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1、10申请公布号CN104313050A43申请公布日20150128CN104313050A21申请号201410493727822申请日20140924C12N15/84200601A01H4/00200601A01H5/00200601C02F3/32200601C02F101/38200601C02F101/3620060171申请人杭州师范大学地址310036浙江省杭州市下沙高教园区学林街16号72发明人孙扬向太和韩依萱王嫚宋亚玲吴玲74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟李世玉54发明名称一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法57摘要本发明公开了。
2、一种清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法；本发明首先将含有CYP2E1基因的质粒载体转入发根农杆菌，利用发根农杆菌转基因法在活体植株上获得转CYP2E1基因的毛状不定根，进而获得含有CYP2E1基因毛状根的复合型转基因水蕹菜，利用这种复合型转基因植株对水体有机污染物进行吸收。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页10申请公布号CN104313050ACN104313050A1/1页21一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，其特征在于所述方法包括1无菌苗的培养将水蕹菜。
3、种子消毒后接种在1/2MS0培养基上，222，光照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0520MG/L6BA025MG/LIAA的MS培养基上，222，光照培养，获得无菌苗；2侵染菌液将含有核苷酸序列为SEQIDNO1所示CYP2E1基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落；将抗性菌落活化后接种至含KM50MG/LSTR50MG/L的LB液体培养基中，28，200R/MIN培养至OD600为0406，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液后再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0102菌悬液，作为侵染菌液；3转基因植株的获取将步骤1培育的无菌苗转入1。
4、/2MS0培养基上，222，光照培养至株高556CM时在植株的茎上刺出伤口，然后将步骤2制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，222，光照培养，在伤口处获得转基因毛状不定根；4转基因复合型植株当步骤3获得的毛状不定根长达56CM时，将着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定根的茎，然后将着生有毛状不定根的茎直接插入含质量浓度06琼脂的1/2MS0的培养基中，222，光照培养1015天，然后打开瓶盖练苗23天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得转基因复合型水蕹菜植株。2如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步骤1所述水蕹菜。
5、种子消毒方法为将水蕹菜种子进入体积浓度01氯化汞水溶液中，消毒75MIN。3如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步骤1所述无菌苗培养所用培养基为含05MG/L6BA025MG/LIAA的MS培养基。4如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步骤2所述质粒为PSLD506。5如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步骤2所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。6如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步骤2抗性菌落按如下方法制备将含CYP2E1基因的质粒导入感受态发。
6、根农杆菌K599细胞，构建重组发根农杆菌K599/PSLD506。7如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步骤3所述带有伤口的植株按如下步骤获取在无菌苗茎高15CM处用无菌针尖刺入，形成伤口。8如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述水体有机污染物为苯或三氯乙烯。权利要求书CN104313050A1/8页3一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法一技术领域0001本发明涉及一种水体有机污染物的去除方法，特别涉及一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。二背景技术0002水蕹菜IPOMOEAAQUATICA。
