岗哨病毒II 技术领域
本发明涉及病毒领域，且更详细地讲，涉及肝炎病毒。
背景技术
严格定义的术语“肝炎”表示肝的炎症。各种各样不同的化学因子、病毒因子以及生物学因子会诱发肝炎。然而，术语肝炎更通常地表示由病毒感染、尤其是嗜肝病毒的感染引起的肝的炎症。
可以将病毒性肝炎分成两大类别：急性的和慢性的。急性病毒性肝炎的特征为黄疸、不适、恶心以及血液中肝脏之酶升高。虽然病毒性肝炎的大多数病例自发地消退，但是一部分急性肝炎受害者(一般低于约10％)发生暴发性坏死性肝炎，这是一种发病率和死亡率非常高的病症。有趣的是，许多急性肝炎病例是如此之轻微，以致于被忽略过去或将其作为“流感”消除。慢性肝炎引起更加重大的公共健康问题，且在美国是肝移植的最常见的原因。慢性肝炎地特征为加重或“突然发作”，伴有类似急性肝炎的症状，以及门静脉血压过高和导致肝衰竭的肝硬变(肝的瘢痕形成)。因为急性肝炎感染可以不引人注意地进行，所以许多慢性肝炎患者直到他们的疾病颇为发展后才被诊断出来；这样则限制了治疗的选择。
有六个不同的病毒家族叫做“肝炎病毒”(A、B、C、D、E和G，已发现F是人工产物(artifactual))。在发达国家里，根据公共卫生的观点，普遍认为能建立慢性感染的那些肝炎病毒是最重要的病毒。在所述肝炎病毒中，只有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是已知建立与慢性肝炎有关之慢性感染的已知肝炎病毒。然而，HBV和HCV并不是造成所有输血性肝炎病例的原因。用术语“原因不明性肝炎”和“非A-G”来表示不能归因于已知肝炎病毒的输血性肝炎。
先前称为“输血性肝炎”的乙型肝炎由经皮途径、性途径、以及垂直途径传播。作为嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)一员的乙型肝炎病毒，既能引起急性肝炎，又能引起慢性肝炎。乙型肝炎病毒(HBV)已被充分表征，且各种各样的筛选和诊断分析通常可以得到的。另外，在美国已产生了一种目前大多数学龄儿童所需的重组疫苗。
先前称为“非甲非乙型肝炎”的丙型肝炎主要通过经皮途径传播，虽然像HBV一样，也存在性途径以及垂直途径传播。仅有少数的急性丙型肝炎病毒(HCV)感染是临床上显而易见的；这是成问题的，因为这种病毒以非常高的比率建立慢性感染。在美国，这种组合使慢性HCV感染成为肝移植的主要原因。
用于检测所捐献血液中抗HBV和/或HCV抗体的筛选分析的出现，显著地减少了“输血性肝炎”的传播。然而，传染性血液捐赠的20-30％仍处于没被发现的状态。相信未能检测出这些传染性样品主要是由于存在一种或更多种尚未鉴定出的肝炎病毒。
新近，除了六种已知肝炎病毒外，也鉴定出了与肝炎有关的新病毒。由日本的一个小组最先鉴定出称为TTV的病毒；该小组使用表现度差异分析(RAD)技术鉴定出了得自该病毒的基因组序列(Nishizawa等，1997，Biochem.Biophys.Res.Common，241(1)：92-97)。最初被认为是细小病毒科(Parvoviridae)中一员的这种病毒，是一种浮力密度大大低于细小病毒科之病毒浮力密度的相对小的病毒。由于TTV的环状单链DNA基因组，已提出TTV为称为环状病毒科(Circinoviridae)的病毒科中与人相关的原型成员(Mushahwar等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(6)：3177-3182)。
近来，Diasorin，Inc.已宣布分离出了一种新的肝炎病毒。过后，发现称为SEN-V的该病毒在健康群体中非常流行，并不限于来自肝炎患者的血液样品；因而不大可能是一种肝炎病毒。他们既未公开SEN-V的多核苷酸序列，又未公开分离SEN-V的方法。
因此，在本技术领域，不仅需要用于检测非甲/非庚型肝炎的组合物和方法，而且需要用于预防非甲/非庚型肝炎传染的组合物和方法以及治疗非甲/非庚型肝炎感染的组合物和方法。
发明的公开
我们发现了一种与原因不明性非甲/非庚型肝炎有关的新病毒。已从中衍生出各种各样有价值的发明，所述发明提供例如：
1)包含分离的SVII病毒的组合物。分离的SVII病毒的实例包括包含图1的多核苷酸序列的分离的病毒。
2)分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：可选择性地与图1的核苷酸序列及其互补链杂交的分离的多核苷酸；编码分离的SVII蛋白或其片段的分离的多核苷酸及其互补链。所述分离的多核苷酸可以是一种反义多核苷酸。
3)包含一种分离的SVII蛋白或其片段的组合物。
4)包含一种分离的SVII蛋白或其片段的疫苗组合物。所述疫苗组合物可包括一种药学可接受的赋形剂和/或一种佐剂。
5)包含一种编码一种SVII蛋白或其片段之分离的多核苷酸的表达载体。
6)包含一种分离的多核苷酸的表达载体；其中，所述分离的多核苷酸的转录导致一种SVII反义多核苷酸的产生。
7)与一种SVII病毒或其蛋白结合的分离的多克隆抗体和单克隆抗体。
8)用于检测SVII病毒的方法，所述方法包括使样品与一种与SVII病毒或其一种蛋白结合的抗体接触，以及检测所述抗体与SVII病毒或其蛋白之复合物。
9)用于检测SVII病毒的方法，所述方法包括使样品与一种选择性地同SVII多核苷酸杂交的探针多核苷酸接触，以及检测所述探针与SVII多核苷酸的杂交。
10)用于检测SVII病毒的方法，所述方法包括使样品与一种选择性地和SVII多核苷酸杂交的第一引物多核苷酸及一种和SVII多核苷酸互补物杂交的第二引物多核苷酸相接触，从而进行引物延伸的DNA合成；以及检测所述合成产物。
附图简述
图1显示了来自一个岗哨病毒(Sentinel Virus)II(SVII)克隆的核苷酸序列以及概念上的可读框的翻译(使用标准的单字母编码；k、m、r、s、y和w相应地各表示T/G、A/C、G/A、G/C、T/C、A/T)。把称为“正的”链注上标记“+”，且把其相反的互补物注上标记“-”。编号是指+链的核苷酸序列。也显示了可读框P1、M1和M2。从右到左地读-链和M1及M2的阅读框架。
