人血小板糖蛋白GPIbα的制备方法及其专用引物 【技术领域】
本发明涉及一种人体蛋白的制备方法及其专用引物，特别是涉及人血小板糖蛋白GPIbα的制备方法及其专用引物。背景技术
血小板细胞膜表面存在着多种糖蛋白，参与并维持血小板的止血功能。其中主要包括GPIb、GPIIb、GPIII、GPIIIb、GPIV、GPIX等。血小板糖蛋白(GP)Ib/IX/V复合体是von Willebrand因子(vWf)的受体，它能与暴露在血管内膜上的vWf因子结合，导致血小板的黏附和凝集，在血小板参与的生理性止血过程中发挥重要作用。当血管内皮受损后，很快血小板黏附于其上，通过生理反应如收缩并形成血小板血栓，达到止血的效果。
现已明确，血小板糖蛋白GPIb在血栓形成过程中是一种黏附蛋白，作为vWf因子的受体，激活或促进血小板黏附、凝集反应。GPIb是由、两条链通过二硫键连接组成的异源二聚体，分子量为160,000道尔顿，、两条链分别称为GPIb和GPIb。与vWf因子的结合区位于GPIb的N端1-293位氨基酸残基。编码GPIb的全长DNA序列由1881个核苷酸组成(Genebank，GI：450407，J Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(16)，5615-5619(1987))，编码vWf因子地读码框为第1位至第879位的879个核苷酸。在静止状态下，GPIb并不与可溶性vWf因子结合。体外实验时，二者的相互作用能够被名为瑞斯托菌素(Ristocetin)的抗生素诱导。在高剪切力的作用下，可溶性的vWf因子也能够与该受体相互作用(Lopez，JA.Blood coagul fibrinolysis；1994，5：97-119；Cleme tson，KJ，Clemetson JM.Thromb haemost；199778(1)：266-270；Handa M，Titani K，Holland LZ，et al.J Biol Chem；1986，261：12579-12585)。因此，能够较大量地获得GPIb及其vWf因子结合域的肽段对于深入研究其功能及进一步深化利用，具有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供一种制备人血小板糖蛋白GPIbα的方法及其专用引物。
一种制备人血小板糖蛋白GPIbα的方法，包括以下步骤：
1)设计引物：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3’
2)以细胞总RNA为模板利用RT-PCR钓取GPIb的全长cDNA；
3)构建真核表达重组质粒；
4)将重组质粒导入真核细胞中；
5)培养转染细胞；
6)收集转染细胞分泌的人血小板糖蛋白GPIbα。
所述构建真核表达重组质粒，是将全长cDNA插入经BamH I和EcoR I双酶切处理后的真核表达质粒pcDNA3.1(+)，获得质粒pcDNA3.1-GPF。
所述重组质粒导入的真核细胞是CHO。
为了得到更纯的人血小板糖蛋白GPIbα，所收集的由转染细胞分泌的上清液，应以凝血酶亲合柱纯化。
制备人血小板糖蛋白GPIbα的一对专用引物为：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3
本发明的又一目的是提供一种制备人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子结合域多肽的方法及其专用引物。
一种制备人血小板糖蛋白GPIbαvWf因子结合域多肽的方法，包括以下步骤：
1)设计引物：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’
2)以GPIb的全长cDNA为模板，用PCR法克隆GPIb vWf因子结合域的cDNA。
3)构建真核表达重组质粒；
4)将重组质粒导入真核细胞中；
5)培养转染细胞；
6)收集转染细胞分泌的人血小板糖蛋白GPIb vWf因子。
所述GPIb的全长cDNA是用下述设计引物：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3
以细胞总RNA为模板利用RT-PCR钓取的。