7、FORSK属旋花科草本植物，俗称竹叶菜，有水生和旱生两种生态类型。水蕹菜可以一次栽种、多次收割，从而把营养物质直接从污染水体中去除而不产生二次污染。0003有学者研究了水蕹菜在水体净化方面的功能。李欲如等在苏州重污染河道上种植水蕹菜以控制水体水质污染。不仅进行了静态试验，而且在重污染河道苗家河上作了示范应用。静态试验结果表明在气温35、水温30以上的条件下，水蕹菜对重污染水体中利用高锰酸盐指数法测定的化学需养量浓度CODMN、总氮浓度TN、NH4N、总磷浓度TP的去除率分别为370、929、939、943；苗家河示范工程水域中水质有明显改善，透明度可达90130CM，认为水蕹菜是对苏州重污染河。
8、道净化处理的优良生物材料之一李欲如,操家顺,徐峰,周金余水蕹菜对苏州重污染水体净化功能的研究环境污染与防治,2006,2816971。操家顺等报道了水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能，结果与李欲如等的报道相似操家顺,李欲如,陈娟水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能水资源保护,2006,2223641。顾国平等采用浮床种植水蕹菜等6种陆生植物，初步研究了浮床种植植物对景观水体中主要养分氮、磷的去除动态及效率，结果表明，以水蕹菜去除效果最佳。水蕹菜能够大量吸收N、P营养提供自身生长所需，在试验进行的第6D及第10D可分别使试验水体的TN、TP去除率达到100，对改善水质、修复水体具有重要作用顾国平,周丽。
9、燕,王森空心菜对景观水中氮磷的去除效果研究初报安徽农学通报,2008,1419111112。黄婧等研究了浮床水培水蕹菜的生物学特性及水质净化效果，结果显示，水蕹菜以总氮计，1M2的水蕹菜可以把7306M3的水由类净化到类；以总磷计，则可净化13473M3的水，因此，水蕹菜与其他水培植物相比具有较强的N、P吸收力，是一种可用于富营养化水体水质净化的优良植物黄婧,林惠凤,朱联东,李兆华浮床水培蕹菜的生物学特征及水质净化效果环境科学与管理,2008,33129294。宋超等利用PVC管构建浮床，研究了浮床栽培水蕹菜对罗非鱼养殖池塘水体中N和P的控制效果。数据表明，在试验后期，池塘水体中总氮水平降至淡。
10、水养殖池塘废水排放二级标准，而总磷水平达到地表水环境质量二类标准，氨氮的水平控制在1MG/L以下，而亚硝酸盐氮水平则控制在01MG/L以下。从各处理组对污染物的去除情况来看，水蕹菜种植时间与种植面积均与N、P的去除效果呈现较好的正相关关系，种植时间越长60天，种植面积与去除效果的正相关性越明显。结果表明，在集约化养殖池塘中采用浮床栽培水蕹菜能够对氮和磷实现有效的控制，并且，水蕹菜浮床覆盖率为20时比10和15处理组更具有经济效益宋超,陈家长,戈贤平,吴伟,范立民,孟顺龙,胡庚东浮床栽培空心菜对罗非说明书CN104313050A2/8页4鱼养殖池塘水体中氮和磷的控制中国农学通报,2011,272。
11、37075。唐莹莹等报道在塑料水箱中水培水蕹菜，研究浮床水蕹菜对氮循环细菌数量、分布和氮素净化效果的影响。研究结果表明，浮床水蕹菜氮循环细菌总数、氨化菌、亚硝化菌、硝化菌数量极显著高于空白对照；而浮床水蕹菜反硝化菌数量与空白对照差异不显著；氨化菌在根内、根面、水体中的分布差异不大，亚硝化菌主要分布在根内和根面，硝化菌主要分布在根面，反硝化菌主要分布在水体中。试验结束时，浮床水蕹菜系统和空白对照对氨氮的去除率分别为918和885。浮床水蕹菜系统中氮素的去除是植物吸收、根系表面的氨化作用、以及水体中硝化和反硝化共同作用的结果，而空白对照系统中氮素的主要去除途径是微生物的硝化和反硝化作用以及氨挥发唐。
12、莹莹,李秀珍,周元清,贾悦,辛在军,孙永光浮床空心菜对氮循环细菌数量与分布和氮素净化效果的影响生态学报,2012,3292837284。杨文婕和刘更另分析了磷和硫对水蕹菜吸收砷的影响，结果显示，微量的砷有利于水蕹菜生长，而过量的磷和硫阻抑砷这种有益效应的发挥杨文婕,刘更另磷和硫对空心菜吸收砷的影响环境化学,1995,154374379。此外，任朋娟等研究两性表面活性剂BS12和CD2共存对水蕹菜种子萌发、叶绿素含量及MDA含量等的影响。结果表明，BS12为50MG/L时，能降低CD2对水蕹菜种子萌发的毒害作用任朋娟,孟昭福,马云飞,袁进,郭彩虹,樊利,赵贤BS12与CD2复合污染对空心菜种子萌。