发明详述
我们发现并分离了与原因不明性非甲-庚型肝炎有关的一种新的肝炎病毒，称之为岗哨病毒II(SVII)。所述原型病毒包括一个至少约371个碱基的DNA基因组。在图1中显示了来自所述原型病毒的基因组序列。相应地，本发明提供分离的SVII。
在一个方面，本发明提供分离的、包含SVII病毒基因组及其片段的多核苷酸。所述多核苷酸可以是DNA或RNA。也提供供检测SVII感染和/或SVII病毒本身之用的分离的核苷酸探针或引物。同样可以将所述探针和/或引物用于鉴定与分离SVII新变异体的方法中。
本发明的另一方面提供分离的SVII病毒蛋白及/或其片段以及包含与异源(非SVII)蛋白融合的SVII病毒蛋白或其片段的融合蛋白。也包括至少包含两个SVII表位的嵌合多肽。在包含来自同一SVII蛋白的两个表位的本发明嵌合多肽中，使在所述表位之间插入的氨基酸基本上缺失，或用异源序列取代。另一方面，本发明嵌合多肽可包含来自不同SVII蛋白的两个表位，或包含来自SVII家族的至少两种病毒的同源表位。
本发明提供重组表达构成物，所述构成物包含与在原核或真核宿主细胞中可操纵的启动子可操作地连接的、来源于SVII病毒可读框的多核苷酸序列。也提供表达载体及包含所述表达构成物的重组宿主细胞。
也提供对SVII病毒家族之表位特异性的抗体。包括单克隆抗体和分离的多克隆抗体。
在另一方面，本发明提供用于检测SVII感染和/或检测SVII病毒的测定和用于进行所述测定的试剂盒。本发明的测定可以是使用本发明多肽或抗体的免疫测定，或者是基于核酸的、用一种或更多种本发明多核苷酸而使用杂交或扩增技术的测定。
在另外一个方面，本发明提供用于预防和/或治疗SVII感染的疫苗。所述疫苗可以是基于蛋白的疫苗，或者可以是基于DNA的疫苗。基于蛋白的疫苗包含一种或更多种来源于SVII的多肽，可任意选择地将其与一种佐剂组合。基于DNA的疫苗包含一种编码SVII多肽或多肽片段的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与在待接种受体体内有活性(例如如果待接种的受体是人类，则在人类细胞中有活性)的启动子可操作地连接。一般性的技术
除非另有说明，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术；所述常规技术是在本领域技术范围内的。在下述文献中全面说明了这样的技术，所述著作例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”第二版(Sambrook等，1989)、“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)、“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)、“Methods inEnzymology”(Academic Press，Inc.)、“Handbook of ExperimentalImmunology”(D.M.Weir&C.C.Blackwell编辑)、“Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cell”(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)、“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编辑，1987，和周期性更新材料)、“PCR：The Polymerase Chain Reaction”(Mullis等编辑，1994)、“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan等编辑，1991，和周期性更新材料)以及“Immunochemistry in Practice”(Johnstone和Thorpe编辑，1996，Blackwell Science)。定义
术语“岗哨病毒II”和“SVII”是指在人类中可通过经皮肤暴露而传播且在血清学上与甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)以及庚型肝炎病毒(HGV)截然不同的病毒、病毒类型或病毒类别。SVII包括一个具有主要可读框(ORF)的基因组，所述可读框与图1的氨基酸序列有至少大约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同源性和/或与图1的氨基酸序列有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的核苷酸全序列同一性。另一方面，“SVII变异体”可以与图1的序列有至少大约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的核苷酸全序列同一性，并编码一个与图1的氨基酸序列有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同源性和/或至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同一性的ORF。
“SVII多肽”或“SVII蛋白”是由SVII病毒基因组的ORF编码的一种多肽。典型的SVII多肽显示于图1所示的氨基酸序列。SVII多肽最好是至少约8、10、12、15、20、25、30、40或50个氨基酸，且可以少于约250、200、150、134、125、110、100、90、80、70、60或50个氨基酸；其中，除了上限始终是大于下限之外，独立地选择上限和下限。
