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1、10申请公布号CN104262155A43申请公布日20150107CN104262155A21申请号201410442584822申请日20140829C07C69/732200601A61K31/216200601A61P3/10200601A61P9/00200601A61P3/06200601A61P9/10200601A61P3/04200601A61P1/1620060171申请人中国药科大学地址211198江苏省南京市江宁区龙眠大道639号72发明人吴斐华梁敬钰王立英何柏球王珊珊陈凯曾彪54发明名称一种酚酸类化合物及其制备方法与药物用途57摘要本发明属于制药技术领域。本发明公开了。
2、一种酚酸类化合物迷迭香酸乙酯的制备方法与药物用途。迷迭香酸乙酯是以风轮菜CLINOPODIUMCHINENSEBENTHOKUNTZE全草为原料，经粉碎、醇提取、减压回收后得到的浓缩物，用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯提取物，再经大孔树脂、硅胶、MCI多次柱层析而得到。迷迭香酸乙酯具有显著地抑制高糖、游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞凋亡，改善胰岛素抵抗下肝细胞糖消耗，改善脂质代谢，抑制葡萄糖苷酶活性的作用。可用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病周围血管病变、糖尿病性心脑血管方面并发症、糖脂代谢紊乱、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病、肥胖以及脂肪性肝病的药物。51INTCL权利要求书1页说明书7页。
3、附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页10申请公布号CN104262155ACN104262155A1/1页21一种酚酸类化合物迷迭香酸乙酯的制备方法是1风轮菜全草干燥，粉碎；2用乙醇及其含水物、甲醇及其含水物或丙醇及其含水物回流提取，或浸渍提取，提取液减压浓缩；3将步骤2中的浓缩的提取物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取34次；4将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，进行大孔树脂柱层析，依次用蒸馏水、60、95乙醇水洗脱，收集60乙醇水洗脱液，减压浓缩至干；5步骤4中浓缩的提取物，进行MCI柱层析，50甲醇水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，得到迷迭香酸乙酯粗。
4、品；6将步骤5中粗品进行硅胶柱层析，二氯甲烷甲醇201洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到迷迭香酸乙酯；上述制备方法的条件范围为步骤2中乙醇或甲醇或丙醇的浓度为3090，提取方法为回流、浸渍；步骤4中的大孔树脂可选用D101和CAD40大孔树脂中的任意一种，用于洗脱的醇溶液也可以为甲醇的水溶液，收集50甲醇水洗脱液；步骤5也可以用二氯甲烷丙酮351、二氯甲烷乙酸乙酯131、氯仿甲醇20301、氯仿丙酮581、氯仿乙酸乙酯241洗脱。2一种治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的迷迭香酸乙酯与一种或多种辅助剂和/或赋形剂混合。3根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于其被制备成各种剂。
5、型。4根据权利要求3所述的药物组合物，所述剂型为针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂或溶液剂。5根据权利要求1所述的制备方法，所得到的迷迭香酸乙酯能显著改善高糖诱导的血管内皮细胞凋亡、减轻游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞凋亡、改善胰岛素抵抗下肝细胞糖消耗、抑制油酸所致的肝细胞脂肪堆积和抑制葡萄糖苷酶活性而调控餐后血糖。6根据权利要求5所述的迷迭香酸乙酯的用途，其特征在于其用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病周围血管病变、糖尿病性心脑血管方面并发症、糖脂代谢紊乱、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病、肥胖以及脂肪性肝病的药物中的应用。权利要求书CN104262155A1/7页3一种酚酸类化合物及其制备方法。