13、发及生长的影响西北农业学报,2011,204129133。0004上述有关水蕹菜的修复作用仅限于对N、P和重金属的污染修复，未见其具有修复有机污染物的研究报道。0005细胞色素P450酶是一类与重金属结合的血红蛋白，在代谢异源有机物方面起着重要作用；其中，P450酶家族成员之一P4502E1CYP2E1，其编码基因简称为CYP2E1，主要分布在哺乳动物肝细胞中，对有机污染物具有非常重要的解毒功能LEESS,BUTERSJT,PINEAUT,FERNANDEZSALGUEROP,GONZALEZFJROLEOFCYP2E1INTHEHEPATOTOXICITYOFACETAMINOPHENJBI。
14、OLCHEM,1996,271201206312067。0006为此，本发明利用发根农杆菌转基因技术将CYP2E1基因转入水蕹菜中，有效提高水蕹菜对有机污染的修复能力，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。三发明内容0007本发明目的是提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。0008本发明采用的技术方案是0009本发明提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，所述方法包括1无菌苗的培养将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS0培养基上，222，光照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0520MG/L6BA025MG/LIAA的M。
15、S培养基上，222，光照培养，获得无菌苗；2侵染菌液将含有核苷酸序列为SEQIDNO1所示CYP2E1基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落；将抗性菌落活化后接种至含KM50MG/LSTR50MG/L的LB液体培养基中，28，200R/MIN培养至OD600为0406，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮清洗3次，离心去除清洗液，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液重复清洗3次后，沉淀再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0102菌悬液，作为侵染菌液；3转基因植株的获取将步骤说明书CN104313050A3/8页51培育的无菌苗转入1/2MS0培养基上，222，光照培养至株高556CM时。
16、在植株的茎上刺出伤口，然后将步骤2制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，222，光照培养，获得转基因毛状不定根；4转基因植株当步骤3获得的毛状不定根长达56CM时，将着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定根的茎即将原始的野生根系剪掉，将着生有毛状不定根的茎即将毛状不定根作为根系进行栽培直接插入含琼脂06WT的1/2MS0的培养基中，222，光照继续培养1015天，然后打开瓶盖练苗23天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得转基因复合型水蕹菜所述转基因复合型水蕹菜是指植株的毛状根含有CYP2E1基因，茎叶为侵染前的原始结构。0010进一步，步骤1所述水蕹菜种。
17、子消毒方法为将水蕹菜种子进入体积浓度01氯化汞水溶液中，消毒75MIN。0011进一步，步骤1所述无菌苗培养所用培养基为含05MG/L6BA025MG/LIAA的MS培养基。0012进一步，本发明所述含有核苷酸序列为SEQIDNO1所示CYP2E1基因的质粒可自行构建，本发明优选步骤2所述质粒为PSLD506。0013进一步，步骤2所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。0014进一步，步骤2抗性菌落按如下方法制备在发根农杆菌K599感受态细胞中加入含CYP2E1基因的质粒，。
18、混匀后冰上放置10MIN，置于液氮速冻5MIN，28水浴热激5MIN，加入LB液体培养基于28振荡培养2H后，取菌液涂布于含KM50MG/LSTR50MG/L的LB液体培养基中，28，200R/MIN培养至OD600为0406，离心，取湿菌体即获得重组发根农杆菌K599/PSLD506。0015进一步，步骤3所述带有伤口的植株按如下步骤获取在无菌苗茎高13CM处用无菌针尖刺入，形成伤口。0016进一步，所述水体有机污染物为苯或三氯乙烯。0017本发明所述水蕹菜为各种基因型的水蕹菜，优选农家水蕹菜、柳叶水蕹菜、宽叶水蕹菜、泰国水蕹菜，更优选柳叶水蕹菜。0018本发明所用培养基的组成为所述1/2M。
19、S0培养基组成为即MS培养基不添加任何植物激素、且营养成分减半。所述MS培养基组成为参见文献MURASHIGET,SKOOGFAREVISEDMEDIUMFORRAPIDGROWTHANDBIOASSAYSWITHTOBACCOTISSUECULTUREPHYSIOLPLANT,1962,18100127。所述LB液体培养基组成为5G/L酵母膏，10G/L蛋白胨，10G/LNACL，溶剂为蒸馏水，PH值为75。所述1/2MS液体培养基组成为MS液体培养基不添加任何植物激素、且营养成分减半的液体培养基。0019本发明首先将含有CYP2E1基因的质粒转入发根农杆菌K599，利用农杆菌转基因法获得转。
