具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制备方法.pdf

本发明公开了一种具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其结构式为右式。本发明还同时公开了该喹啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：1)将保藏号为CGMCC 1330的矮棒曲霉菌株ZJUF0028接种在PDA培养基上避光培养；2)将所得的菌饼接种到内装PDB培养液的三角瓶中，避光培养；3)所得的发酵液依次经乙酸乙酯萃取、旋转蒸干、硅胶柱层析等处理后，得喹啉衍生物粗品。本发明的喹啉衍生物对立枯丝核菌和终极腐霉等均有较好的抗菌活性。

1、  一种具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其特征是其结构式为：


2、  如权利要求1所述具有抗真菌活性的喹啉衍生物的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、将保藏号为CGMCC 1330的矮棒曲霉菌株ZJUF0028接种在PDA培养基上，于20℃～25℃避光培养5天后，用直径为5mm的打孔器切取菌落边缘菌饼；
2)、将菌饼接种到内装PDB培养液的三角瓶中，24～25℃静止避光培养21天；抽滤除去菌丝体后的滤液即为发酵液；
3)、发酵液依次经乙酸乙酯萃取、旋转蒸干得浸膏；将浸膏溶于乙酸乙酯经硅胶柱层析，以体积比为3：100的氯仿和甲醇的混合物作为洗液，所得的洗脱液旋转蒸干，得喹啉衍生物粗品。