“变异型SVII多肽”是一种与图1中任一相应氨基酸序列具有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同源性和/或与图1中任一氨基酸序列的相应部分有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的多肽。变异型SVII多肽最好是至少约8、10、12、15、20、25、30、40或50个氨基酸且可以少于约250、200、150、134、125、110、100、90、80、70、60或50个氨基酸；其中，除了上限始终是大于下限之外，独立地选择上限和下限。
“SVII多核苷酸”是一种与图1中所示多核苷酸或其片段具有等同序列的多核苷酸或其互补物，或者是一种编码SVII多肽的多核苷酸或其互补物。SVII多核苷酸的长度最好是至少约15、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸且少于约371、350、300、250、200、150、125、75、50、40或30个核苷酸；其中，除了上限始终是大于下限之外，独立地选择上限和下限。所关注的多核苷酸的“互补物”是一种根据Watson/Crick碱基配对而具有所述参比多核苷酸的反相互补性的多核苷酸。在合适条件下，运用Watson/Crick碱基配对，互补的多核苷酸能够杂交到所述参比多核苷酸上。
“变异型SVII多核苷酸”是一种编码变异型SVII多肽的多核苷酸或其互补物；或者是一种可选择性地与SVII多核苷酸或其互补物杂交、但不落入SVII多核苷酸定义范围内的多核苷酸。在任何已知的序列中，都未发现变异型SVII多核苷酸。变异型SVII多核苷酸的长度最好是至少约15、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸且少于约400、370、367、350、300、200、150、125、100、75或50个核苷酸；其中，除了上限始终是大于下限之外，独立地选择上限和下限。
“氨基酸序列同源性”和“氨基酸序列同一性”是指在比较两种序列时同源或相同的氨基酸的百分数。运用本技术领域已知的软件程序，可确定这种序列比对以及序列同源性或序列同一性的百分数，所述软件程序例如在Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987)附录30的7.7.18节之表7.7.1中描述的那些程序。至于序列比对，最好用缺省参数。对本发明来说，所述序列比对程序为BLASTP，使用下面的缺省参数：数据库(databases)＝非冗余的(non-redundant)(非冗余GenBank CDS翻译(all non-redundant GenBankCDS translations)+PDB+SwissProt+PIR+PRE)，低复杂性过滤(lowcomplexity filtering)＝ON，预期值(expect)＝10，矩阵(matrix)＝BLOSUM62(空位存在罚分(gap existence cost)11，每残基空位(gap perresidue)为1，λ0.85)且字串大小(word size)＝3。可引入空位或不引入空位地进行序列比对，且优选引入空位进行序列比对。按下面的因特(Internet)网网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST，可得到以上所述BLASTP执行程序和这些参数的详情。
“核苷酸序列同一性”表示在比较两种序列时相同核苷酸残基的百分数。运用本技术领域已知的软件程序，可确定这种序列比对以及序列同一性的百分数，所述软件程序例如在Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987)附录30的7.7.18节之表7.7.1中描述的那些程序。至于序列比对，最好用缺省参数。对本发明来说，所述序列比对程序为BLASTN，使用下面的缺省参数：数据库＝非冗余的(全部非冗余的GenBank(all non-redundant GenBank)+EMBL+DDBJ+PDB序列)，低复杂性过滤＝ON，预期值＝10，矩阵＝BLOSUM62，空位存在罚分＝5，空位扩展罚分＝2，错配处罚(mismatch penalty)＝-3，匹配奖分＝1，且字串大小＝11。可引入空位或不引入空位地进行序列比对，且优选引入空位进行序列比对。按下面的因特(Intetnet)网网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST，可得到以上所述BLASTN执行程序和这些参数的详情。
与SVII多核苷酸序列“可选择性地杂交”的多核苷酸是(i)一种与SVII多核苷酸序列杂交而不与已知病毒多核苷酸序列杂交的多核苷酸；或者是一种特异性地引发SVII多核苷酸序列扩增而不引发已知病毒多核苷酸序列扩增的多核苷酸。可以适当地在高度严格、中等严格或低度严格(例如考虑到错配)的条件下，完成可选择性杂交多核苷酸的杂交。高度严格条件利用一种决定性的、低于所期望杂合体的Tm12-20℃的洗涤，而中等严格杂交和低度严格杂交利用决定性的、低于所述杂合体的Tm 21-30℃和31-40℃的洗涤条件。按照Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/N，可以得到长链多核苷酸的Tm，这里N＝所研究的可选择性杂交的多核苷酸的长度；而按照Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-600/N，可以得到长度大约从70个核苷酸至15个核苷酸的寡核苷酸的Tm；按照Tm＝2(A+T)+4(G+C)，可以得到≤14个核苷酸的短寡核苷酸的Tm。最好在聚合酶链反应(PCR)(例如50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3(在20℃)，1.5mM MgCl2，可任意选择地用0.01％的明胶)和水生栖热菌(T.aquaticus)DNA聚合酶的一种修饰形式-AmpliTaq GoldTM(PEBiosystems)的标准条件下进行扩增的引发。