20、CYP2E1基因毛状根的复合型转基因植株。当转基因毛状根长达56CM时，将着生有毛状根的茎的下部剪去，将着生有毛状根的茎直接插入含琼脂06WT的1/2MS0的培养基中，继续培养1015天，然后打开瓶盖练苗23天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得含转CYP2E1基因毛状根的复合型水蕹菜植株。经PCR和QRTPCR说明书CN104313050A4/8页6进行CYP2E1基因表达分析，毛状根中CYP2E1基因能够继续正常的表达。测定转基因再生植株对水体有机污染物的吸收情况，将转基因再生植株置于含有苯或三氯乙酸的1/2MS培养基中，水培7天后培养液中剩余的苯和三氯乙烯的含量。
21、均近0，而对照水培非转基因植株的培养液中，苯和三氯乙烯的含量分别为6200015G/ML和11310037G/ML，表明含CYP2E1基因的水蕹菜提高了对水体有机污染物的抗性，并且能高效吸收水体中的有机污染物。0020本发明的有益效果主要体现在本发明方法获得的水蕹菜可有效清除水体中有机污染物，尤其是苯和三氯乙烯，有效提高水蕹菜对有机污染的修复能力，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。四附图说明0021图1为柳叶水蕹菜外植体组培苗发育情况。0022图2为组培苗转基因毛状根的诱导情况。0023图3为毛状根进行PCR扩增鉴定的凝胶电泳图，泳道1为DNA标准分子量DS2000，泳道2为泳道6。
22、为毛状根根系平行实验，泳道7为野生型水蕹菜根系，泳道8为质粒PSLD506。0024图4为普通根非转基因根和转基因毛状根中CYP2E1基因表达情况。0025图5为转基因水蕹菜吸收水体有机污染物的情况，A为在含苯的培养液中培养，B为在含三氯乙烯的培养液中培养。五具体实施方式0026下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此0027实施例1水蕹菜组织培养快速繁殖无菌苗00281选择农家水蕹菜、柳叶水蕹菜、宽叶水蕹菜、泰国水蕹菜等不同的基因型的种子作为实验起始材料。00292选择不同的消毒方法对种子进行消毒，消毒后种子污染情况见表1，01氯化汞是指质量浓度01氯化汞水溶。
23、液，75酒精为体积浓度75乙醇水溶液，20次氯酸钠为质量浓度20次氯酸钠水溶液，结果表明利用01氯化汞消毒75MIN对种子的消毒效果最佳，无污染，而且柳叶水蕹菜的发芽率最高。0030表1种子消毒0031说明书CN104313050A5/8页700323选择不同的培养基，对不同的外植体进行组织培养。0033选择柳叶水蕹菜，利用01氯化汞消毒75MIN的种子，接种在1/2MS0培养基上，222，光照培养。培养7天萌发出的小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，分别转入不同植物激素组合的培养基上，222，光照培养3040天，外植体再生为组培苗的情况见下表2。0034表2外植体的培养00350036其中。
24、，在MS05MG/L6BA6苄氨基腺嘌呤025MG/LIAA吲哚乙酸培养基上再生组培苗的频率最高，达到95图1，而在添加IAA的培养基上，外植体只长根；在添加NAA的培养基上，外植体全部愈伤化。0037实施例2转CYP2E1基因水蕹菜的获取方法00381含CYP2E1基因发根农杆菌侵染菌液的准备0039CYP2E1基因从兔肝细胞中通过RTPCR克隆获得，CYP2E1基因的GENBANK登录号为M15061，核苷酸序列为SEQIDNO1所示。0040说明书CN104313050A6/8页800410042含有CYP2E1基因的植物转基因表达载体PSLD506由美国华盛顿大学DOTY教授提供。00。
25、43利用冻融法将PSLD506导入感受态发根农杆菌K599细胞购自THENATIONALCOLLECTIONOFPLANTPATHOGENICBACTERIAINUK中，即构建获得重组发根农杆菌K599/PSLD506。0044将重组发根农杆菌K599/PSLD506接种于含KM卡那霉素50MG/LSTR链霉素50MG/L的LB液体培养基中，28，200R/MIN培养至OD600为0406，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液，重复清洗3次，取最后离心获得的沉淀再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0102菌悬液，作为侵染的菌液。00452毛状根的诱导0046将实施例1中在MS0。