3、  根据权利要求2所述具有抗真菌活性的喹啉衍生物的制备方法，其特征是：将喹啉衍生物粗品溶于甲醇中，用高效液相色谱法分离纯化，得喹啉衍生物。

具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，确切地说是一种具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制备方法。
背景技术
从天然产物中发现新型先导化合物，是新药创制的重要途径。微生物是自然界中天然产物的主要来源，植物内生真菌作为其中的一个重要类群，是相对较新的研究领域。内生真菌产生的丰富多样的具多种生物活性的次生代谢产物在现代医药和农药工业中具有重要的应用潜力，它们在抗菌、抗病毒、杀虫、抗肿瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等领域具有广阔的应用前景。典型例子是产生紫杉醇的内生真菌的发现(Stierle et al.，1993)。另一方面依靠植物内生真菌也发现了许多新生物活性物质，如从传统药用植物雷公藤分离到的内生真菌Rhinocladiella sp.可产生3种新松胞菌素(cytochalasin)，对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用(Wagenaar et al，2000)；从青蒿茎干中分离的内生真菌Colletotrichumsp.能产生多种对病原真菌和植物病原细菌有良好抑制作用的化合物，其MIC值一般在25～50μg/L(Lu et al.，2000)。
喹啉是一种重要的杂环化合物，广泛用于医药、染料、农药和化学助剂等领域。喹啉衍生物大都具有生物活性，在医药工业中广泛用作药物的中间体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制备方法，该喹啉衍生物对立枯丝核菌和终极腐霉等均有较好的抗菌活性。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其结构式为：
本发明还同时提供了上述喹啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1)、将保藏号为CGMCC 1330的矮棒曲霉菌株ZJUF0028接种在PDA培养基上，于20℃～25℃避光培养5天后，用直径为5mm的打孔器切取菌落边缘菌饼；
2)、将菌饼接种到内装PDB培养液的三角瓶中，24～25℃静止避光培养21天；抽滤除去菌丝体后的滤液即为发酵液；
3)、发酵液依次经乙酸乙酯萃取、旋转蒸干得浸膏；将浸膏溶于乙酸乙酯经硅胶柱层析，以体积比为3：100的氯仿和甲醇的混合物作为洗液，所得的洗脱液旋转蒸干，得喹啉衍生物粗品。
作为本发明的喹啉衍生物的制备方法的改进：将喹啉衍生物粗品溶于甲醇中，用高效液相色谱法分离纯化，得喹啉衍生物。
本发明首先利用了从南方红豆杉分离得到的内生真菌矮棒曲霉(Aspergillusclavatonanicus Batista et al)菌株ZJUF0028)，该菌株ZJUF0028的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国科学院微生物研究所，保藏日：2005年3月16日，保藏号：CGMCC 1330，保藏名称：矮棒曲霉(Aspergillus clavatonanicus)。其属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌纲Eurotiomycetes，散囊菌目(Eurotiales)，发菌科(Trichocomaceae)，曲霉属(Aspergillus)。
采用本发明方法制备而得的具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其为：3-tert-butyl-6-hydroxy-1-methyl-4，4a，5，6-tetrahydroquinoline-2，7(1H，3H)-dione，其具有抗真菌活性，特别是对立枯丝核菌和终极腐霉具有较好的抗菌活性。由于本发明的喹啉衍生物是一种源自内生真菌的新型的抗真菌化合物，因此本发明能为开发新的抗真菌药物提供研究基础。
具体实施方式
实施例1、菌株的分离培养：
在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的矮棒曲霉。
采集南方红豆杉(Taxus mairei)的树皮及树枝，将树皮及树枝在质量浓度5％次氯酸钠表面消毒2min，无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水，用无菌刀片去除外皮层，并将其切成1cm左右大小组织片，将组织片移接在分别含100μg·ml^-1氨苄青霉素和链霉素的2％水琼脂平板上，24℃培养。
待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基上；连续重复上述的纯化3次，获得纯培养。
将所得的菌株ZJUF0028进行保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2005年3月16日，保藏号：CGMCC 1330。
实施例2、喹啉衍生物的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、将矮棒曲霉菌株ZJUF0028接种在PDA培养基上，于20℃～25℃避光培养5天后，用直径为5mm的打孔器切取菌落边缘菌饼。PDA培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。
2)、将上述直径为5mm的菌饼3粒接入到内装200mL PDB培养基的1000mL三角瓶中，24℃～25℃静止避光培养21天，抽滤，用0.22μm微孔滤膜过滤后所得的滤液即为发酵液。PDB培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L；
3)、发酵液用100mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，在有机相中加入有机相5％～10％重量比的无水硫酸钠干燥；然后用滤纸过滤后，在负压0.08MPa、60℃的条件下旋转蒸发浓缩，以回收有机溶剂乙酸乙酯，得浸膏。
将1g浸膏溶于5mL的乙酸乙酯中，过硅胶柱(H60型，中国青岛海洋化工集团)，以体积比为3：100的氯仿和甲醇的混合物作为洗液，将所得的洗脱液在负压0.08MPa、60℃的条件下旋转蒸发浓缩，得喹啉衍生物粗品。
4)、将50mg喹啉衍生物粗品溶于1mL的甲醇中，采用高效液相色谱法(HPLC)分离纯化，采用Waters色谱柱(Waters sunfire prep C18 5μm 10×250mm)、Waters二元高压梯度泵(1525 binary HPLC pump)，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长为270nm。先用体积浓度10％甲醇冲洗20min后，再用体积浓度85％甲醇冲洗色谱柱；收集洗脱液，分析每管组分，合并峰面积归一含量在95％以上的管子，浓缩至干，得到棕褐色粉末，为3-tert-butyl-6-hydroxy-1-methyl-4，4a，5，6-tetrahydroquinoline-2，7(1H，3H)-dione，即为喹啉衍生物。
经核磁共振和红外、质谱测定，其结构式为：

EIMS确定分子量251.18；红外光谱(KBr)：3340～3300，1730(C＝O)，3060 1645789(环内C＝C)。熔点为49±0.5℃。
实施例3、喹啉衍生物的抗菌活性测定：
以实施例2所得的喹啉衍生物作为检测对象。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
抗真菌活性是以病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、终极腐霉(Pythiumultimum)、甜瓜球腔菌(Mycosphaerella melonis)、齐整小菌核(Sclerotium rolfsii)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为靶标生物，采用生长速率法测定喹啉衍生物对靶标菌的抑制作用。将不同浓度的喹啉衍生物按一定量加入到预先溶化的一定量的PDA培养基中，混匀后倒入直径9mm的培养皿中，制成分别含喹啉衍生物的PDA培养基平板，同时用不含喹啉衍生物的PDA培养基作对照，各种浓度和对照重复3次。用直径5mm的打孔器打出菌丝块放在平板中央。在24℃培养至菌丝生长接近培养皿边缘时测定菌落直径(mm)，每个菌落十字交叉测量2次，计算出每种处理菌落平均直径，按公式计算相对抑制率。采用剂量对数—抑制率机率值法计算求得半抑制浓度(IC₅₀)。
相对抑制率＝(直径_对照组—直径_处理组)/(直径_对照组—5)×100％
测定结果表明，喹啉衍生物对立枯丝核菌、终极腐霉、甜瓜球腔菌、齐整小菌核、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌的IC50分别为6.8、21.5、48.8、83.4、113.7和134.4μg/mL。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。