VEGF多态性和抗血管发生疗法
本申请是申请日为2008年11月26日、中国申请号为200880125826.3、发明名称为“VEGF多态性和抗血管发生疗法”的发明申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2007年11月30日提交的美国临时申请No.60/991,616和2008年3月21日提交的美国临时申请No.61/038,699的权益，通过述及将其公开内容完整收入本文。
生物材料的保藏
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852,USA)(ATCC)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
杂交瘤，A4.6.1(抗-hVEGF) 1991年03月29日 ATCC HB-10709
发明领域
一般而言，本申请涉及与抗血管发生疗法有关的人类疾病和病症的治疗。具体而言，本发明涉及癌症的抗血管发生疗法，其或是单独施用的或是与其它抗癌疗法组合施用的。
发明背景
癌症仍然是人类健康的最致命威胁之一，在美国每年影响超过1百万新患者。实体瘤对那些死亡大多负有责任。虽然某些癌症的医学治疗取得了显著进展，但是当前的治疗方法相对没有选择性：手术切除患病组织；放射疗法缩小实体瘤；及化学疗法杀死正在快速分裂的细胞。这些治疗方法可导致众多副作用，在有些情况中严重到限制可给予的剂量并如此排除潜在有效药 物的使用。
血管发生是重要的细胞事件，其中血管内皮细胞增殖、消减和重新组织，从而从现有的血管网络形成新血管。血管发生对于大多数原发瘤的生长及其后续转移是至关重要的。血管内皮细胞生长因子(VEGF)，也称作VEGF-A或血管通透因子(VPF)，被报道成正常和异常血管发生二者的枢轴调节物。Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77:527-543。
抗VEGF抗体“贝伐单抗”(Bevacizumab)，也称作“BV”、“rhuMAb VEGF”、或![]()
是依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的一种重组人源化抗VEGF单克隆抗体，当前在美国获得批准用于治疗转移性结肠直肠癌、非小细胞肺癌、和转移性乳腺癌。与其它癌症治疗方法一样，![]()
疗法与某些副作用有关，包括升高的高血压的风险。
当特定基因中的不同等位基因导致不同表型时，群体中存在遗传多态性。此类多态性可以在决定治疗性药物的功效和安全性中发挥作用。例如，已经显示了VEGF中的特定多态性与乳腺癌的发病率有关。Schneider et al.(2008)Breast Cancer Research and Treatment 111:157-63。
别的预示特定疗法的功效或安全性的多态性的鉴定可用于更好地为那些会最佳地受益于该疗法的患者调整该疗法。
发明概述
本发明部分基于VEGF中如下的多态性的鉴定，所述多态性在正在经历抗VEGF疗法(包括用![]()
)的患者中预示升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性和/或升高的高血压的风险。
一方面，本发明提供一种预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选选自VEGF(-1498C/T)和VEGF(-634G/C)的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-1498C)或VEGF(-634G)，则患者处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。在一些实施方案中，所述治疗进一步包括施用抗肿瘤组合物。在一些实施方案中，所述患者正在治疗癌症，例如乳腺癌。
另一方面，本发明提供一种用于预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗 剂治疗有关的高血压的风险的试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸：VEGF(-1498C/T)和VEGF(-634G/C)。在一些实施方案中，所述试剂盒中的所述寡核苷酸对于扩增VEGF中包含这些多态性之一的区域是有用的。
另一方面，本发明提供一种预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(-2578C/A)或VEGF(-1154G/A)处的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-2578AA)或VEGF(1154AA)，则患者具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。在一些实施方案中，所述治疗进一步包括施用抗肿瘤组合物。在一些实施方案中，所述患者正在治疗癌症，例如乳腺癌。
另一方面，本发明提供一种用于预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸：VEGF(-2578C/A)和VEGF(-1154G/A)。在一些实施方案中，所述试剂盒中的所述寡核苷酸对于扩增VEGF中包含这些多态性之一的区域是有用的。