26、5MG/L6BA025MG/LIAA培养基上再生的组培苗完整植说明书CN104313050A7/8页9株切割分株后，转入1/2MS0培养基上，222，光照培养1015天后，株高在556CM时将解剖针在酒精灯上灼烧灭菌、冷却后，在植株不同部位用针尖分别刺入，形成创伤。用微量加样器吸取10L左右1滴含重组型发根农杆菌K599/PSLD506菌悬液滴加在伤口处，继续在相同的培养基上培养，222，光照培养，获得毛状根的情况见表3。0047表3组培苗转基因毛状根的诱导00480049在菌悬液接种后的57天之间，伤口处出现白色的愈伤组织，接种后的15天左右出现肉眼可见的不定根，接种后的2025天不定根长可。
27、达35CM图2。00503毛状根的分子生物学鉴定00511根据CYP2E1基因序列设计引物，按照常规方法对获得的毛状根进行PCR扩增鉴定参见李佩菡，向太和，谢军，冯婷，陆文怡转哺乳动物CYP2E1基因烟草植株再生及其分析生物工程学报,2012,281011951204。结果见图3，第1泳道DNA标准分子量；第26泳道步骤2在茎高45CM处获得的毛状根根系15的平行检验；第7泳道普通根非转基因根，野生型水蕹菜；第8泳道含CYP2E1基因的质粒PSLD506。结果非转基因根未扩增出任何条带，而转基因毛状根均扩增出条带。0052引物P15TGAAGGGTGTGCAGCCGATGACAA30053引物。
28、P25CATCGGGAATCTTCTCCAGTTGG300542根据同源序列，设计扩增ACTIN基因的引物ACTINP15TTGAACCACCACTGAGGACA3和ACTINP25GGAGCTGAGAGATTCCGTTG3，扩增结果作为内参。根据CYP2E1基因序列设计引物，CYP2E1P15ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGG3和CYP2E1P25TGTGGTTCAACAGCATCTCCC3，进行CYP2E1基因的荧光定量分析QRTPCR参见李佩菡，向太和，谢军，冯婷，陆文怡转哺乳动物CYP2E1基因烟草植株再生及其分析生物工程学报,2012,281011951204。参照SCHMI。
29、TTGEN和LIVAK的方法计算相对表达量2CT处理CT内参。结果见图4，其中NT普通根非转基因根，野生型水蕹菜、TL1LT5分别为步骤2在茎高45CM处获得的毛状根根系15平行验证。结果非转基因根未检测到CYP2E1基因的表达信号，而转基因毛状根均检测到CYP2E1基因的大小不等的表达信号。0055利用普通PCR和QRTPCR进行CYP2E1基因表达的分析。鉴定结果显示其中将菌液接种于茎高的位置45CM处，获得了转基因毛状根，未出现非转基因不定根，即获得的不定根全部为转基因不定根；而且，获得的转基因毛状根中CYP2E1基因能够继续正常的表达。00564转CYP2E1基因水蕹菜的获取说明书CN。
30、104313050A8/8页100057当转基因毛状根长达56CM时在茎高的位置45CM处着生，将着生有毛状根的茎的下部剪去即剪掉原始的野生型根系，将着生有毛状根的茎直接插入含琼脂06WT的1/2MS0的培养基中，222继续培养1015天，然后打开瓶盖练苗23天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中，222生长710天，即获得含CYP2E1基因的复合型水蕹菜植株。0058实施例3含CYP2E1基因的水蕹菜对水体有机污染物的抗性和吸收情况分析0059将实施例2制备的含CYP2E1基因的水蕹菜植株在茎高的位置45CM处着生毛状根进行培育获得的转基因植株和对照植株野生型分别于含10G/M。
31、L苯的1/2MS培养基或含15G/ML三氯乙烯的1/2MS培养液中培育，培养温度为1825。结果显示培养7天后，对照非转基因植株在含10G/ML苯的1/2MS培养基或含15G/ML三氯乙烯的1/2MS培养液中枯死，而含CYP2E1基因的水蕹菜植株依然正常生长图5。参考DOTY等的方法DOTYSL,SHANGQT,WILSONAM,WESTERGREENAD,NEWMANLA,STRANDSE,GORDONMPENHANCEDMETABOLISMOFHALOGENATEDHYDROCARBONSINTRANSGENICPLANTSCONTAININGMAMMALIANCYTOCHROMEP450。
32、2E1PROCNATLACADSCIUSA,2000,971262876291，测定水培7天后培养液中剩余的苯和三氯乙烯的含量，结果显示在含CYP2E1基因的植株的培养液中，苯和三氯乙烯的含量均近0，而对照非转基因植株的培养液中，苯和三氯乙烯的含量分别为6200015G/ML和11310037G/ML。表明含CYP2E1基因的水蕹菜提高了对水体有机污染物的抗性，并且能高效吸收水体中的有机污染物。说明书CN104313050A101/3页1100010002序列表CN104313050A112/3页120003序列表CN104313050A123/3页13序列表CN104313050A131/3页14图1图2说明书附图CN104313050A142/3页15图3图4说明书附图CN104313050A153/3页16图5说明书附图CN104313050A16。