“分离的”病毒、病毒结构(例如壳体)、多核苷酸或多肽是至少已部分纯化而去掉了在其正常环境中发现的污染成分的病毒、病毒结构(例如壳体)、多核苷酸或多肽。例如，分离的病毒是一种至少已部分纯化而去掉血液、血清或组织蛋白的病毒。在分离的病毒多核苷酸的情况下，该多核苷酸至少是部分纯化而去掉病毒蛋白和/或其它病毒组分的，且另外可以从其正常环境中取出(例如，可以缺失掉正常位于该多核苷酸两侧的核苷酸序列)。
当用于本文时，当以这样一种方式共价连接所关注序列和调节序列、以致设置所关注序列的表达或转录在调节序列影响或控制之下时；则说所关注序列和调节序列是“可操作地连接的”。术语“可操作地连接的”涉及有功能联系的多核苷酸元件的定向。可操作地连接的意味着被连接的DNA序列通常是物理上邻近的；且在必需连接两个蛋白编码区时，所述DNA序列是邻近的，并在同一阅读框内。然而，由于增强子通常当与启动子隔开几千碱基时起作用，而内含子序列可以具有可变的长度；所以，某些多核苷酸元件可以是可操作地连接的，但并不是邻近的。如果希望将所关注的序列翻译成功能蛋白，那么，如果诱导5’端调节序列中的启动子导致所关注序列的转录，且如果在两种DNA序列之间键合的性质(1)不导致移码突变的引入、(2)不干扰启动子区域指导所关注序列转录的能力、或者(3)不干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白的能力；则说两种DNA序列是可操作地连接的。因此，如果启动子区域能够影响所关注序列的转录，以致于可以将所产生的转录物翻译成所需蛋白或多肽；则该启动子区域与所述DNA序列则是可操作地连接的。应该注意：术语“可操作地连接的”包括这样的可操作连接，在所述这样的可操作连接中，最终的蛋白编码区需要移码或剪接，来保持合适的、通过该蛋白整个编码区的阅读框架(例如在某些逆转病毒系统中所看到的)。
当用于本文时，术语“抗体”是指具有特异性地结合特定抗原能力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。对于免疫学学科领域的普通技术人员，抗体是众所周知的。当用于本文时，术语“抗体”不仅意指完整的抗体分子，而且意指保留了抗原结合能力的抗体分子片段。这样的片段也是本技术领域众所周知的，且在体外和体内都是经常使用的。具体地说，当用于本文时，术语“抗体”不仅意指任何同种型的完整免疫球蛋白分子(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)，而且意指众所周知的活性(即抗原结合)片段F(ab)2、Fab、Fv、scFv、Fd、VH和VL。关于抗体片段，参见：例如“Immunochemistry in Practice”(Johnstone和Thorpe编辑，1996，Blackwell Science)，第69页。所述术语的“抗体”另外包括单链抗体、CDR移植抗体、双抗体(diabodies)、嵌合抗体、人源化抗体以及Fab表达文库。该术语也包括包含本发明抗体与另一种多肽或多肽之一部分(“融合配偶体”)的融合多肽。融合配偶体的实例包括生物学反应的调节物、淋巴因子、细胞因子以及细胞表面抗原。“抗体活性”表示抗体通过位于免疫球蛋白可变区内的抗原结合位点而优先于其它潜在抗原地结合特定抗原的能力。术语“血清学上不同的”描述可借助于多肽、蛋白或病毒与其它种类多肽、蛋白或病毒的抗原差异而用特异性抗体经免疫学鉴定的与这类其它种类不同的多肽、蛋白或病毒。
当用于本文时，术语“包含(comprising)”及其同词源的词按其包括在内的意思使用，即，等同于术语“包括(including)”及其相应的同词源的词。分离的SVII病毒
最好由来源于受SVII感染的个体的血浆或血清，制备分离的SVII。可以用本领域已知的任何技术，从血浆或血清中分离出SVII病毒；所述任何技术包括但不限于沉淀、等密度梯度离心尤其是制备规模的等密度梯度离心、以及免疫分离。
可以用本领域已知的沉淀技术(例如超速离心)来分离SVII病毒颗粒。处理含有SVII病毒的材料而除去大量的碎片和任何细胞(例如通过过滤或中/高速离心)，然后将其超速离心，从而沉淀SVII病毒。最好是在沉淀该病毒之前，稀释含有SVII病毒的材料，例如用tris缓冲盐溶液或用含有EDTA的tris缓冲盐溶液来稀释。例如，通过以200,000×g离心18小时(例如，在一个SW41Ti转头中以200,000×g离心，用TEN缓冲液稀释包含SVII的血清)，可以沉淀SVII病毒。
根据等密度梯度离心的SVII的分析表明：当用蔗糖密度梯度测定时，SVII具有～1.26g/cm3的密度；而在CsCl梯度时，SVII具有～1.26-1.28g/cm3的密度。可以用本技术领域已知的、将形成一种合适梯度的任何形成梯度之化合物，最好是用一种将形成每立方厘米约1.2-1.35克(g/cm3)之梯度的形成梯度的化合物，来进行等密度梯度离心；蔗糖和氯化铯(CsCl)是优选的形成梯度的化合物。在一个合适的离心管中，于蔗糖梯度上，将含有SVII的血浆或血清铺成一层；或者，作为CsCl中的均相混合物，将含有SVII的血浆或血清引入到一个合适的离心管中；然后，将其离心至平衡。通过收集该梯度的合适密度之级分，可以回收分离的SVII病毒。
免疫分离技术利用与本技术领域已知的、任何合适的分离介质结合的SVII特异性抗体。优选的分离介质包括固体塑料基质(例如在用于淘选)、层析介质(例如免疫亲和层析)以及磁性颗粒(例如免疫磁性分离)。将SVII抗体缀合到分离介质上，使所述介质接触含有SVII病毒的材料中。除去未结合的材料，且从免疫分离基质上洗掉残留的未结合材料；然后，一般通过用一种pH变化的或具有高盐浓度的洗脱缓冲液，来洗脱结合的SVII。