所述构建真核表达重组质粒，是将vWf因子结合域的全长cDNA插入经BamH I和EcoR I双酶切处理后的真核表达质粒pcDNA3.1(+)，获得质粒pcDNA3.1-GP302。
所述重组质粒导入的真核细胞是CHO。
制备人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子结合域多肽的一对专用引物为：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’
GPIb与脂质体组成的复合物是一种潜在的血小板代用品，GPIb还可作为一种有效的诊断、检测和治疗血管内创伤的诊断试剂。利用本发明的方法，可以较大量地获得GPIb及其vWf因子结合域的肽段，为进一步开发新型血小板代用品以及诊断、检测和治疗血管内创伤的诊断试剂提供了坚实的理论及必要的原材料基础。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。附图说明
图1为RT-PCR钓取的GPIb cDNA电泳图谱。
图2为质粒pcDNA3.1(+)图谱。
图3为重组质粒pcDNA3.1-GPF BamH I和EcoR I双酶切鉴定图谱。
图4为用Western-blot检测rhGPIb表达的结果。
图5为PCR扩增的的GP-302电泳图谱。
图6为重组质粒pcDNA3.1-GP302。
图7为用Western-blot检测rhGP-302表达的结果。
图8为瑞斯托菌素诱导的血小板聚集曲线。
图9为rhGP302对瑞斯托菌素诱导的血小板聚集的抑制作用曲线。
图10为rhGPIb对瑞斯托菌素诱导的血小板聚集的抑制作用曲线。具体实施方式
实施例1、制备人血小板糖蛋白GPIbα
制备人血小板糖蛋白GPIbα，包括以下步骤：
1、设计引物：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3
为便于基因定向插入表达载体pcDNA3.1(+)(Invitro公司产品)，在上游引物中引入BamH I酶切位点序列，在下游引物中引入EcoR I酶切位点序列；
2、自人红白血病细胞系TF-I细胞株(CRL-2003 Homo sapiens(human)TF-1)中提取细胞总RNA；
3、用合成的上、下游引物，以提取的细胞总RNA为模板利用RT-PCR钓取GPIb的全长cDNA，如图1所示，图中的带1是核酸分子量Mark：2000，1000，750，500，250，100bp带2显示GPIb(1.9kb)，该步骤中RT-PCR的过程按Roch公司，Titan oneRT-PCR试剂盒操作说明书进行。RT-PCR条件是50μl总反应体系中，依次加入dNTP至终浓度0.2mM，DTT至终浓度5mM，加入RNase Inhibitor 5U，加入上下游引物至终浓度为0.4μM，加入模板RNA 1μg，5×RT-PCR缓冲液10μl，酶混合物(AMV和ExpandHigh Fidelity Taq)1μl(5U/μl)。在PE-2400型PCR仪上按下述条件扩增：50℃，30Min；94℃，2Min；94℃，45s，50℃，45s，68℃，延伸2Min，10个循环；后在94℃，45s，58℃，45s，68℃，延伸2Min，25个循环；再在68℃，延伸7Min。
4、将GPIb的全长cDNA克隆至质粒T-Vector(Promega公司产品)，由上海博亚生物工程公司测定其序列正确；
5、以BamH I和EcoR I双酶切将目的片段自T-Vector切下，回收目的片段，插入与经BamH I和EcoR I双酶切处理后的真核表达质粒pcDNA3.1(+)(其图谱如图2所示)构建pcDNA3.1-GPF，经鉴定正确，如图3所示，带1为pcDNA3.1-GPF，带2为.pcDNA.3.1，带3为核酸分子量Mark：2000，1000，750，500，250，100bp；
6、将重组质粒pcDNA3.1-GPF以脂质体(Lipofectamin)介导的转染方法导入CHO细胞中。由于该质粒包含Neomycin抗性基因，故以G418筛选抗性克隆，以含800μgG418，10％胎牛血清的DMEM培养转染细胞以筛选稳定转染细胞；
7、建立细胞系后，收集细胞上清以鼠抗人GPIb单克隆抗体(Santacraz公司产品)以Western Blot检测其表达，如图4所示，rhGPIb已正确表达；
