间氨基苯硼酸亲和层析法纯化的糖基化蚓激酶及纯化方法 技术领域
本发明涉及一种分离纯化蚯蚓纤溶蛋白酶(蚓激酶)的方法，特别是涉及一种用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从蚯蚓中分离纯化出单一的稳定的糖基化蛋白组分，且具有较高的纤溶蛋白酶活性的方法。
背景技术
近年来人们采用盐析、超滤、分子筛、离子交换、高压液相色谱等分离方法，从蚯蚓中分离出一系列蛋白酶。体外平板法说明这些蛋白酶既可以激活纤溶酶原又能够直接降解纤维蛋白，因此被命名为蚓激酶(蚯蚓纤溶酶)。临床实验表明口服蚓激酶对心脑血管栓塞的防治效果明显。但是目前普遍采用的口服蚓激酶制剂是各个组分的混合物，吸收效率低，存在一定的毒副作用，并且对急救栓塞无能为力，针剂的研究势在必行，因此我们必须进一步纯化蚓激酶。目前国外有文章如：Nakajima，N.，Mihara，H.and Sumi，N.(1993)Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm，Lumbricusrubellus.Biosci.Biotech.Biochem.57，1726-1730；一直认为蚓激酶是一组非糖基化的同源蛋白酶，他们已经进行过系统研究的纯化的蚓激酶片段都是非糖基化的。这些蚓激酶保存过程中有一定程度的自降解，另外作为针剂毒性都很大，又如文献2：(Nakajima，N.，Sugimoto，M.，and Ishihara，K.(2000)Stable earthworm serine proteases：Application of the protease function andusefulness of the earthworm autolysate.Journal of Bioscience andBioengineering 90，174-197所介绍的。国内有人利用制备型电泳法分离出了糖基化的蚓激酶组分又如文献3：“蚯蚓纤溶酶组分的分离纯化和分析”，[生物化学与生物物理进展]，2001，28(2)赵晓瑜，静天玉；他们将样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色，切出所需条带，置电泳洗脱槽进行电泳洗脱，根据紫外光吸收回收样品。这种方法虽然得到了糖基化的蚓激酶组分，但仅仅适合于实验室内的样品微量制备，同时，其操作复杂，成本高，回收率低，很难直接用于中试或大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于：克服已有蚓激酶分离技术中存在的方法复杂，成本高，收率低等缺陷；为了提高蚓激酶的药效，进一步开发针剂创造条件；本发明通过配基上地硼-羟基与糖基化蚓激酶糖链上的羰基结合，而得到比非糖基化组分稳定性更强，体内半衰期更长，且毒性更低的糖基化单一组分的目的；为了达到快速有效的大批量分离糖基化蚓激酶组分，实现产业化生产；从而提供一种以简单的操作，低成本的间氨基苯硼酸亲和层析法纯化蚯蚓蛋白酶的方法；也在其他糖蛋白的分离纯化方面做出有益探索。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供的一种间氨基苯硼酸亲和层析法纯化糖基化蚓激酶，其特征是：所述的蚯蚓蛋白酶具有N-末端序列为N-Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Pro-Asp-Ile-的蛋白质。该糖基化蚓激酶纯度的聚丙烯酰胺电泳检测图如图1所示；本发明得到的糖基化蚓激酶组分采用生色底物法进行的活力测定图如图2所示。
本发明提供的采用间氨基苯硼酸亲和层析法纯化糖基化蚓激酶的方法，包括以下步骤：
1)选取琼脂糖做填料；所选取的琼脂糖可采用通常的的条件进行琼脂糖填料的活化，也可以不进行琼脂糖填料的活化；