本发明涉及下述各项。
1.一种预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(-1498C/T)处的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-1498C)，则患者处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。
2.一种预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(-634G/C)处的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-634G)，则患者处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。
3.项1或2的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
4.项3的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
5.项1或2的方法，其中所述患者正在用VEGF拮抗剂治疗癌症。
6.项5的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
7.项5的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
8.项5的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
9.项8的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
10.项8的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
11.一种用于预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸：VEGF(-1498C/T)和VEGF(-634G/C)。
12.项11的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸可用于扩增包含VEGF中选自下组的多态性的部分VEGF基因：VEGF(-1498C/T)和VEGF(-634G/C)。
13.一种预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(-2578C/A)处的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-2578AA)，则患者具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性。
14.一种预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(-1154G/A)处的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-1154AA)，则患者具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性。
15.项13或14的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
16.项15的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
17.项13或14的方法，其中所述患者用VEGF拮抗剂治疗癌症。
18.项17的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
19.项17的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
20.项17的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
21.项20的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
22.项20的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
23.一种用于预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸：VEGF(-2578C/A)和VEGF(-1154G/A)。
24.项11的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸可用于扩增包含VEGF中选自下组的多态性的部分VEGF基因：VEGF(-2578C/A)和VEGF(-1154G/A)。
发明详述
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版(Sambrook et al.,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编,1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.编,1987,及其周期性的更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”(Mullis et al.编,1994)。