8、将细胞系在含10％胎牛血清的培养基中培养至细胞80％满底，以无血清的培养基洗细胞，并在无血清培养基中培养24小时，收集含GPIb的上清液；
9、收集后的上清液以凝血酶亲合柱纯化，得到产品。
实施例2、制备人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子结合域多肽
制备人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子结合域多肽，包括以下步骤：
1、设计引物：
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’
为便于基因定向插入表达载体pcDNA3.1(+)(Invitro公司产品)，在上游引物中引入BamH I酶切位点序列，在下游引物中引入EcoR I酶切位点序列；
2、自人红白血病细胞系TF-I细胞株(CRL-2003 Homo sapiens(human)TF-1)中提取细胞总RNA；
3、下述的上、下游引物，以提取的细胞总RNA为模板利用RT-PCR钓取GPIb的全长cDNA，
上游：5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’
下游：5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3
4、以GPIb cDNA为模板，用步骤1合成的上、下游引物，PCR法克隆GPIb vWf因子结合域的cDNA，如图5所示，其中带1显示GPIb vWf因子结合域，带2是核酸分子量Mark：2000，1000，750，500，250，100bp；该步骤中PCR的条件是50μl总反应体系中，依次加入dNTP至终浓度0.2mM，MgCl2至终浓度2.5mM，加入上下游引物至终浓度为0.4μM，加入0.5μg模板，10×RT-PCR缓冲液5μl，Taq酶1μl(5U/μl)。在PE-2400型PCR仪上按下述条件扩增：94℃，5Min；94℃，45s，60℃，45s，72℃，延伸1Min，共30个循环；再在72℃，延伸7Min。
5、将GPIb vWf因子结合域的cDNA克隆至质粒T-Vector(Promega公司产品)，由上海博亚生物工程公司测定其序列正确；
6、以BamH I和EcoR I双酶切将目的片段自T-Vector切下，回收目的片段，插入与经BamH I和EcoR I双酶切处理后的真核表达质粒pcDNA3.1(+)(其图谱如图2所示)构建pcDNA3.1-GP302，经鉴定正确，如图6所示，带1为pcDNA3.1-GP302，带2为.pcDNA.3.1，带3为核酸分子量Mark：2000，1000，750，500，250，100bp；
7、将重组质粒pcDNA3.1-GP302以脂质体(Lipofectamin)介导的转染方法导入CHO细胞中。由于该质粒包含Neomycin抗性基因，故以G418筛选抗性克隆，以含800μg G418，10％胎牛血清的DMEM培养转染细胞以筛选稳定转染细胞；
8、建立细胞系后，收集细胞上清以鼠抗人GPIb单克隆抗体(Santacraz公司产品)以Western Blot检测其表达，如图7所示，rhGPIb vWf因子结合域的多肽已正确表达；
9、将细胞系在含10％胎牛血清的培养基中培养至细胞80％满底，以无血清的培养基洗细胞，并在无血清培养基中培养24小时，收集含GPIb vWf因子结合域多肽的上清液；
10、收集后的上清液以凝血酶亲合柱纯化，得到产品。
实施例3、瑞斯托菌素诱导血小板凝集试验的抑制作用
从健康人采集全血按1∶10与3.14％的柠檬酸钠混合，100g离心15分钟收集富含血小板的上清(PRP)，以无血小板的血清(PPP)调节血小板浓度为300×106/ml。上述两个实施例中得到的纯化重组蛋白质稀释成不同的浓度，先与PRP在室温孵育5分钟后，将瑞斯托菌素加入PRP中至终浓度为1.5mg/ml，在血小板聚集仪上测定凝集率，结果如图8、图9、图10所示，5分钟内瑞斯托菌素诱导的血小板最大聚集率、rhGP302对瑞斯托菌素诱导的血小板最大聚集率、rhGPIb对瑞斯托菌素诱导的血小板最大聚集率分别为89、39和48，结果表明：两种重组蛋白质均具有对瑞士托菌素诱导的血小板凝集有抑制作用。