2)采用间氨基苯硼酸作为亲和层析树脂的配基：将间氨基苯硼酸溶解在0.2M NaHCO3缓冲液中，或为了使配基更好地溶解缓冲液中，还包括加入pH＝8.5，0.15M NaCl，浓度为10～100g/L，然后与活化后的琼脂糖填料按1∶5～5∶1(V/V)混合，搅拌0.5-2小时，在温度为4℃-40℃下，使配基连接到琼脂糖填料上；
3)装柱，用终浓度分别为0.01-0.05M的天门冬酰氨，0.01-0.05M氯化镁及0.01-0.05％的叠氮化钠的混合液平衡，平衡液的pH范围是6.0～14；
4)上样：样品是经过通常的自溶、匀浆、盐析等方法得到的蚯蚓粗提物，上样时样品浓度为0.5～5mg/mL，体积为柱体积的1/10～1/3；上样缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH5.0～14，浓度为5～50mM；
5)非特异性洗脱采用终浓度分别为0.001-0.01M的Tris-HCl，0.001-0.005M的天门冬酰氨，0.05-0.5M氯化镁及0.01-0.05％的叠氮化钠的混合液作洗脱液，非特异洗脱液的pH范围是6～12；特异性洗脱以终浓度分别为0.05-0.5M的Tris-HCl，0.001-0.01M天门冬酰氨，0.1-1.0M顺式糖及0.01-0.05％叠氮化钠的混合液作为洗脱液，特异性洗脱液的pH范围是pH5.0～10；收集特异性洗脱下来的糖基化蚓激酶。为了进一步纯化分离蚯蚓蛋白酶，还包括：
6)采用通常的透析和分子筛法除盐；
7)采用通常的工艺浓缩：超滤，冻干，即可得到单一稳定的糖基化蛋白组分，且具有很高的纤溶蛋白酶(蚓激酶)活性。
所述的琼脂糖填料，包括：Sepharose-6B，Sepharose-CL-6B，Sepharose-4B，以及Sepharose-CL-4B.
本发明还包括将得到的产物进行检测：用电泳仪进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为8-15％。并根据周靓的生色底物法测活(Zhou，J.，Fan，R.，Wu C.and He R.Q.(1997)Assay of lumbrokinase with a chromophoric substrate.Protein and Peptide letters 4，409-414)。
本发明的优点：间氨基苯硼酸作为亲和层析树脂的配基，能特异性结合N-末端氨基及赖氨酸侧链氨基糖化的蛋白质，分辨能力强。电泳结果表明由本发明分离得到的糖基化蚓激酶组分是单一条带(如图1所示)。N-末端序列为N-Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Pro-Asp-Ile-是一种新的蛋白质。利用生色底物进行测活，结果表明该组分具有很强的纤溶活性(如图2所示)，因此可以制成针剂或疗效更强的口服液。通常糖链对蛋白质有保护作用，不仅可以延长蚓激酶在体外的保存时间，也能提高它在体内的半衰期，同时降低免疫毒性。因此本方法得到的这一崭新的蚓激酶组分具有很强的应用潜力。更重要的是此方法工艺简洁，设备简单，成本低，原料来源丰富，适用于规模化生产。
附图说明图1是本发明得到的糖基化蚓激酶纯度的聚丙烯酰胺电泳检测图图2是采用生色底物法对本发明得到的糖基化蚓激酶组分进行的活力测定图
具体实施方式下面结合实施例和附图对本方法进行详细说明实施例1：
用羰基二咪唑活化琼脂糖填料Sepharose-CL-6B，采用间氨基苯硼酸作为亲和层析树脂的配基：将间氨基苯硼酸溶解在0.2M NaHCO3缓冲液(pH＝8.5，0.15M NaCl)中，浓度为10g/L，然后与活化后的琼脂糖填料按5∶1(V/V)混合，搅拌2小时(4℃)，使配基连接到琼脂糖填料上，装柱。用pH＝6.0的终浓度分别为0.01M天门冬酰氨，0.01M氯化镁及0.01％叠氮化钠的混合液平衡。