另一方面，用体外培养方法，可制备分离的SVII病毒。各种各样这样的方法是本技术领域已知的，且通常包括用SVII感染一种合适宿主细胞，最好是一种肝细胞系；培养所述受感染的细胞，并从培养基中收集SVII病毒颗粒、或通过裂解所述细胞而收集SVII病毒颗粒。可使用密度梯度分离或免疫分离技术，以进一步分离该病毒。分离的SVII多核苷酸
用任一种本技术领域已知的方法，例如，通过由病毒粒子直接分离出病毒DNA，通过直接分离作为SVII生活周期一部分的、转录的病毒RNA，通过使用杂交方法(即鉴定由病毒DNA、或包含病毒的血浆或血清制备的DNA文库中的病毒DNA)，通过使用扩增方法(即病毒DNA、包含病毒DNA的文库、或由血浆或血清分离的DNA之聚合酶链反应)，或通过直接合成；可制备分离的SVII多核苷酸。可以用图1中所示的多核苷酸序列，来设计用于杂交方法和扩增方法的探针或引物，以及来选择用于合成的序列。所挑选的探针或引物最好是独特的(例如，不是在GenBank中或在其它序列数据库中找到的)。
通过分离出的病毒粒子的提取，可制备分离的基因组多核苷酸。可以使分离出的病毒粒子经受本技术领域已知的、DNA提取的任何操作，例如盐酸胍抽提；可任意选择地继之以进一步的纯化操作和/或浓缩操作，例如琼脂糖凝胶纯化，苯酚/氯仿抽提，或在有盐情况下的乙醇沉淀。
DNA文库的制备是本技术领域众所周知的。用本领域通常使用的技术，可以把从病毒粒子、或包含病毒的血浆或血清中分离出的DNA克隆到方便的文库载体之中。虽然通常也使用粘粒文库和质粒文库，但最常用基于λ噬菌体的文库载体来构建所述文库。通过感染大肠杆菌宿主细胞的“菌苔”，平板接种基于噬菌体的文库；而粘粒文库和质粒文库一般被转化到铺平板的细胞中。在铺平板之后，把来自所述文库的DNA转移到筛选滤膜上；并用SVII多核苷酸探针来筛选。虽然通过使用一种结合所标记探针且作用于产色底物或别样的可检测底物的修饰酶(例如碱性磷酸酶或荧光素酶)，可检测其它修饰的探针(例如地高辛配基或生物素标记的)；但最好修饰所述的探针，一般通过掺入一种放射性核苷酸(例如32P)来修饰所述的探针，以致于能检测杂交。通过一“轮”或更多“轮”的纯化(例如，用逐渐更加纯化的克隆，来重复铺平板和筛选步骤)，来纯化与SVII多核苷酸探针杂交的克隆；这一点在本技术领域是众所周知的。通过从筛选步骤里分离的克隆中收获DNA，可制备SVII DNA；且可任意选择地通过限制性内切酶消化，而进一步从所述文库载体DNA中分离出SVII DNA。另一方面，可以将通过筛选分离的克隆DNA用作底物，以使用聚合酶链反应(PCR)方法扩增SVII病毒DNA。可以根据SVII病毒DNA来设计PCR引物，或者更方便地，可设计杂交到该文库载体中位于插入文库DNA之位点两侧的DNA序列上的PCR引物；对于本领域技术熟练人员，这一点将是显而易见的。
由含有SVII DNA的样品通过扩增，也可以分离SVII病毒多核苷酸。可基于图1中所示的序列，设计用于扩增的引物；且优选设计用于扩增的引物，以便扩增SVII DNA，而不扩增来自其它病毒的病毒DNA或者来自动物或原核生物的基因组DNA。另外，正如本技术领域众所周知的，选择引物序列以使分子内任何二级结构成最小；所述二级结构大大抑制扩增，甚至可以阻止扩增。用于聚合酶链反应扩增的方案是本技术领域众所周知的，用于其它扩增方法例如连接酶链反应的方案也是众所周知的。扩增后，可以通过大小选择(例如凝胶电泳)或化学抽提(例如苯酚/氯仿抽提)来进一步纯化所述的SVII DNA和/或通过在有盐情况下的乙醇沉淀，来浓缩SVII DNA。
也可以化学合成SVII多核苷酸；尽管合成的SVII多核苷酸的长度最好小于约50-60个核苷酸，因为当链长增加时，多核苷酸合成的产率下降。用于合成多核苷酸的方法是本技术领域众所周知的，且通常涉及将核苷酸(或修饰的核苷酸)反复地添加到合成的多核苷酸的生长端。各种各样的不同系统在本技术领域中是可得到的，且把特定方法及化学的选择交给本领域的专业人员。
SVII多核苷酸有各种各样的用途，所述用途包括：检测SVII病毒(这在诊断SVII感染方面是有用的)，生产SVII多肽，构建基于SVII的表达/转导载体，以及作为反义寡核苷酸或用于构建反义SVII载体。
反义SVII多核苷酸是能够与由SVII基因组产生的mRNA分子片段选择性杂交的SVII多核苷酸。反义SVII多核苷酸可以是任何大小的SVII多核苷酸，但最好是长度小于约200个核苷酸的。在SVII感染的细胞中，反义SVII多核苷酸阻止SVII蛋白的表达和/或SVII病毒的复制。因此，可以用反义SVII多核苷酸来治疗SVII感染并/或减轻SVII感染的症状，包括减弱SVII病毒血症。
如果化学合成SVII反义多核苷酸，则最好将其合成为修饰的寡核苷酸，以增加对核酸酶的抗性。可以合成在5’末端和3’末端包含亚磷酰胺(phosphoroamidites)的修饰的寡核苷酸(Dagle等，1990，Nucl.AcidsRes.18：4751-4757)，以引入在第4,469,863号美国专利中公开的膦酸乙酯类似物或膦酸甲酯类似物，引入硫代磷酸酯(Stein等，1988，Nucl.Acids Res.16：3209-3221)或2’-O-甲基核糖核苷酸(Inove等，1987，Nucl.Acids Res.15：6131)，或作为复合RNA-DNA类似物的嵌合寡核苷酸(Inove等，1987，FEBS Lett.215：327)。
可以将反义SVII多核苷酸以“裸DNA”形式传递到SVII病毒感染的个体中，通常通过非肠道注射，优选通过静脉内注射或引入到门静脉中，从而利用天然发生的寡核苷酸的吸收。另一方面，可以借助于载体，例如一种病毒载体，将反义SVII多核苷酸引入到靶细胞中。该载体包括一个与一段多核苷酸序列可操作地连接、在用SVII病毒感染的宿主细胞且最好在人宿主细胞中可操作的启动子，所述多核苷酸的转录导致SVII反义多核苷酸的产生。优选的病毒载体包括但不限于本技术领域已知的腺伴随病毒载体。优选静脉内给予由病毒载体传递的SVII反义多核苷酸，且最好给予到门静脉。分离的SVII多肽