6、与药物用途一、技术领域0001本发明属于制药技术领域，涉及酚酸类化合物迷迭香酸乙酯的制备方法，并涉及迷迭香酸乙酯在制备预防和治疗糖尿病、糖尿病周围血管病变、糖尿病性心脑血管方面并发症、糖脂代谢紊乱、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病、肥胖以及脂肪性肝病的药物中的应用。二、背景技术0002糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一组代谢异常综合征，以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相关。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病INSULINDEPENDENTDIABETESMELLITUS，IDDM又称1型和非胰岛素依赖型糖尿病NOINSULINDEPENDENTDIABETESMELLIT。
7、US，NIDDM又称II型，后者约占患者总数的9599。目前的研究认为糖尿病引起的血管并发症是患者致残致死的主要原因。截止到2011年，我国糖尿病患者高达9240万之多，是糖尿病患者最多的围家。据世界卫生组织预测，到2030年时，我国的糖尿病患者人数有可能增加一倍，达到4230万，已被列为全世界继心血管病、肿瘤之后第3位威胁人类健康的慢性非传染性疾病。因此，积极预防和治疗糖尿病已成为全球性的问题。0003食物中的糖类化合物多以多糖和二糖形式存在，在体内，多糖及二糖需多种酶水解成单糖才能被人体吸收，葡萄糖苷酶是水解多糖及二糖的常见酶，主要分布在小肠上皮绒毛膜上。葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制葡萄。
8、糖苷酶的作用来减少糖类的水解，延缓糖类的吸收，从而有效的降低糖尿病人餐后血糖浓度峰值，抑制餐后的高血糖，并抑制伴随的胰岛素分泌，改善过度的胰岛素反应，使血糖控制状态良好。因此，抑制葡萄糖苷酶的活性，对于降低糖尿病患者餐后血糖具有重要意义。0004胰岛素抵抗IR是指靶组织对胰岛素的敏感性和或反应性降低，表现为肝脏、肌肉和脂肪等靶组织细胞对胰岛素生物效应的反应性降低而产生的一系列临床表现。胰岛素抵抗是多种疾病发生的共同基础，特别是肥胖、2型糖尿病、高血脂和高血压等代谢综合征。肝脏胰岛素抵抗在2型糖尿病发生、发展过程中占重要地位。肥胖所致的血浆游离肪酸FFAS浓度增高是引起IR和2型糖尿病重要危险因。
9、素之一。高浓度FFAS损害肝细胞胰岛素信号传导的磷脂酰肌醇3激酶P13K途径，使肝细胞糖异生作用相关的酶活性改变，肝糖代谢平衡失调，肝细胞出现胰岛素抵抗，肝糖生成增加，从而引起空腹高血糖。因此，改善肝脏胰岛素抵抗，对防治2型糖尿病及多种代谢性疾病具有重大意义。0005血管内皮功能障碍是糖尿病血管病变发生的主要因素之一。血管内皮细胞通过产生多种活性物质对细胞内理化信号产生应答，产生多重生物学功能，从而保持血管正常张力，维持内皮细胞正常功能。高血糖可通过多种途径诱导血管内皮细胞凋亡，进而导致血管内皮细胞功能障碍。另外，2型糖尿病常伴随胰岛素抵抗出现的循环游离脂肪酸水平升高，或者高脂血症患者体内的循。
10、环游离脂肪酸含量增加，均可增加细胞的氧化应激过程，使内皮细胞凋亡。因此，保护内皮细胞免受有害因素的损伤，维护其正常功能对预防糖尿病慢性说明书CN104262155A2/7页4血管并发症以及动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病具有重要的意义。0006肝脏是脂肪合成、糖原合成和胆固醇代谢的重要器官，在维持机体糖脂代谢平衡中起重要作用。当肝脏发生胰岛素抵抗时，糖脂代谢发生紊乱，后者又加重胰岛素抵抗，形成恶性循环。0007近年来随着人们饮食中脂肪、高糖的增加，多坐少动的工作方式等因素，致使我国脂肪性肝病发病率越来越高，且年龄呈现出低龄化趋势。脂肪性肝病包括酒精性脂肪肝病AFLD和非酒精性脂肪肝病NONAL。