称取赤子爱胜蚓粗提物的冻干粉，溶于pH＝5.0的Tris-HCl缓冲液中，终浓度为0.5mg/mL。上样量为柱体积的1/3。用pH＝6.0，0.001M的Tris-HCl，0.001M的天门冬酰氨，0.05M氯化镁及0.01％的叠氮化钠作洗脱液，除去非特异性结合的杂蛋白。然后用pH＝5.0，0.05M的Tris-HCl，0.001M的天门冬酰氨，0.1MD-山梨醇及0.01％的叠氮化钠进行特异性洗脱。收集糖基化蚓激酶。
透析除盐后，超滤浓缩。浓缩液冻干后称重为0.1mg。
配制SDS-PAGE电泳凝胶，分离胶浓度为15％，100V电泳。得到的结果如图1所示。采用Chromozym-TH作为生色底物，以pH＝8.3的Tris-HCl作为反应缓冲液，测定OD385的变化，结果表明所得的糖基化蚓激酶组分纤溶活性很高，相当于35ΔA·g-1·min-1，如图2所示。实施例2：
用溴化氰活化Sepharose-CL-4B，采用间氨基苯硼酸作为亲和层析树脂的配基：将间氨基苯硼酸溶解在0.2M NaHCO3缓冲液(pH＝8.5，0.15M NaCl)中，浓度为100g/L，然后与活化后的琼脂糖填料按1∶5(V/V)混合，搅拌0.5小时(40℃)，使配基连接到琼脂糖填料上，装柱。用pH10.2，终浓度分别为0.02M天门冬酰氨，0.02M氯化镁及0.02％叠氮化钠三者混合液平衡。
称取粉正蚓粗提物的冻干粉，溶于Ph14的Tris-HCl缓冲液中，终浓度为5mg/mL。上样量为柱体积的1/10。用pH12，终浓度分别为0.01M的Tris-HCl，0.005M的天门冬酰氨，0.5M氯化镁及0.05％的叠氮化钠四者混合液作洗脱液，除去非特异性结合的杂蛋白。然后用pH10，终浓度分别为0.5M的Tris-HCl，0.01M的天门冬酰氨，1.0MD-果糖及0.05％的叠氮化钠四者混合液进行特异性洗脱。收集糖蛋白。
透析除盐后，超滤浓缩。浓缩液冻干后称重为0.14mg。
配制SDS-PAGE电泳凝胶，分离胶浓度为8％，100V电泳。结果表明得到的蛋白是单一组分。采用Chromozym-TH作为生色底物，以pH＝8.3的Tris-HCl作为缓冲液测定OD385的变化，结果表明所得的糖基化蚓激酶组分纤溶活性很高，相当于27ΔA·g-1·min-1。实施例3：
用羰基二咪唑活化Sepharose-6B，采用间氨基苯硼酸作为亲和层析树脂的配基：将间氨基苯硼酸溶解在0.2M NaHCO3缓冲液(pH＝8.5，0.15M NaCl)中，浓度为10～100g/L，然后与活化后的琼脂糖填料按1∶1(V/V)混合，搅拌1小时(室温)，使配基连接到琼脂糖填料上，装柱。用pH8.75，终浓度分别为0.02M的天门冬酰氨，0.02M氯化镁及0.02％的叠氮化钠三者混合液平衡。
称取锯齿远蚓粗提物的喷雾干粉，溶于pH9.0的Tris-HCl缓冲液中，终浓度为1mg/mL。上样量为柱体积的1/5。用pH11.0，终浓度分别为0.001M的Tris-HCl，0.002M的天门冬酰氨，0.1M氯化镁及0.02％的叠氮化钠四者混合液作洗脱液，除去非特异性结合的杂蛋白。然后用pH9.2，终浓度分别为0.1M的Tris-HCl，0.005M的天门冬酰氨，0.2MD-葡萄糖及0.02％的叠氮化钠四者混合液进行特异性洗脱。收集糖蛋白。
透析除盐后，超滤浓缩。浓缩液冻干后称重为0.2mg。
配制SDS-PAGE电泳凝胶，分离胶浓度为15％，100V电泳。结果表明得到的蛋白是单一组分。采用Chromozym-TH作为生色底物，以pH＝8.3的Tris-HCl作为缓冲液测定OD385的变化，结果表明所得的糖基化蚓激酶组分纤溶活性很高，相当于25ΔA·g-1·min-1。