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导：Singleton et al.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第二版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure,第四版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)。
通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)。
定义
如本文中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”、“该”包括复数，除非上下文另有明确说明。例如，“一个/种”细胞还会包括“多个/种细胞”。
术语“包含”意图指组合物和方法包括所叙述的要件，但是不排除其它要件。
术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.,Science 246:1306(1989)和Houck et al.,Mol.Endocrin.5:1806(1991)所述，及其天然存在等位形式和加工形式。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式的VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第 17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
“VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为bevacizumab(贝伐单抗；BV；![]()
)的抗体。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与一种或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、受体分子及特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。
术语“抗体”以最广义使用，包括单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)或Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
“病症”指任何会受益于使用抗体的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤；神 经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎症疾病、血管发生性疾病和免疫学病症。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估总体存活(OS)、无进展存活(PFS)、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。
术语“抗肿瘤组合物”指在治疗癌症中有用的组合物，其包含至少一种能够抑制或阻止肿瘤生长或功能和/或引起肿瘤细胞破坏的活性治疗剂。适合在 抗肿瘤组合物中用于治疗癌症的治疗剂包括但不限于化疗剂、放射性同位素、毒素、细胞因子诸如干扰素、和靶向细胞因子、细胞因子受体或与肿瘤细胞有关的抗原的拮抗剂。优选的是，所述治疗剂是化疗剂。
“化疗剂”指在癌症治疗中有用的化学化合物。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与多肽核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“多态性”指基因的序列中在群体内变化的位置。多态性由不同的“等位基因”构成。这样的多态性的位置通过其在基因中的位置及在那里找到的不同碱基来鉴别。例如，VEGF-1498C/T指示VEGF基因中第-1498位处有C和T之间的变异。这两种可能的变体(C和T)是两种不同等位基因。因为基因型由两种分开的等位基因构成，所以在任何一名个体中可观察到数种可能变体之任一(例如，这个例子是CC、CT、或TT)。
术语“基因型”指细胞或组织样品中某种基因的特定等位基因。在上文的例子中，CC、CT、或TT是VEGF-1498C/T多态性处可能的基因型。
术语“样品”包括取自患者的细胞或组织样品。例如，样品可包括肿瘤样品、与肿瘤类型对应的正常组织的样品、取自肿瘤周围区域的组织样品、或血细胞。
样品中特定基因型的鉴定可通过本领域技术人员公知的多种方法任一来实施。例如，使用本领域公知的技术，通过克隆等位基因并对它测序，可实现多态性的鉴定。或者，可以自基因组DNA扩增基因序列，例如使用PCR，并对产物测序。下文描述了用于对患者DNA分析给定遗传基因座处突变的数种非限制性方法。