11、COHOLICFATTYLIVERDISEASES，NAFLD两大类，其中，NAFLD在临床上发病率更高。NAFLD是以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征，以肝实质细胞脂肪贮积和脂肪变性为特征的临床病理综合症。NAFLD发病过程中，首先脂肪酸在肝脏内以甘油三酯的形式沉积，发生脂肪变性，随之产生的活性氧进一步诱发脂质过氧化反应及炎症反应，加剧病情，诱导脂肪性肝炎的发生。但是，脂肪性肝病的发病机制未完全清楚，药物治疗也不完善，因此寻找良好的预防和治疗脂肪肝病的药物尤为迫切。0008风轮菜为唇形科风轮菜属植物风轮菜CLINOPODIUMCHINENSEBENTHOKUNTZE的全草。风轮菜微苦、涩。
12、，凉。归肝经。风轮菜属植物具有止血活血、抗炎、降血糖、保护血管内皮、收缩子宫、抗菌等广泛的药理活性，极具药用价值。迷迭香酸乙酯ROSMARINICACIDETHYLESTER，RAE是风轮菜的一个重要活性成分。但是，尚未有迷迭香酸乙酯在改善高糖诱导的血管内皮细胞凋亡、减轻游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞凋亡、改善胰岛素抵抗下肝细胞糖消耗、抑制油酸所致的肝细胞脂肪堆积和调控餐后血糖活性报道。三、发明内容0009本发明包括两部分内容，第一部分迷迭香酸乙酯的制备方法；第二部分迷迭香酸乙酯在改善游离脂肪酸所致的胰岛素抵抗、降血糖及保护血管内皮细胞作用，及其在预防和治疗糖尿病、糖尿病周围血管病变、糖尿病性心。
13、脑血管方面并发症、糖脂代谢紊乱、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病、肥胖以及脂肪性肝病的药物中的应用。00101、迷迭香酸乙酯的提取分离和结构鉴定00111将风轮菜全草干燥，粉碎；00122用乙醇及其含水物、甲醇及其含水物或丙醇及其含水物回流提取，或浸渍提取，提取液减压浓缩；00133将步骤2中的浓缩的提取物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取34次；00144将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，进行大孔树脂柱层析，依次用蒸馏水、60、95乙醇水洗脱，收集60乙醇水洗脱液，减压浓缩至干；00155步骤4中浓缩的提取物，进行MCI柱层析，50甲醇水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，得到迷迭香酸乙酯粗品；00166。
14、将步骤5中粗品进行硅胶柱层析，二氯甲烷甲醇201洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到迷迭香酸乙酯。0017上述制备方法的条件范围为步骤2中乙醇或甲醇或丙醇的浓度为3090，提取方法为回流、浸渍；步骤4中的大孔树脂可选用D101和CAD40大孔树脂中的任意一种，用于洗脱的醇溶液也可以为甲醇的水溶液，收集50甲醇水洗脱液；步骤5也可说明书CN104262155A3/7页5以用二氯甲烷丙酮351、二氯甲烷乙酸乙酯131、氯仿甲醇20301、氯仿丙酮581、氯仿乙酸乙酯241洗脱。0018迷迭香酸乙酯ROSMARINICACIDETHYLESTER，RAE，棕黄色油状氯仿甲醇，MP178180，分子量为3。
15、88。1HNMR500HZ，DMSOD67561H，D，J159HZ，7H，6261H，D，J159HZ，8H，7051H，D，J20HZ，2H，6961H，DD，J82，20HZ，6H，6721H，D，J82HZ，5H，6781H，D，J20HZ，2H，6701H，DD，J82，20HZ，6H，6581H，D，J82HZ，5H，5161H，DD，J9，4HZ，8H，4142H，Q，J71HZ，OCH2CH3，3041H，DD，J14，4HZ，7H，3331H，DD，J14，9HZ，7H，1203H，T，J71HZ，OCH2CH3。以上数据与与文献报道的迷迭香酸乙酯理化性质与光谱数据一致，故鉴。
16、定为迷迭香酸乙酯。其结构式如下所示00190020STRUCTUREOFROSMARINICACIDETHYLESTER0021本发明所述迷迭香酸乙酯可与常规辅助剂和/或赋型剂混合，制备成各种剂型，用于预防或治疗。针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等都为可供选择的药物剂型。胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等剂型可以用已知的常规方法制备。0022胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂等剂型可以含有一种或多种常用赋型剂填料和增溶剂如淀粉，微晶纤维等；粘合剂如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等；致湿剂如甘油；崩解剂如碳酸钙等；吸收剂如高岭土等；润滑剂如滑石粉等。0023药用赋型剂可以是固体、半固。
