的单核苷酸(5`-tccatg acg ttc acg tt-3`)组分制成疫苗组合物，其具体配方如下：SARS表面膜蛋白抗原多肽组合物25ug与CpG单核苷酸25ug混合制成疫苗组合物，免疫6周的BALB/c雌鼠一次后，等两周时间，再加强免疫一次，免疫两周后从小鼠的心脏中采血，并进行血清学分析。结果表明：免疫动物有高滴度的IgG抗体产生。
                       氨基酸和核苷酸序列表
  <110>深圳大学、深圳市疾病控制中心
  <120>人类SARS病毒表面膜蛋白抗原决定簇多肽组合物及其在制备诊断芯片和疫苗上的应
  用
  <160>5
  <210>1
  <211>9(氨基酸序列)；27(核苷酸序列)
  <212>PRT；RNA
  <213>人类SARS冠状病毒(SARS coronavirus Urbani)
  <400>1
  Gln Leu Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val
  1                5
1 caa ctc ctg gaa caa tgg aac cta gta 27
  <210>2
  <211>9(氨基酸序列)；27(核苷酸序列)
  <212>PRT；RNA
  <213>人类SARS冠状病毒(SARS coronavirus Urbani)
  <400>2
  Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile
  1                5
1 tgg tca ttc aac cca gaa aca aac att 27
  <210>3
  <211>8(氨基酸序列)；24(核苷酸序列)
  <212>PRT；RNA
  <213>人类SARS冠状病毒(SARS coronavirus Urbani)
  <400>3
  Val Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser
  1                  5
1 gtg acc aga ccg ctc atg gaa agt 24
  <210>4
  <211>7(氨基酸序列)；21(核苷酸序列)
  <212>PRT；RNA
  <213>人类SARS冠状病毒(SARS coronavirus Urbani)
  <400>4
  Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala
  1                     5
  1 tct tat tac aaa tta gga gcg 21
  <210>5
  <211>10(氨基酸序列)；30(核苷酸序列)
  <212>PRT；RNA
  <213>人类SARS冠状病毒(SARS coronavirus Urbani)
  <400>5
  Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr
  1                 5
1 gta ggc act gat tca ggt ttt gct gca tac 30