SVII蛋白可包括来自SVII病毒的完整ORF、一种或更多种来自SVII病毒的融合蛋白、来自SVII病毒的单一蛋白、或其片段。也包括在同一蛋白内包含两个或更多个SVII蛋白片段的“嵌合蛋白”。嵌合蛋白中的SVII蛋白片段可以来自同一SVII蛋白、或来自不同的SVII蛋白。在所述SVII蛋白片段来自同一SVII蛋白时，使正常分开所述片段的氨基酸序列大大缺失，或用一种不相关的“间隔区”序列取代。本发明包括的另一种嵌合蛋白是一种包含来自至少两种不同SVII病毒的至少一类表位之同源形式的“超表位”嵌合蛋白。例如，在筛选分析中，可以使用超表位嵌合蛋白，从而在种属上检测SVII病毒感染。
可以用本技术领域已知的任一方法来制备SVII多肽；所述方法包括：由分离的病毒粒子纯化、重组生产以及化学合成。因为由天然来源分离出大量病毒粒子相对困难，因而重组生产和/或化学合成是用于生产的优选方法。
蛋白的重组生产是本技术领域众所周知的。通常，将编码本发明蛋白的多核苷酸序列克隆到一种“表达载体”中，然后将所述表达载体导入合适的宿主细胞中。在适合于表达该蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞；并收集重组蛋白。虽然表达构成物通常将包含在宿主细胞中可操作的启动子/操纵基因或启动子/增强子、以及一种选择性标记，从而使包含该标记的细胞的选择能进行；但所述表达构成物的确切详情将根据所需宿主和表达构成物的性质而变化；对于本领域技术熟练人员，这一点将是显而易见的。优选启动子/操纵基因或启动子/增强子是“可控制的”，因为培养条件的变化将导致所述SVII蛋白(或SVII蛋白的融合蛋白)的表达。
应该注意：为了重组生产，可以使SVII肽结合成“融合蛋白”。融合蛋白包含一种连接于一种融合配偶体的关注蛋白(例如SVII蛋白)，且可任意选择地在该关注蛋白和融合配偶体之间包括一个特异性切割位点，从而使这两部分能分开。该融合配偶体可以在该蛋白的氨基末端或羧基末端，尽管也考虑了作为编码区序列内的“插入片段”而引入该关注蛋白的融合蛋白。作为筛选工具，包含一种SVII蛋白插入片段的融合蛋白可能是特别有用的，例如，当引入到“噬菌体展示”系统时(例如在将该SVII蛋白序列插入到λ噬菌体外壳蛋白的情况下)。
有用的融合配偶体包括：便于融合蛋白的简易纯化的蛋白(例如谷胱甘肽-S-转移酶、寡聚组氨酸和某些来源于myc癌基因的序列)、增加融合蛋白的溶解度的蛋白(例如大肠杆菌的DsbA，公开于5,629,172号美国专利)、或形成一种使该蛋白结合到一种基质上的“接头”的蛋白(例如，可以用具有一个末端赖氨酸的聚甘氨酸，将一种SVII蛋白连接到基质上，供免疫分析之用)。
通常，通过使用合适的限制性内切酶，将编码本发明一种蛋白的多核苷酸插入到一种合适的重组DNA表达载体中，而构建表达构成物。限制性内切酶的位点可以是天然存在的或是用本技术领域已知的任一方法引入的合成的位点；所述方法例如定点诱变、PCR或将接头/连接物连接到所述多核苷酸上。另一方面，该多核苷酸可以是一段被设计成含有方便的限制性酶位点和/或针对所预期的宿主细胞优化密码子选择的合成序列。所使用的亲代表达载体的限制性酶的切割模式将决定所用的特定内切酶。进行限制性内切酶位点的选择，以便使编码序列和控制序列正确地定向，从而完成所述蛋白正确的符合读框地阅读及表达。
可以将所述多核苷酸插入到任一合适的表达载体中。可以得到若干形式的表达载体，包括但不限于：质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)以及病毒载体。通常，表达载体会包含一个至少在繁殖该载体的生物中有活性且常常也在重组宿主细胞中有活性的自主复制位点。该表达载体一般也会包含在转化细胞中能够提供表型选择的标记序列，例如，诸如抗生素抗性基因(例如bla、tetR、neoR或hygR)或补充辅源营养的基因(例如trp或DHFR)之类的正选择标记和/或诸如单纯疱疹病毒1型的胸苷激酶之类的负选择标记。该表达载体同样会包括起始与终止转录和翻译的必需序列(例如，启动子、Shine-Dalgarno序列、核糖体结合位点、转录终止位点)，并可任意选择地包含调节转录的序列(例如，SV40增强子或lac阻抑物)，且在必需时，同样可包含指导加工的序列，例如一种内含子或聚腺苷酸化位点。
以正确的定向且按照与表达载体的转录及翻译控制序列的正确关系，将本发明的多核苷酸插入到表达载体中，从而提供从启动子起的转录和从核糖体结合位点起的翻译；在所述蛋白将被表达的宿主细胞中，它们两者应该是起作用的。所述转录控制序列最好是诱导型的(即通过改变培养条件，可调节它们；所述转录控制序列例如大肠杆菌的lac操纵子或用于哺乳动物细胞的金属硫蛋白启动子)。这样的一种表达载体的实例是在Belagaje等的5,304,493号美国专利中描述的一种质粒。用限制酶NdeI和BamHI，可以从质粒pRB182中除去在参考文献中描述的编码A-C-B胰岛素原的基因。可以将编码本发明蛋白的基因在NdeI/BamHI限制性片段盒中插入到该质粒的骨架里。
对于本发明蛋白的重组表达，一般优选微生物宿主；且可以使用通常所用的任何微生物宿主，包括例如W3110(原养型，ATCC 27325号)的大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、以及诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)之类的肠杆菌科之其它种和各种假单胞杆菌属之种。另一方面，可以使用真核宿主细胞；所述真核宿主细胞不仅包括酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，而且包括较高等真核生物，例如非酵母真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞(例如Sf9)和哺乳动物细胞(例如COS、CHO)。