17、体、液体等各种形态的，配方辅助剂可以是各种类型的。0024溶液剂可以含有一般的溶剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等，如水、乙醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯等。00252、迷迭香酸乙酯保护血管内皮细胞、改善胰岛素抵抗、改善糖脂代谢、调控餐后血糖活性002621迷迭香酸乙酯RAE对高糖诱导的内皮细胞凋亡的保护作用0027取对数生长期的HUVECS细胞，消化成单细胞悬液，10FBS的DMEM培养基重悬，接种于6孔细胞培养板1105CELLS/WELL，培养24H后更换培养基，将细胞分为以下几组0028正常组CONTROLHUVECS与含10胎牛血清的DMEM低糖培养基自然培养；0029模型组HIGHGLU。
18、COSEHUVECS与33MM葡萄糖培养基共培养；0030药物组HUVECS与RAE1，3，10M、迷迭香酸RA，10M和维生素CVITC，100M及33MM葡萄糖培养基共培养。说明书CN104262155A4/7页60031培养48H后，弃培养上清，每组细胞按ANNEXINVFITC/PI染色试剂盒说明书进行染色处理，最后通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。0032结果如图1所示，与正常组相比，模型组的细胞凋亡率极显著升高P001。与模型组相比，RAE1，3，10M、RA10M和VITC100M组的细胞凋亡率均极显著降低P001。10M浓度下，迷迭香酸乙酯组细胞凋亡率极明显低于迷迭香酸组P00。
19、1。提示迷迭香酸乙酯可能通过改善高糖诱导的内皮细胞凋亡从而起到保护血管内皮细胞的作用，其作用强于迷迭香酸。003322迷迭香酸乙酯对棕榈酸PALMITICACID，PA所致的血管内皮细胞凋亡的影响0034取对数生长期的HUVECS细胞，消化成单细胞悬液，10FBS的DMEM培养基重悬，接种于6孔细胞培养板1105CELLS/WELL，培养24H后更换培养基，将细胞分为以下几组正常组NORMAL为HUVECS与含10胎牛血清的DMEM低糖培养基自然培养；模型组CONTROL为HUVECS与05MMPA共培养；药物组为HUVECS与迷迭香酸乙酯1，3，10M和迷迭香酸10M及05MMPA共培养。培。
20、养48H后，弃培养上清，每组细胞按ANNEXINVFITC/PI染色试剂盒说明书进行染色处理，最后通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。0035结果如图2所示，与正常组相比，模型组的细胞凋亡率极显著升高P001。与模型组相比，RAE3，10M和RA10M组细胞凋亡率极显著降低P001。10M浓度下，迷迭香酸乙酯组细胞凋亡率极明显低于迷迭香酸组P001。提示迷迭香酸乙酯可改善游离脂肪酸诱导的内皮细胞凋亡，其作用强于迷迭香酸。003623迷迭香酸乙酯对胰岛素抵抗HEPG2细胞糖消耗的影响0037取对数生长期HEPG2消化成单细胞悬液接种于24孔细胞培养板5104CELL/WELL，37，5CO2条件下。
21、培养24H后，更换为无血清RPMI1640培养基，继续培养24H，实验分组如下正常组为用10BSA孵育HEPG2细胞24H；模型组为用PA250M孵育HEPG2细胞24H；药物组为用不同浓度的RAE1、3、10M和RA10M预处理30MIN后，加入PA250M孵育HEPG2细胞24H。处理完毕后，换成含100NM胰岛素的KREBSRINGER130MMNACL，5MMKCL，13MMMGSO4，13MMCACL2，AND10MMNA2HPO4/NAH2PO4，GLUCOSE555MM，PH74继续孵育4H后，测定细胞上清液中葡萄糖浓度。0038结果如图3所示与正常组相比，模型组HEPG2细胞上。
22、清液的葡萄糖浓度显著升高P001，可见其葡萄糖消牦量显著降低。与模型组相比，RAE1、3M组细胞上清中的葡萄糖浓度显著降低P005，RAE10M和RA10M组细胞上清中的葡萄糖浓度极显著降低P001。提示迷迭香酸乙酯能够促进PA诱导的肝细胞胰岛素抵抗状态下葡萄糖消耗量，改善游离脂肪酸所致的肝细胞胰岛素抵抗，抑制肝糖生成。003924迷迭香酸乙酯对油酸诱导HEPG2细胞脂肪堆积的影响0040取对数生长期HEPG2消化成单细胞悬液接种于24孔细胞培养板5104CELL/WELL，37，5CO2条件下培养24H后，更换为无血清RPMI1640培养基，继续培养24H，实验分组如下正常组为HEPG2细胞。