可使用DNA微阵列技术，例如DNA芯片装置和用于高通量筛选应用的高密度微阵列和低密度微阵列。用于制作微阵列的方法是本领域已知的，而且包括各种喷墨(inkjet)和微量喷射沉积(microjet deposition)或点样(spotting)技术和工艺、原位或芯片上光刻(photolithographic)寡核苷酸合成工艺、和电子DNA探针寻址工艺。DNA微阵列杂交应用已经在基因表达分析及短串联 重复(STR)、单核苷酸多态性(SNP)、点突变的基因型分析领域中成功应用。别的方法包括干扰RNA微阵列及微阵列与其它方法诸如激光捕捉显微解剖(LCM)、比较性基因组杂交(CGH)和染色质免疫沉淀(ChiP)的组合。参见例如He et al.(2007)Adv.Exp.Med.Biol.593:117-133和Heller(2002)Annu.Rev.Biomed.Eng.4:129-153。其它方法包括PCR、xMAP、侵入者测定法、质谱术、和焦磷酸测序(Wang et al.(2007)593:105-106)。
另一种检测方法是使用与多态性位点交叠且在多态性区域周围具有约5个、或约10个、或约20个、或约25个、或约30个核苷酸的探针的等位基因特异性杂交。例如，将能够特异性杂交至等位变体的数种探针附着至固相支持物，例如“芯片”。可以通过多种工艺(包括平板印刷术(lithography))将寡核苷酸结合至固体支持物。使用这些包含寡核苷酸的芯片(也称作“DNA探针阵列”)的突变检测分析记载于例如Cronin et al.(1996)Human Mutation 7:244。
在其它检测方法中，必须首先至少扩增基因的一部分，之后鉴定等位变体。扩增可通过例如PCR和/或LCR或本领域公知的其它方法来实施。
在一些情况中，来自受试者的DNA中特定等位基因的存在可通过限制酶分析来显示。例如，特定核苷酸多态性可导致包含限制性位点的核苷酸序列，该限制性位点在其它等位变体的核苷酸序列中不存在。
在又一个实施方案中，可使用针对切割剂(诸如核酸酶、羟胺或四氧化锇及哌啶)的保护来检测RNA/RNA、DNA/DNA、或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基(参见例如Myers et al.(1985)Science 230:1242)。一般而言，“错配切割”技术如下开始，即提供通过将包含基因等位变体核苷酸序列的对照核酸(任选经过标记的，例如RNA或DNA)与自组织样品获得的样品核酸(例如RNA或DNA)杂交而形成的异源双链体。用切割双链体中单链区的试剂处理双链的双链体，其中双链体诸如基于对照和样品链间碱基对错配形成的双链体。例如，可以用RNA酶处理RNA/DNA双链体、用S1核酸酶处理DNA/DNA杂合物以酶促消化错配区域。或者，可以用羟胺或四氧化锇及哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区域。在消化错配区域后，在变性聚丙烯酰胺凝胶上根据大小将所得材料分开以确定对照和样品核酸是否具有相同核苷酸序列或它们有哪些核苷酸不同。参见例如美国专利No.6,455,249；Cotton et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397；Saleeba et al. (1992)Meth.Enzymol.217:286-295。
电泳迁移率的改变也可用于鉴定特定等位变体。例如，可使用单链构象多态性(SSCP)来检测突变型与野生型核酸之间的电泳迁移率差异(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 86:2766；Cotton(1993)Mutat.Res.285:125-144和Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9:73-79)。将样品和对照核酸的单链DNA片段变性并让其复性。单链核酸的二级结构随序列而变化，所得电泳迁移率改变能够检测甚至单个碱基的变化。DNA片段可以标记或用经过标记的探针检测。通过使用RNA(而非DNA)，其中二级结构对序列中的变化更加敏感，可增强该测定法的灵敏度。在另一个优选的实施方案中，该方法基于电泳迁移率变化利用异源双链体分析将双链异双链体分子分开(Keen et al.(1991)Trends Genet.7:5)。
等位变体的身份还可如下获得，即分析包含多态性区域的核酸在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动，这使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)来测定(Myers et al.(1985)Nature 313:495)。当使用DGGE作为分析方法时，会修饰DNA以确保它不会完全变性，例如通过PCR添加解链温度高的、富含GC的DNA的大约40bp的GC夹。在另一个实施方案中，使用温度梯度代替变性剂梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys.Chem.265:1275)。