用本技术领域已知的任何合适的方法，将完成了的表达构成物引入到重组宿主细胞中；所述方法例如CaCl2转染、Ca2PO4转染、病毒转导、脂质介导的转染、电穿孔、基因枪转染等等。在引入表达构成物后，通常在可根据表达构成物的存在进行选择的合适条件下(例如，对具有包含bla的表达构成物的细菌宿主，在存在氨苄青霉素的情况下进行培养)，培养重组的宿主细胞；或者，可以根据所述蛋白的表达而用任何合适的方法(例如，荧光激活细胞分类术，FACS；使用SVII蛋白特异性的抗体)来选择重组的宿主细胞。
在选择以及合适的分离步骤(例如重划线分离或有限稀释克隆)之后，使用本领域已知的任何合适的技术，以生产规模培养重组的宿主细胞(所述生产规模对于微生物宿主细胞可以从500ml的摇瓶到几百升级的发酵罐，或者，对于哺乳动物宿主细胞可以从T25烧瓶直到几百升级的生物反应器；这取决于所述专业人员的要求)。如果在表达载体中的启动子/增强子是诱导型的，则在培养物达到适当的细胞密度后，根据特定的构成物适当地诱导所述蛋白的表达(例如，通过添加一种诱导物，或通过使一种阻抑物从该培养基中除去)；否则，使所述细胞生长，直到它们达到供收获的适当密度为止。本发明重组蛋白的收获将取决于重组的宿主细胞、表达构成物以及编码本发明蛋白的多核苷酸的确切性质；对于本领域技术熟练人员，这一点将是显而易见的。至于产生分泌型蛋白的表达构成物，一般通过从培养容器中取出培养基而回收该蛋白；而引起细胞内蛋白累积的表达构成物，则通常需要回收及裂解所述的细胞，从而释放出所述已表达蛋白。
用高水平细菌表达系统表达的蛋白以包含高水平的超量表达的该蛋白的微粒或包含体形式特征性地聚集。溶解该蛋白聚集物，从而达到所需蛋白产物的进一步纯化与分离；例如，使用例如盐酸胍的强变性溶液，或许配合还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)。在“重折叠”反应后，回收活性形式的所述溶解的蛋白；在所述“重折叠”反应中，通常涉及降低变性剂浓度和添加氧化剂。普遍认为适用于蛋白重折叠的方案是本技术领域众所周知的，且被公开于例如4,511,502号、4,511,503号和4,512,922号的美国专利中。
运用合成化学即一种本技术领域众所周知的方法，也可以方便地生产短的(例如少于约20个氨基酸残基)SVII蛋白。因为在肽长度长时收率下降，所以对于生产大约15个氨基酸残基的或更短的肽，合成是一种优选的方法。
在用于预防SVII感染和/或治疗SVII感染的疫苗中，可以使用SVII多肽。在SVII疫苗中，可以使用任一SVII多肽或SVII多肽的组合。包含来自一种SVII蛋白的多个表位、其中正常分开所述表位的氨基酸被缺失掉的SVII嵌合多肽，是一种供疫苗制剂之用的优选SVII蛋白。供疫苗之用的另一种优选的SVII蛋白是一种超表位蛋白，该超表位蛋白包含来自许多SVII病毒、已融合成一种单一蛋白的多个同源表位。
按照本技术领域已知的方法配制SVII疫苗。该疫苗最好是一种用于非肠道给予的液体制剂。可以配制包含本技术领域已知的药用赋形剂的疫苗，所述药用赋形剂例如生理学上及药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂、填充剂、渗压剂等等，在the USP(UNITED STATES PHARMACOPEIA，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，MD，1995)中可查明它们。
也可以用佐剂来配制基于SVII蛋白的疫苗。供基于SVII蛋白的疫苗之用的佐剂，包括化学佐剂、细胞因子佐剂以及诸如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂之类的水包油型乳状液；所述化学佐剂例如氢氧化铝(尤其是氢氧化铝凝胶)、明矾、鱼精蛋白、磷酸铝和磷酸钙，所述细胞因子佐剂包括白细胞介素1.β、肿瘤坏死因子α以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如在5,980,911号美国专利中描述的。
优选非肠道地传递SVII疫苗，更优选通过经皮给予而将其传递。优选的给予途径不仅包括肌内注射和皮下注射，而且包括经皮气动给予(例如无针注射)。可以以单独一剂的方式给予该疫苗，或可按照多次给予，来给予该疫苗。在多次给予时，优选相差至少一天、一周或一个月地隔开多次给予。SVII抗体
运用由本发明提供的分离的病毒粒子和/或SVII病毒蛋白，可制备针对SVII的抗体。不仅可以制备分离的多克隆抗体，而且可制备单克隆抗体。
最好通过注射一种免疫原性的“SVII免疫原”(例如分离的SVII病毒粒子、SVII蛋白、连接于载体的SVII寡肽或SVII融合蛋白)到动物中，来制备分离的、针对SVII蛋白的多克隆抗体；所述动物最好是一种哺乳动物，例如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠或兔)、山羊、牛或马。最常用一种油/水乳状液完全佐剂例如弗氏完全佐剂，进行SVII免疫原的第一次注射；该完全佐剂包含一种非特异性的免疫系统激活剂，从而改善对所注射免疫原的免疫应答。一般用不完全佐剂(例如在一种水/油乳状液中的非特异性免疫刺激物)进行后面的注射。另一方面，可引入吸附到一种固体基质上的SVII免疫原，或可引入作为一种纯溶液的SVII免疫原。收获血清；并运用任何方便的测定，最典型的是用一个简单的免疫试验，例如一种使用作为靶的SVII免疫原以及使用种特异性的抗免疫球蛋白二次抗体的ELISA(酶联免疫吸附测定)，来测定血清中特异性抗体的存在。