23、的自然培养；模型组为油酸OA04MM与HEPG2细胞共培养；药物组为RAE01，1，3，10M、RA10M、辛伐他汀SIM480M与04MM的OA共同孵育HEPG2细胞。共培养24H后，弃去培养基，用预冷的PBS清洗两遍，再用RIPA裂解液于冰上裂解细胞，每5MIN摇荡一次，使其充分裂解，45MIN后12000R/MIN，4离心5MIN，取上清说明书CN104262155A5/7页7液，用甘油三酯TG试剂盒测定TG含量，以考马斯亮蓝法定蛋白含量，计算各药物组对TG的清除率。0041结果如图4所示与正常组相比，模型组TG含量极显著升高P001，表明HEPG2细胞脂肪堆积模型建立成功。与模型组相比。
24、，迷迭香酸乙酯01、1、3、10M、迷迭香酸10M及辛伐他汀480M组TG含量极显著降低P001。10M浓度下，迷迭香酸乙酯组TG含量极明显低于迷迭香酸组P001。提示迷迭香酸乙酯可能通过促进TG的清除改善油酸诱导的肝细胞脂肪堆积，其作用强于迷迭香酸。004225迷迭香酸乙酯对葡萄糖苷酶活性的影响0043以4硝基酚D呋喃葡萄糖苷PNPG为底物测定葡萄糖苷酶的活性。将不同浓度的迷迭香酸乙酯终浓度或阿卡波糖终浓度40L与葡萄糖苷酶45U/ML30L共同加500LKH2P04缓冲液67MMOL/L，PH68中，在37水浴中反应10MIN后，加入底物PNPG8MMOL/L30L以启动反应。37水浴中反。
25、应10MIN后，加入01MOL/LNA2CO31ML终止反应。于405NM波长下测定OD值，计算抑制率。0044抑制率对照组OD值药物组OD值/对照组OD值1000045结果如图5所示迷迭香酸乙酯可显著抑制葡萄糖苷酶活性，降低餐后葡萄糖浓度，其抑制葡萄糖苷酶活性明显优于阿卡波糖。0046本发明所述，迷迭香酸乙酯具有显著改善高糖诱导的血管内皮细胞凋亡和减轻游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞凋亡，从而保护血管内皮细胞；改善胰岛素抵抗下肝细胞糖消耗、抑制油酸所致的肝细胞脂肪堆积和抑制葡萄糖苷酶活性而抑制餐后血糖升高的作用。可用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病周围血管病变、糖尿病性心脑血管方面并发症、糖脂代谢。
26、紊乱、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病、肥胖以及脂肪性肝病的药物。四、附图说明0047图1迷迭香酸乙酯对高糖诱导的内皮细胞凋亡率的影响0048取对数生长期的HUVEC细胞，消化成单细胞悬液，10FBS的DMEM培养基重悬，接种于6孔细胞培养板1105CELLS/WELL，培养24H后更换培养基，将细胞分为以下几组正常组为HUVECS的自然培养；模型组为HUVECS与33MMOL/L葡萄糖共培养；药物组为HUVECS与迷迭香酸乙酯1、3、10M、RA10M、VITC100M及33MMOL/L葡萄糖共培养。培养48H后，弃培养上清，每组细胞按ANNEXINVFITC/PI染色试剂盒说明书进行染色。
27、处理，最后通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果以表示。P001VSCONTROL；P005，P001VSHIGHGLUCOSE；P001RAE10MVSRA10MSTUDENTSTTEST0049图2迷迭香酸乙酯对PA所致内皮细胞凋亡的影响0050取对数生长期的HUVEC细胞，消化成单细胞悬液，10FBS的DMEM培养基重悬，接种于6孔细胞培养板1105CELLS/WELL，培养24H后更换培养基，将细胞分为以下几组正常组为HUVECS的自然培养；模型组为HUVECS与500MPA共培养；药物组为HUVECS与RAE1、3、10M、RA10M及500MPA共培养。培养48H后，弃培养上清，每。
28、组细胞按ANNEXINVFITC/PI染色试剂盒说明书进行染色处理，最后通过流式细胞仪检说明书CN104262155A6/7页8测各组细胞凋亡率。结果以表示。P001VSNORMAL；P001VSCONTROL；P001RAE10MVSRA10MSTUDENTSTTEST0051图3迷迭香酸乙酯对胰岛素抵抗HEPG2细胞株糖消耗的影响0052取对数生长期HEPG2消化成单细胞悬液接种于24孔细胞培养板5104CELL/WELL，37，5CO2条件下培养24H后，更换为无血清RPMI1640培养基，继续培养24H，实验分组如下正常组NORMAL为HEPG2细胞的正常培养，模型组CONTROL为H。