用于检测2条核酸间至少一个核苷酸的差异的技术的例子包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增、或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸探针，其中将已知的多态性核苷酸放置在中心(等位基因特异性探针)，然后在只在找到完美匹配才容许杂交的条件下杂交至靶DNA(Saiki et al.(1986)Nature 324:163)；Saiki et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230)。此类等位基因特异性寡核苷酸杂交技术可用于检测基因多态性区域中的核苷酸变化。例如，将具有特定等位变体核苷酸序列的寡核苷酸附着至杂交膜，然后将此膜与经过标记的样品核酸杂交。然后，对杂交信号的分析会揭示样品核酸的核苷酸的身份。
或者，可以与本发明组合使用依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术。作为引物用于特异性扩增的寡核苷酸可以在分子的中心中(使得扩增依赖于差异杂交)(Gibbs et al.(1989)Nucl.Acids Res.17:2437-2448)或在一条引物的3’末端尽头处(在适宜的条件下，可防止错配或缩短聚合酶延伸) (Prossner(1993)Tibtech 11:238和Newton et al.(1989)Nucl.Acids Res.17:2503)携带感兴趣等位变体。此技术也称作“PROBE”，即探针寡聚物碱基延伸(Probe Oligo Base.Extension)。另外，可能想要在突变区域中引入新的限制性位点以创建基于切割的检测(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell.Probes 6:1)。
在另一个实施方案中，等位变体的鉴定使用寡核苷酸连接测定法(OLA)来进行，如例如美国专利No.4,998,617及Laridegren,U.et al.Science 241:1077-1080(1988)中所记载的。OLA方案使用设计成能够杂交至靶物单链邻接序列的两种寡核苷酸。将所述寡核苷酸之一连接至分离标志，例如生物素化的，并可检测标记另一寡核苷酸。如果在靶分子中找到精确互补的序列，那么所述寡核苷酸会杂交，使得它们的末端邻近，并创建连接底物。然后连接容许经过标记的寡核苷酸使用亲合素或其它生物素配体来回收。Nickerson,D.A.等人描述了组合PCR和OLA特性的核酸检测测定法(Nickerson,D.A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8923-8927)。在此方法中，使用PCR来实现靶DNA的指数扩增，然后使用OLA来检测。
本发明提供用于检测VEGF中单核苷酸多态性(SNP)的方法。因为单核苷酸多态性侧翼为不变序列的区域，所以它们的分析只需要检测单个变异核苷酸的身份，而且不必为每名患者测定完整基因序列。已经开发了数种方法来推动SNP的分析。
通过使用专门化外切核酸酶抗性核苷酸，可检测单碱基多态性，如例如美国专利No.4,656,127中所披露的。依照该方法，容许与紧挨多态性位点3’的等位序列互补的引物杂交至自特定动物或人获得的靶分子。如果靶分子上的多态性位点含有与存在的特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物会掺入到杂交引物的末端上。此类掺入使得引物对外切核酸酶有抗性，并由此容许其检测。因为样品中外切核酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物变得对外切核酸酶有抗性的发现揭示靶分子的多态性位点中存在的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物互补。此方法的优点在于它不需要测定大量的无关序列数据。
一种基于溶液的方法也可用于测定多态性位点的核苷酸的身份(WO 91/02087)。如上所述，采用与紧挨多态性位点3’的等位序列互补的引物。该方法使用经过标记的双脱氧核苷酸衍生物来测定该位点的核苷酸的身份，如果与多态性位点的核苷酸互补的话，该双脱氧核苷酸衍生物会掺入到所述引 物的末端上。
一种备选方法记载于WO 92/15712。此方法使用经过标记的终止物和与多态性位点3’的序列互补的引物的混合物。所掺入的经过标记的终止物由所评估的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸决定且与该核苷酸互补。该方法通常是异相测定法，其中将引物或靶分子固定化至固相。
用于测定DNA中多态性位点的许多其它引物指导核苷酸掺入规程已有记载(Komher,J.S.et al.(1989)Nucl.Acids.Res.17:7779-7784；Sokolov,B.P.(1990)Nucl.Acids Res.18:3671；Syvanen,A.-C.,et al.(1990)Genomics 8:684-692；Kuppuswamy,M.N.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143-1147；Prezant,T.R.et al.(1992)Hum.Mutat.1:159-164；Ugozzoli,L.et al.(1992)GATA 9:107-112；Nyren,P.et al.(1993)Anal.Biochem.208:171-175)。这些方法都依赖于掺入经过标记的脱氧核苷酸以区分多态性位点处的碱基。
