一种内质网靶向性多肽表达盒 【技术领域】
本发明属生物技术领域,涉及一种内质网靶向性的多肽表达盒。具体涉及一种可将表达产物特异性靶向细胞内质网的真核多肽表达盒及其构建方法和在基因疫苗研制中的应用。背景技术
能有效地表达如抗原表位多肽等短肽分子和进行以抗原表位为基础的疫苗分子设计,已有发明可表达短肽链的多肽表达盒pEC,所述表达盒可在体内外表达不同的生物短肽分子,并可作为以抗原表位为基础的基因疫苗的载体。本领域已知,细胞的内质网是抗原加工和处理的场所,疫苗的免疫效果与抗原提呈水平有关,而抗原的提呈水平又取决于抗原表位进入内质网的能力。现有此类多肽表达盒还存在免疫特异性较低的缺陷。发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高的多肽表达盒。本发明含内质网靶向序列ERISS真核表达载体,将内质网靶向序列ERISS克隆于pEC载体中,构建新型基因疫苗,所述载体可将抗原表位靶向定位于细胞内质网、增强免疫效果。
本发明通过下述方案和步骤实现:
1.构建及鉴定内质网靶向性的多肽表达盒pEC-ERISS
按基因克隆常规方法合成ERISS编码基因的正意(ERISS upper)和反意链(ERISS lower),序列为,ERISS upper:AAT TGA GGT ACA TGATTT TAG GCT TGC TCG CCC TTG CGG CAG TCT GCA GCG CTG,ERISS lower:AAT TCA GCG CTG CAG ACT GCC GCA AGG GCG AGC AAG CCT AAA ATC ATGTAC CTC,用体外退火方法于BgI II酶切位点处ERISS编码基因克隆于pEC骨架中,获得pEC-ERISS,经PCR及DNA序列测定表明克隆正确。
本发明是一种含内质网靶向序列ERISS真核表达载体,可将目的基因产物靶向入细胞内质网。所述载体除含有常规真核转录元件如HCMV IE1启动子、增强子复合体、内含子A及BGH基因,以及pEC中的特定序列GCCACCATGGAATTCTAATA外,在ATG下游含有AAT TGA GGTACA TGA TTT TAG GCT TGC TCG CCC TTG CGG CAG TCT GCA GCG CTG序列。
本发明经实验证实,所述ERISS序列地插入不影响pEC中抗原表位的有效表达。本发明将HbcAg中一CTL抗原表位克隆于ERISS下游,构建了含抗原表位的pEC-ERISS-C18,转染C2C12肌细胞,DOT-EIA检测转染上清,结果只有pEC-C18与pEC-ERISS-C18质粒转染上清膜斑点呈阳性显色,表明ERISS序列的插入不影响表位C18-27的有效表达。本发明质粒可克隆和有效表达如乙肝病毒CTL表位等生物短肽,ERISS序列的插入不影响短肽的有效表达。克隆于上述载体中的各类短肽如CTL表位,在基因免疫中可诱生相应的特异性免疫应答,可用于以表位为基础的新型基因疫苗的制备。具体实施方式
实施例1
pEC-ERISS在基因免疫中的应用及验证
本发明进行了ERISS对以C18-27表位为基础的基因免疫的增强效果实验,以质粒pEC和pEC-C18为对照,结果显示:pEC-ERISS-C18在C57BL/6和BALB/c小鼠体内诱生的CTL应答均强于pEC-C18所诱生的CTL应答。表明ERISS可增强C18-27表位基因免疫诱生的CTL应答。在对C57BL/6、BALB/c和C3H三种小鼠的基因免疫中同样发现:ERISS在上述不同MHC背景的小鼠中均可增强C18-27表位诱生CTL应答的作用。
实施例2
以经pEC-C18和pEC-ERISS-C18转染24小时并灭活的瘤细胞EL4或p815为刺激细胞,以免疫后并经肽特异刺激的脾细胞为反应细胞,进行特异性增殖试验。结果表明:pEC-ERISS-C18组增殖指数在C57BL/6和BALB/c小鼠中均高于pEC-C18组,证实pEC-ERISS-C18转染瘤细胞膜表面有更多的C18-27多肽被递呈,表明ERISS增强以C18-27抗原表位为基础的基因免疫诱生CTL应答的机制与其增强了抗原递呈有关。附图说明
图1是内质网靶向性的多肽表达盒pEC-ERISS质粒模式图图2是pEC-ERISS的PCR鉴定
其中:a是pEC(通道1)pEC-ERISS(通道2)为模板,SCR1/SCR2
为引物扩增的PcR结果
b是pEC(通道1)pEC-ERISS(通道2)为模板,SCR1/E3D
为引物扩增的PcR结果图3是pEC-ERISS-C18的DNA序列分析图4是pEC-ERISS-C18质粒模式图图5是pEC-ERISS-C18质粒的体外表达图6是pEC-ERISS-C18基因免疫增强CTL应答图7是pEC-ERISS-C18基因免疫小鼠脾细胞对质粒转染瘤细胞刺
激的特异性增殖