一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备方法和用途.pdf

本发明公开了一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，步骤如下：(1)取忍冬叶，用8-10倍量的乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.0-1.1，得初提液；(2)将初提液加入等体积的蒸馏水制成悬浮液，将悬浮液用正丁醇进行萃取，正丁醇相减压浓缩至相对密度为1.2-1.3，得正丁醇萃取物；(3)将正丁醇萃取物采用聚酰胺填料进行富集分离，洗脱溶剂为乙醇-水，乙醇、水的体积比为10:90～20:80；(4)合并步骤(3)洗脱后的溶液，浓缩，得浸膏，即为咖啡酰奎宁酸类提取物。本发明制备的提取物中咖啡酰奎宁酸的重量百分含量为65-76％。本发明的咖啡酰奎宁酸类提取物具有较强的抗新城疫病毒的活性，具有潜在的开发应用价值。

1.  一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取忍冬叶，用8-10倍量的乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.0-1.1，得初提液；
(2)将步骤(1)制备的初提液，加入等体积的蒸馏水制成悬浮液，将悬浮液用正丁醇进行萃取，正丁醇相减压浓缩至相对密度为1.2-1.3，得正丁醇萃取物；
(3)将步骤(2)制备的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料进行富集分离，洗脱溶剂为乙醇-水，乙醇、水的体积比为10:90～20:80；
(4)合并步骤(3)洗脱后的溶液，浓缩，得浸膏，即为咖啡酰奎宁酸类提取物。

2.  权利要求1所述的制备方法得到的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物，其特征在于，所述提取物中咖啡酰奎宁酸的重量百分含量为65-76％。

3.  如权利要求2所述的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物，其特征在于，所述咖啡酰奎宁酸类化合物包括绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸和新绿原酸。

4.  权利要求2所述的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物在制备抗新城疫病毒的药物中的应用。

5.  一种抗新城疫病毒的药物制剂，其特征在于，该药物制剂以含有药学有效量的权利要求2所述的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物为有效成分。

6.  如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，该药物制剂与药用辅料混合，以常规方法制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂或注射剂。

7.  如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述的药用辅料为甘露糖醇、淀粉、甜菊苷、山梨糖醇、纤维素衍生物、硬脂酸镁、聚乙二醇或注射用溶剂中的一种或几种。

8.  如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述纤维素衍生物为结晶纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素钠。