此外，可以理解，上述任何用于检测多态性变体或基因产物或基因改变的方法可用于监测疗程或疗法。
本文所述方法可以通过例如利用预包装的诊断试剂盒来实施，诸如下文所描述的那些，其包含至少一种探针或引物核酸，它们可方便地用于例如测定受试者是否处于形成与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。
供上述诊断和预后方法中使用的样品核酸可以自任何细胞类型或受试者组织获得。例如，可以通过已知技术获得受试者的体液(例如血液)。或者，可以对干样品(例如毛发或皮肤)实施核酸测试。
本文所述发明涉及用于测定和鉴定VEGF基因座处存在的等位基因的方法和组合物。此信息对于预测形成与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险水平是有用的。探针可用于直接测定样品的基因型，或者可以与扩增同时或序贯使用。术语“探针”包括天然存在的或重组的单链或双链核酸或化学合成的核酸。它们可以通过切口平移(nick translation)、Klenow补平反应、PCR或本领域知道的其它方法来标记。本发明的探针、它们的制备和/或标记记载于Sambrook et al.(1989)见上文。探针可以是适合于选择性杂交至含有本发明多态性区域的核酸的任何长度多核苷酸。所使用的探针的长度会部分取决于所使用的测定法的性质和所采用的杂交条件。
经过标记的探针还可以与多态性的扩增联合使用(Holland et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280)。美国专利No.5,210,015记载了用于在PCR期间提供扩增产物实时测量的基于荧光的办法。此类办法或是采用嵌入染料(诸如溴化乙啶)来指示存在的双链DNA的量，或是采用含有荧光-淬灭剂对的探针(也称作“Taq-Man”法)，其中探针在扩增期间遭到切割以释放荧光分子，其浓度与存在的双链DNA的量成正比。在扩增期间，当杂交至靶序列时，探针受到聚合酶的核酸酶活性的消化，从而释放荧光分子，与淬灭剂分子分开，由此引起来自报告分子的荧光出现。Taq-Man法使用与靶多核苷酸含有多态性的区域退火的含有报告分子-淬灭剂分子对的探针。
可以将探针附着于表面，以用作“基因芯片”。通过本领域技术人员知道的多种技术，此类基因芯片可用于检测遗传变异。在一种技术中，在基因芯片上排列寡核苷酸，通过以杂交法进行的测序，诸如美国专利No.6,025,136和6,018,041中概述的，用于测定DNA序列。还可以将本发明的探针用于遗传序列的荧光检测。此类技术已有记载，例如美国专利No.5,968,740和5,858,659。还可以将探针附着于电极表面，用于核酸序列的电化学检测，诸如美国专利No.5,952,172及Kelley,S.O.et al.(1999)Nucl.Acids Res.27:4830-4837中所记载的。
另外，可修饰用于探针或引物的分离的核酸以使其变得更加稳定。例示性的修饰的核酸分子包括DNA的氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphothioate)和甲基膦酸酯(methylphosphonate)类似物(还可参见美国专利No.5,176,996；5,264,564和5,256,775)。
如上所述，本发明还提供用于测定VEGF中存在的多态性区域的等位变体类型的诊断方法。在一些实施方案中，所述方法使用包含与该VEGF多态性区域互补的核苷酸序列的探针或引物。因而，本发明提供用于实施这些方法的试剂盒。
在一些实施方案中，本发明提供用于测定受试者是否处于形成与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供用于测定受试者是否具有受益于抗VEGF疗法的较大可能性的试剂盒。此类试剂盒含有一种或多种上文所述组合物和使用说明书。仅作为例子，本发明还提供用于测定患者是否处于形成与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的试剂盒，包含对例如下述VEGF多态性区域特异性的第一和第二寡核苷酸：VEGF(-2578C/A)、VEGF(-1498C/T)、VEGF(-1154G/A)或VEGF(-634G/C)。 又例如，本发明还提供用于确定受试者是否具有受益于抗VEGF疗法的较大可能性的试剂盒，包含对例如下述VEGF多态性区域特异性的第一和第二寡核苷酸：VEGF(-2578C/A)或VEGF(-1154G/A)。“对(遗传基因座)特异性的”寡核苷酸结合所述基因座的多态性区域或在所述基因座的多态性区域的附近结合。对于要用作扩增引物的寡核苷酸，若引物足够接近以用于生成包含多态性区域的多核苷酸，则说它们是附近的。在一个实施方案中，若寡核苷酸在距离多态性约1-2kb内，例如少于1kb结合，则说它们是附近的。特异性的寡核苷酸能够杂交至序列，而且在合适的条件下会不结合相差单个核苷酸的序列。
试剂盒可包含至少一种能够特异性杂交至VEGF多态性区域的探针或引物和使用说明书。所述试剂盒通常包含至少一种上文所述核酸。用于扩增VEGF至少一部分的试剂盒一般包含两种引物，其中至少一种能够杂交至等位变体序列。此类试剂盒适合于通过例如荧光检测、电化学检测、或其它检测来检测基因型。
