衬底介导的膜蛋白在脂双层中的重组方法 【技术领域】
本发明涉及一种膜蛋白的重组方法，特别涉及膜蛋白在脂双层中的重组方法。背景技术
在生物体中，膜蛋白镶嵌于细胞的各类膜系统上，并执行其生理功能。因为细胞的各类膜系统上蛋白种类众多，所以纯化的膜蛋白重组方法是许多研究膜蛋白结构与功能的技术的前提。
通常膜蛋白的重组方法是在脂质体形成过程中直接将蛋白插入形成蛋白脂质体，如文献：Banerjee RK，Datta AG.Mol Cell Biochem.1983；50(1)：3-15、Levy D，Bluzat A，Seigneuret M，Rigard JL.Biochim Biophys Acta.1990 Jun27；1025(2)：179-90、Parmar MM，Blake MS，Madden TD.Vaccine.1997Sep；68(9)：1128-34和Racher KI，Voegele RT et al.Biochemistry.1999；38(6)：1676-84所报道的技术，其基本过程是用去垢剂将膜蛋白提取出来，与适当比例的脂类混合，形成混合微团液，然后降低去垢剂的浓度以形成蛋白脂质体(降低去垢剂的浓度通常有三种方法：(1)稀释。将膜蛋白、脂类和去垢剂的混合溶液进行稀释，当去垢剂的浓度足够低的时候，膜蛋白和脂类会自发形成蛋白脂质体。这个方法的一大缺点是要求膜蛋白的起始浓度必须足够高。(2)透析。这是一个比较常用的方法。在该方法中，一个关键因素是去垢剂地胶团临界浓度，当去垢剂的浓度高于其胶团临界浓度时，去垢剂本身形成胶团，无法被透析。由于低胶团临界浓度的去垢剂所用的透析时间非常长，所以通常只适用于胶团临界浓度＞1mM的去垢剂。但是即使是高胶团临界浓度的去垢剂，透析往往也需要几十小时，因此不适用于结构复杂、易于水解的膜蛋白的重组。(3)层析。选择性地吸附去垢剂以促进蛋白脂质体的形成。这一方法虽然比较迅速，但是在短时间内重组上去的蛋白不多，而且形成的脂质体大小不均一。
用上述方法制备的蛋白脂质体是直径为几十nm级的小脂质体，在实际工作中通常需要将小脂质体融合形成直径约为μm级的巨脂质体(Rogen A.H.A.ET al.J.Immmu.Methods.1997；204：105-133)。制备巨脂质体的方法有以下两种：(1)脱水-复水法(dehydration-rehydration，DR)。这种方法的缺点是过程烦琐，所需时间长，对于结构容易破坏的蛋白不适用。(2)冰冻-熔融法(freeze-thaw，FT)。该方法虽然过程简单，所需时间短，但是制备时需要特殊的蛋白-磷脂比例，形成的巨脂质体数目较少，且常为多层磷脂膜。
目前，尽管人们已经发展了许多膜蛋白的重组方法，但是这些方法都是把膜蛋白重组到未受支撑的膜上。近几年，人们已经发展出几种制备受支撑磷脂膜的方法：
(1)制备LB膜。这一方法需要有专门的LB膜制备仪，且技术要求高，较难掌握，在制备LB膜的过程中不能将膜蛋白重组进去(Hasker L，HeymannJB，Engel A，Kistler J，Walz T.J Struct Biol.1998；121(2)：162-171、Michael L，Wagner ML，Tamm LK.Biophys J.2000；79(3)：1400-1414；)。
(2)单层脂质体融合。制备好的单层脂质体铺在衬底上孵育，使之相互融合形成脂双层。但是单层脂质体的制备比较复杂，而且难以控制。而且脂质体的融合需要干燥等极端环境，对膜蛋白的结构功能会有严重损伤(Kuehlbrandt，W.Quart.Rev.Biophy 1992；25，1-49)。