29、EPG2细胞与PA250M共培养，药物组为不同浓度的迷迭香酸乙酯1、3、10M和迷迭香酸10M预处理30MIN后，与入PA250M共培养24H。共培养24H后，用PBS洗三次，换成含100NM胰岛素的KREBSRINGER130MMNACL，5MMKCL，13MMMGSO4，13MMCACL2，AND10MMNA2HPO4/NAH2PO4，GLUCOSE555MM，PH74继续孵育4H后测定细胞上清液中葡萄糖浓度。结果以表示。P005VSNORMAL；P005，P001VSCONTROLSTUDENTSTTEST0053图4迷迭香酸乙酯对油酸诱导HEPG2细胞脂肪堆积的影响0054取对数生长期。
30、HEPG2消化成单细胞悬液接种于24孔细胞培养板5104CELL/WELL，37，5CO2条件下培养24H后，更换为无血清RPMI1640培养基，继续培养24H，实验分组如下正常组NORMAL为HEPG2的自然培养，模型组CONTROL为HEPG2细胞与油酸OA04MM共培养，药物组为HEPG2细胞分别与RAE01，1，3，10M、RA10M、辛伐他汀SIM480M与04MM的OA共培养。共培养24H后，弃去培养基，用预冷的PBS清洗两遍，再用RIPA裂解液32L于冰上裂解细胞，每5MIN用摇荡使其充分裂解，45MIN后12000R/MIN，4离心5MIN，取上清液，用甘油三酯试剂盒测定TG含。
31、量，以考马斯亮蓝法定蛋白含量，计算各加药组对TG的清除率。结果以表示。P001VSNORMAL；P001VSCONTROL；P001RAE10MVSRA10MSTUDENTSTTEST0055图5迷迭香酸乙酯对葡萄糖苷酶活性的影响0056以4硝基酚D呋喃葡萄糖苷PNPG为底物测定葡萄糖苷酶的活性。将不同浓度的迷迭香酸乙酯终浓度或阿卡波糖终浓度40L与葡萄糖苷酶45U/ML30L共同加500LKH2PO4缓冲液67MMOL/L，PH68中，在37水浴中反应10MIN后，加入底物PNPG8MMOL/L30L以启动反应。37水浴中反应10MIN后，加入01MOL/LNA2CO31ML终止反应。于40。
32、5NM波长下测定OD值，计算抑制率，结果以表示。P001VSCONTROLSTUDENTSTTEST五、具体实施方式0057下面结合实例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实例。0058实施例1迷迭香酸乙酯的制备0059取5KG干燥风轮菜全草，粉碎，用10倍量的80乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液依次用4倍量的石油醚、乙酸乙酯萃取4次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩后，进行大孔树脂D101柱层析，依次用蒸馏水、60、95乙醇水洗脱。收集60乙醇水洗脱液，减压浓缩，MCI柱层析50甲醇水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到迷迭香酸乙酯粗品，迷迭香酸乙酯粗品进行硅胶柱层析，。
33、二氯甲烷甲醇201洗脱，收集洗脱液，说明书CN104262155A7/7页9减压浓缩，干燥，得到迷迭香酸乙酯，得率为0071。0060实施例2迷迭香酸乙酯的制备0061取5KG干燥风轮菜全草，粉碎，用12倍量的85乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液依次用5倍量的石油醚、乙酸乙酯萃取4次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩后，进行大孔树脂CAD40柱层析，依次用甲醇水溶液洗脱，收集50甲醇水洗脱液，减压浓缩，再进行MCI柱层析50甲醇水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到迷迭香酸乙酯粗品，迷迭香酸乙酯粗品进行硅胶柱层析，二氯甲烷丙酮41洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到迷迭香酸乙酯，得率为0079。说明书CN104262155A1/3页10图1图2说明书附图CN104262155A102/3页11图3图4说明书附图CN104262155A113/3页12图5说明书附图CN104262155A12。