试剂盒中所包含的寡核苷酸(用作探针或引物)可以可检测标记。标记物可以直接(例如荧光标记物)或间接检测。间接检测可包括本领域技术人员知道的任何检测方法，包括生物素-亲合素相互作用、抗体结合等等。荧光标记的寡核苷酸还可包含淬灭分子。寡核苷酸可结合至表面。在一些实施方案中，所述表面是硅土或玻璃。在一些实施方案中，所述表面是金属电极。
本发明的其它试剂盒包含实施所述测定法所必需的至少一种试剂。例如，所述试剂盒可包含酶。或者，所述试剂盒可包含缓冲液或任何其它必需试剂。
试剂盒可包括本文中为测定受试者在VEGF多态性区域中的基因型而描述的所有或一些阳性对照、阴性对照、试剂、引物、测序标志物、探针和抗体。
下面的实施例仅仅意图例示本发明的实践，而非作为限制而提供。通过述及明确收录将本文中所引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。
实施例
实施例1：VEGF中的遗传多态性及它们与后果的关联
E2100是一项III期组间试验，其在将贝伐单抗添加至帕利他塞(paclitaxel) 来治疗具有先前未治疗的转移性乳腺癌的女性时证明了无进展存活(PFS)和响应率(RR)的改善。在接受贝伐单抗的女性中看到了显著更多的高血压和蛋白尿。
样品
我们对来自E2100乳腺癌Avastin试验的数据实施了回顾测试。该数据集包括673名符合条件的患者及623例疾病进展事件和483例死亡。其中，我们对来自363例符合条件的病例(随访中值43个月)的石蜡包埋肿瘤块测定了基因型。另外，377例符合条件的病例可用于VEGF IHC，而341例可用于VEGFR-2IHC。所有标本是在没有患者标识符或临床结果信息的情况中“盲”分析的。
多态性
表1显示了我们所测试的多态性。
表1：所测试的单核苷酸多态性(SNP)
![]()
选择这些多态性是因为已知这些基因调控血管发生：1)它们涉及血管发生途径；2)它们具有已确立的遗传多态性；3)多态性的频率足够高，使得在群体水平它对药物响应的影响会是有意义的；和/或4)该多态性能以生物学有关方式改变基因的功能。
测定SNP的基因型
使用![]()
组织试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)自20微米石蜡包埋组织切片提取DNA。通过基于![]()
的实时PCR测定SNP的基因型。每处SNP的详情先前已记载于Schneider,et al.(2007)“Association of polymorphisms of angiogenesis genes with breast cancer.”Breast Cancer Res.Treat。总之，在88.2％的病例中成功测定了基因型。这基于所分析的SNP而变化，而且范围为82％至92％的成功率。对于所组合的所有SNP，精确地评估了来自对照组的50％和来自组合组的50％。
蛋白质表达的评估
通过来自所提交的肿瘤块的IHC，评估了VEGF和VEGFR-2二者的蛋白质表达。对于VEGF评估，将载玻片脱石蜡，再水化并在装有pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液的蒸锅(vegetable steamer)中放置30分钟。在载玻片冷却至室温后，将它们在蒸馏水中清洗两次，接着在含0.05％TweenTM20(Fisher Scientific,Pittsburgh PA)的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中清洗两次。然后将载玻片放置在Dako自动染色仪(Dako Cytomation,Carpinteria CA)上。将载玻片与过氧化物酶封闭液(Dako,S2001)一起温育10分钟，接着用PBST清洗三次，总共最少10分钟。然后将载玻片序贯地与1:100稀释的抗VEGF抗体(VG1,Lab Vision,Fremont CA)(60分钟)、Dako Envision+(Dako,K4001)(60分钟)和DAB底物-色原体系统(Dako,K3466)一起温育，各步骤间用PBST清洗三次。将载玻片用Harris苏木精(Fisher)复染色，脱水，清洁并和盖上盖玻片。通过对整个载玻片评估具有胞质VEGF染色的侵入性肿瘤细胞的百分比来计算VEGF–inv得分。
对于VEGFR-2IHC，将福尔马林固定、石蜡包埋的乳房肿瘤切片首先脱石蜡并再水化。接着，在pH 9.0的靶物修复液(S2367,Dako,Carpenteria,CA)中于98℃执行抗原修复20分钟。然后于室温应用双重内源酶封闭液(K4065,EnVisionTM+Dual Link System-HRP,Dako)5分钟。于室温以1:20施用抗VEGFR-2克隆55B11家兔单克隆抗体(#2479,Cell Signaling Tech.,Danvers,MA.)2小时。通过EnVision+试剂盒的方案及略微改动来进行DAB的信号发生。复染色用苏木精QS(H-3404,Vector,Burlingame,CA)进行，接着是脱水和盖盖玻片。人胎盘或肝切片用作阳性对照。省略一抗和用家兔IgG(X0936,Dako)替代充当阴性对照。用H-得分法进行评分，如下计算：Σ(u xα)，其中u是染色强度(0至3+)，而α是以每种强度染色的肿瘤细胞的百分比(0至100)(ref)。
统计学