总的来说，现有的蛋白重组方法或操作复杂、过程烦琐，或不利于保持蛋白的生物活性，无法满足一些结构或功能研究技术的需要。发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种适用于多种膜蛋白的、简单快速的、衬底介导的膜蛋白在脂双层中的重组方法，以克服现有蛋白重组方法所存在的操作复杂、过程烦琐、不利于保持蛋白的生物活性的缺陷，以满足对于多种膜蛋白结构与功能研究的需要。
本发明的技术方案：
本发明所说的方法包括如下步骤：
(1)膜蛋白经纯化后与适量的磷脂混合，蛋白和磷脂的摩尔比是1∶102～1∶107，优选的为1∶105～1∶106；
(2)取少量该溶液滴于衬底表面，于温度15～40℃的条件下，在孵育槽中孵育，液滴中的蛋白和磷脂同时吸附在衬底表面，磷脂在衬底表面自发形成脂双层并迅速铺展，将蛋白镶嵌其中。液滴吸附20-45分钟后，用1～2ml缓冲液缓慢冲洗表面，洗去吸附不牢固的蛋白和磷脂，在衬底表面即为重组了蛋白的脂双层.优选的温度为20～25℃。
也可将步骤(1)的溶液先用pH为6.5～7.5的缓冲液稀释，然后在衬底表面进行吸附。
所说的纯化为一现有技术，该领域一般的技术人员均能够实施这一方法。本发明的方法优点是十分显著的：
1.步骤简单，方便快速；
2.形成有支撑的脂双层；
3.适用于各种膜蛋白，特别适用于结构复杂、易于水解的膜蛋白。附图说明
图1为样品注入孵育槽孵育5分钟的AFM图象。
图2为样品注入孵育槽后孵育20分钟的AFM图象。
图3为样品注入孵育槽后孵育45分钟的AFM图象。具体实施方式
以下将通过实施例对本发明的具体实施方式进行说明，但是实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1
取10μl纯化的兔骨骼肌钙释放通道溶液(蛋白浓度为0.03-0.04mg/ml，L-α-卵磷脂的浓度是3mg/ml)用1M NaCl，20mM Na-Pipes，500μM EGTA，pH7.1的缓冲液稀释10倍，注入孵育槽中，使样品吸附在新剖裂的云母上。当样品吸附一定时间后，用2ml该缓冲液冲洗，并在该溶液中用接触型AFM观察。观察结果如图1、图2和图3所示，结果表明，样品中的磷脂在云母表面迅速形成不完整的双层膜，同时也有蛋白颗粒吸附到云母上。随着吸附时间增加，磷脂膜逐渐铺满云母表面，且蛋白重组到磷脂膜中。
上述Na-Pipes的化学式为C8H16N2O6S2Na2，购自美国Sigma公司，产品号为P3768；
上述EGTA的化学式为C14H24N2O10，购自美国Sigma公司，产品号为E9129。
由图1可见：磷脂和蛋白同时吸附到云母表面，磷脂形成互不相连的小片磷脂膜，膜的高度约5nm，说明形成的是双层膜。此时，吸附到云母表面的蛋白并没有重组到脂双层中，蛋白和磷脂层之间有较大的空隙。
由图2可见：随着吸附时间增长，吸附到云母表面的磷脂逐渐增多，小片的磷脂膜逐渐铺展、相互融合。在图2上已无小片磷脂膜，但在蛋白颗粒的周围，仍然可以看到一些空隙，与图1相比空隙明显减小。
由图3可见：蛋白颗粒的周围已经看不到空隙，加大扫描力不能使蛋白颗粒移位，说明此时蛋白已经重组到脂双层中。
实施例2
短杆菌肽A(从Calbiochen Biochemicals(La Jolla，CA)处购得)，与适量的磷脂混合，短杆菌肽A与磷脂的摩尔比在1％-5％的范围内均能得到在云母表面形成的脂双层中的重组蛋白。