9.  如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述注射用溶剂为水、乙醇或甘油。

一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备方法和用途，属于天然产物化学技术领域。
背景技术
忍冬(Lonicera japonica Thunb.)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)多年生常绿缠绕藤本植物，是我国传统中药，具有清热解毒、抗菌消炎等多种药用功效。忍冬药用部位在历史上经历了茎叶-茎叶花-花的变迁历程。目前，忍冬不同药用部位在《药典》中区分开来，金银花(Jinyinhua，Lonicera japonica flos)，本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥”。忍冬藤(Rendongteng，Lonicera japonica caulis)，本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。秋、冬二季采割，晒干”。忍冬花因其产量有限，常供不应求。而忍冬叶与花同株，为了保证花蕾的正常生长，忍冬需多次修剪整形，每年可得大量的叶，而这些忍冬叶为忍冬传统的废弃部分，一直被视为非药用部位而长期未得到利用，浪费现象十分严重。
新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的主要侵害鸡和火鸡等禽类的一种急性、高度接触性传染病，被国际兽医局列为对动物危害最大的A类传染病。尽管国内对ND采取了密集的预防措施，但是缺乏有效的防治药物，其发病率一直居高不下，仍是目前影响养鸡业健康发展的主要传染病之一。
目前，国内、外关于忍冬及其提取物的药用报道主要是关于艾滋病防治、抗癌、抗炎和止痛等方面，未见有关于忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物用于防治新城疫病毒的报道。鉴于当前新城疫病毒疾病的发生和流行速度已经超过疫苗的研制速度，以及农业部2012年发文的禁止将人类使用的抗病毒药物，如金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、利巴韦林等应用到家畜药物中，以保障家畜产品安全；因此，将天然植物提取物开发成适合于新城疫病毒防治的药物势在必行。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备方法。
本发明的另一目的是提供该咖啡酸奎宁酸提取物在制备抗新城疫病毒药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物，所述提取物中咖啡酰奎宁酸的重量百分含量为65-76％。
本发明的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取忍冬叶，用8-10倍量(g/ml)的乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.0-1.1(50℃测)，得初提液；
(2)将步骤(1)制备的初提液，加入等体积的蒸馏水制成悬浮液，将悬浮液用正丁醇进行萃取，正丁醇相减压浓缩至相对密度为1.2-1.3(50℃测)，得正丁醇萃取物；
(3)将步骤(2)制备的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料进行富集分离，洗脱溶剂为乙醇-水，乙醇、水的体积比为10:90～20:80；
(4)合并步骤(3)洗脱后的溶液，浓缩，得浸膏，即为咖啡酰奎宁酸类提取物。
经检测，该方法制备的提取物中，咖啡酰奎宁酸类化合物的重量百分含量为65-76％，所述咖啡酰奎宁酸类化合物主要包括绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸和新绿原酸。
本发明还提供了该忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物在制备抗新城疫病毒的药物中的应用。
本发明还提供一种抗新城疫病毒的药物制剂，该药物制剂以含有药学有效量的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物为有效成分。
该药物制剂可以进一步与药用辅料混合，以常规方法制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂或注射剂；给药形式为口服给药或注射给药。
所述的药用辅料为甘露糖醇、淀粉、甜菊苷、山梨糖醇、纤维素衍生物、硬脂酸镁、聚乙二醇或注射用溶剂中的一种或几种；
所述纤维素衍生物为结晶纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素钠；
所述注射用溶剂为水、乙醇或甘油。
本发明的有益效果：
(1)本发明的咖啡酰奎宁酸类提取物制备方法能耗低、污染小、工艺简单、适合进行工业化生产。
(2)本发明制备方法得到的咖啡酰奎宁酸类提取物中，咖啡酰奎宁酸的重量百分含量为65-76％，可直接入药，无需进一步纯化。
(3)试验证明本发明的咖啡酰奎宁酸类提取物具有较强的抗新城疫病毒的活性，具有潜在的开发应用价值。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备
(1)取干燥后的忍冬叶100克，用800mL乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.1(50℃测)，得初提液；
(2)将步骤(1)制备的初提液，加入等体积的蒸馏水制成悬浮液，将悬浮液用正丁醇进行萃取，正丁醇相减压浓缩至相对密度为1.3(50℃测)，得正丁醇萃取物；
(3)将步骤(2)制备的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料进行富集分离，洗脱溶剂为乙醇-水，乙醇、水的体积比为10:90～20:80。
(4)合并步骤(3)洗脱后的溶液，减压浓缩至相对密度为1.3(50℃测)，得浸膏，即为咖啡酰奎宁酸类提取物。
该提取物的特征：提取物呈淡黄色，采用紫外可见分光光度法对提取物进行检测，对照品为绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸和新绿原酸，检测波长325nm。提取物中咖啡酰奎宁酸类化合物的重量百分含量为72.5％主要包括绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸和新绿原酸。
实施例2：抗新城疫病毒的药物制剂的制备
药物组方：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物80份，黄芪多糖10份，甘露糖醇20份，聚乙二醇15份。
忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法同实施例1。
将上述药物组方按常规方法制备成颗粒剂。
实施例3：忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物抗新城疫病毒鸡胚试验
一、对鸡胚的毒性试验
(1)试验药物：本发明实施例1制备的咖啡酰奎宁酸类提取物，用PBS配成200、100、50和25mg/mL；
(2)试验方法：将制备的药品在生物安全柜中采用绒毛尿囊腔接种法接种11日龄SPF鸡胚，接种量0.2mL/胚，每个浓度接胚5枚鸡胚，接种后石蜡封口，放于37℃温箱中孵育，每天翻肧2次，观察鸡胚生长情况并记录鸡胚死亡情况，弃去24h内的死胚，连续观察5d。将24h后死去的鸡胚放入4℃冰箱，次日无菌收集尿囊液3000r/min离心15min，取各鸡胚尿囊液进 行血凝试验。5d后将所有鸡胚放入4℃冰箱过夜，次日进行血凝试验。
血凝试验的方法为：
①取96孔V型血凝板，每孔加入25μL新配制的PBS；
②吸取尿囊液25μL于第1孔中，充分混匀后从第1孔吸25μL于第2孔，以此类推倍比稀释，至第10孔；第11、12孔分别加入阴性尿囊液对照、和阳性病毒对照；
③每孔加入25μL鸡红细胞悬浮液(1％)；
④震荡摇匀后，放入37℃温箱中孵育15min，对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。
⑤结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。
(3)试验结果
不同浓度的忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类提取物对鸡胚的毒性试验结果见表1。
表1 不同浓度的咖啡酰奎宁酸类提取物接种鸡胚的鸡胚死亡数量(5枚/组)