使用Kaplan-Meier分析来评估事件-时间分布。使用Cox的比例危害法来 评估基因型与时间对事件结果(PFS和OS)的关联。基于多重比较的Bonferroni修正，显著性水平＝0.017对应于每项多态性的总体I型出错率0.05。假设所有比较是独立的，鉴于每项比较的1.7％假阳性率，在21项比较中发生至少一例假阳性的概率是约0.3。使用Fisher的精确检验以显著性水平p＝0.05来评估基因型与RR(定义为完全响应/部分响应对病情稳定/病情进展)和毒性(3/4级高血压)的关联。使用Kruskal-wallis检验来研究基因型与表达的关联。对于RR和毒性，假设所有比较是独立的，鉴于每项比较的5％假阳性率，在7项比较中发生至少一例假阳性的概率是约0.3。分别使用Cox的比例危害法和Wilcoxon秩和检验来评估表达与时间对事件结果(PFS和OS)和RR的关联。所有p值是双边的。
基因型与功效的关系
如E2100中所评估的，以对照组(单独的帕利他塞)和组合组(帕利他塞和贝伐单抗)二者中的功效比较所有候选基因型(表1)。功效参数包括PFS(E2100的主要终点)、OS、和RR。VEGF-2578AA基因型和VEGF-1154AA基因型为组合组中的患者预测有利的OS(表2)。
表2：VEGF基因型与总体存活(OS)的关系
![]()
![]()
这些基因型没有预测对照组中患者改善的OS，也没有预测任一组中卓越的PFS或RR。因为具有VEGF-2578AA基因型的患者的显著改善，我们与CA和CC组合基因型比较对AA分析了OS，而且这项比较展示了有利于AA基因型的危害比0.58(95％C.I.：0.36，0.93；p＝0.023)。相应的PFS比较揭示了有利于VEGF-2578AA基因型的危害比0.91(95％C.I.：0.62，1.35；p＝0.65)。因为VEGF-1154SNP中明显的基因-剂量效应，我们评估了基因-剂量效应，而且这展示了有利于VEGF-1154AA基因型的危害比0.62(95％C.I.：0.46，0.83；p＝0.001)。对PFS同样的基因-剂量分析揭示了有利于VEGF-1154AA基因型的危害比0.79(95％C.I.：0.62，1.02；p＝0.07)(表3)。
表3：VEGF基因型与无进展存活(PFS)的关系
![]()
对照组的总体存活中值为25.2个月，而组合组为26.7个月。组合组中VEGF-2578AA和VEGF-1154AA基因型的总体存活显著更长，分别为37.0个月和46.5个月。
我们还组合VEGF-2578和VEGF-1154的所有基因型并评估与总体存活的关联。有9种可能的组合，其中4组具有3例或更少的病例，因此被排除在分析之外。对剩余5组分析与存活的关系(表4)。在比较VEGF-2578/-1154AA/AA基因型与所有其它基因型时，总体存活有统计学显著的改善(p＝0.041)。
表4：组合VEGF基因型与总体存活的比较
![]()
![]()
基因型与毒性(3/4级高血压)的关系
将所有候选基因型(表1)与最常见、显著的毒性，即3/4级高血压(根据常用毒性标准)比较。在总试验(parent trial)中接受贝伐单抗的所有患者超过15％经历了3/4级高血压。我们在试验组中观察到，VEGF-1498C/T和-634G/C二者处的特定等位基因与3/4级高血压有关。在与备选基因型相比时，VEGF-634CC和VEGF-1498TT基因型与较少的3/4级高血压(分别为8％和0％)有强关联(表5)。与CA(21％)和AA(22％)基因型相比时，VEGF-2578CC基因型(12％)中有数目较少的高血压，但是这没有达到统计学显著性(p＝0.32)。在比较VEGF-2578CC与组合备选基因型(CA/AA)时，有关联的趋势(p＝0.16)。类似地，与组合备选基因型GA(22％)和GG(27％)相比，VEGF-1154GG基因型具有较少的高血压(14％)，但是这没有达到统计学显著性(p＝0.15)。
表5：VEGF基因型与3/4级高血压的关系
![]()
基因型与表达(IHC)的关系
将所有候选基因型(表1)与VEGF和VEGFR-2二者的原发性肿瘤表达(通过IHC评估)比较。通过VEGF_inv得分评估VEGF表达程度，其中VEGF_inv得分的范围为0至100(基于具有胞质VEGF染色的侵入性细胞的百分比)。通过H得分评估VEGFR-2表达的程度，其中H得分的范围可以是0(未检测到表 达)至300(100％的细胞具有最大的3+表达)。对整个群体，将基因型与VEGF表达比较，而且没有测定到统计学显著关联。对于VEGF-2578基因型，有基因型与VEGF inv得分之间关联的趋势。在与备选基因型(CA＝54(标准偏差＝37)和CC＝61(标准偏差＝37))比较时，AA基因型的得分均值较低(AA＝48(标准偏差＝40))，但是这没有达到统计学显著性(p＝0.08)。VEGF-1154AA基因型也具有比备选基因型(GA＝53(标准偏差＝38)和GG＝58(标准偏差＝37))低的表达均值(AA＝42(标准偏差＝40))，但是这也没有达到统计学显著性(p＝0.13)。无一基因型与VEGFR-2表达有关。
VEGF和VEGFR-2表达与临床后果的关系
将原发性肿瘤表达(通过IHC评估)与E2100中的结果(RR、PFS和OS)比较。在VEGF或VEGFR-2任一表达与结果之间没有统计学显著关联。这在评估对照组、组合组、或整个群组时是真的。