用若干不同的技术，可制备本发明的单克隆抗体。至于杂交瘤技术，读者通常可参阅Harrow与Lane(1988)的4,491,632号、4,472,500号和4,444,887号美国专利以及Methods in Enzymology 73B：3(1981)。传统的单克隆抗体技术涉及从一种在前面段落中描述的、已被免疫的动物(一般为小鼠)体内回收的产生抗体之细胞的无限增殖化与克隆。可以使所述细胞无限增殖，例如，通过与一种非生产性骨髓瘤融合，用EB病毒感染，或者用癌基因DNA转化。克隆并培养经处理的细胞，且挑选产生所需特异性的抗体的克隆。用一些技术，例如在一种免疫测定中运用所述免疫抗原作为检测试剂，用培养基上清液进行特异性测定。然后，从大体积的培养物上清液中，或从用所述克隆注射的、适当地处理过的宿主动物的腹水中，可纯化出来自所选克隆的一批单克隆抗体。
用于获得单克隆抗体的另一个可供选择的方法涉及使一种免疫活性细胞或病毒粒子与本发明的一种蛋白接触。在这方面，“免疫活性”意指没有进一步的基因重排，所述细胞或粒子就已表达或能够表达对该抗原特异性的抗体；且可以通过该抗原的呈递，将其从细胞混合物中选择出来。由免疫过的哺乳动物供体，可收获免疫活性真核细胞；或者，可从未经免疫的供体中收获真核细胞，并通过在有免疫原和免疫刺激生长因子情况下，于体外培养进行预刺激。在导致特异性克隆增殖而非特异性克隆不增殖的培养条件下，通过与免疫原接触，可选择出所需特异性的细胞。可以构建免疫活性噬菌体，从而在其表面表达免疫球蛋白可变区片段。参见：Marks等，New Engl.J.Med.335：730，1996；94/13804号、92/01047号、90/02809号国际专利申请；以及McGuinness等，Nature Biotechnol.14：1149，1996。例如，通过吸附到与一种固相相连的SVII免疫原上，而可选择出所需特异性的噬菌体；然后，在大肠杆菌中将其扩增。
可以用传统的生物化学分离技术的组合，从血清、细胞上清液、裂解液或腹水中纯化抗体；所述生物化学分离技术例如硫酸铵沉淀、在一种弱阴离子交换树脂例如DEAE上的离子交换层析、羟基磷灰石层析以及凝胶过滤层析。也可以单独地、或连同传统生物化学分离技术一起使用特异性亲和技术，例如使用SVII免疫原作为亲和部分的亲和层析，来分离本发明的抗体。
最好是不仅根据所获得抗体与SVII病毒蛋白反应的能力，而且根据与同样存在于有诊断意义样品中的潜在交叉反应物的低交叉反应性，筛选或纯化所获得抗体。必要时，可以使用所述交叉反应物或一种来自一个对SVII感染呈阴性的个体之血清的抗原制剂，从多克隆抗血清中吸附出不需要的活性。
通过制备片段和测定抗体结合的能力，可对特定抗体所结合的表位作图。例如，制备连续的、覆盖该免疫原完整序列且重叠8个残基的12个氨基酸的肽。可以按照制造商的说明书，用来自Genosys的SPOTSTM试剂盒，用F-Moc化学法在尼龙膜支持物上制备所述肽。然后，用所述抗体覆盖所制备的膜，洗涤所述膜，并用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG覆盖这些膜。通过添加所用的特定酶缀合物的合适底物，来显现该试验结果。阳性染色表明由所述抗体识别的抗原片段。然后，可以用该片段来获得识别所关注的表位的其它抗体。在一种标准的免疫测定中，识别同一表位的两种抗体将竞争结合。
本发明的抗体可以用来检测和/或鉴定SVII病毒，也可以用于分离病毒粒子和/或病毒蛋白。SVII的检测
在检测SVII病毒感染和检测SVII病毒本身的方法与试剂盒中，可以使用本发明的多核苷酸、蛋白及抗体。根据所需的测定效用，可以设计各种各样形式的应用本发明多核苷酸、蛋白和/或抗体的测定。
可以本发明的多核苷酸检测SVII病毒基因组DNA。在血液样品中检测出SVII基因组DNA则表明：该样品被SVII病毒污染，且该样品之源被SVII感染。用于检测核苷酸的各种各样的不同测定是已知的，尽管所有这样的测定通常都需要一个使引物或探针与样品中的DNA杂交的杂交步骤。
用分离的SVII基因组序列的已测定部分作为基础，可以或者通过切取或者通过合成，制备大约八个或更多个核苷酸的、与所述SVII基因组杂交的寡聚体。用于SVII多核苷酸的天然探针或衍生探针为允许通过杂交而检测特有病毒序列的长度。通常，探针的长度最小为6个至8个核苷酸，优选至少10至12个核苷酸的序列，且可以最优选至少约20个核苷酸的那些序列。根据所需测定的效用(例如，所有SVH病毒的检测对单一SVII病毒类型的检测)，所述探针可以基于SVII基因组序列中在SVII病毒之中保守或在SVII病毒中间高度趋异的一个区域。可运用包括自动化寡核苷酸合成法的常规、标准方法，来制备这些探针。SVII基因组的任何特有部分的互补物通常会是令人满意的。通常在探针方面，完全互补是所需的；尽管当增加该片段的长度时，完全互补可能是不必要的。
通常，处理待分析的试验样品例如血液或血清，以便提取包含于其中的核酸。一般将核酸样品吸附到一种用于分析的固体支持物上(例如硝化纤维)(有或没有初步的大小分离，例如通过凝胶电泳)；尽管也可以使用溶液相样式的分析，例如在4,868,105号美国专利中描述的分析。
根据所述分析的形式和检测系统，可以对所述探针进行或不进行直接标记或另外的修饰，从而允许随后根据标记的结合进行检测。合适的标记以及使标记相连到探针上的方法是本技术领域已知的，且包括但不限于：通过切口平移或激酶处理(kinasing)引入的放射性标记、允许标记随后结合例如生物素化的修饰、以及可以直接结合到探针上或经过修饰探针而结合的荧光标记与化学发光标记。
在基本的核酸杂交测定中，在适当严格性的杂交条件与洗涤条件下，使样品的单链核酸和所述探针接触，并检测所产生的双链体。严格性的控制是本技术领域众所周知的，且取决于例如盐浓度、探针长度、甲酰胺浓度、温度等等的变量。最好是在严格条件下进行杂交及洗涤。按照用于所述测定的标记/检测系统的要求，进行结合探针的检测。例如，在该探针经放射性标记的情况下，通过放射自显影而检测探针的结合。在修饰该探针以允许探针随后结合(例如，通过共价连接生物素或地高辛配基到该探针上，或者通过添加聚腺苷酸尾到该探针上)的情况下，使一种标记连接于一种修饰结合部分(例如，使链霉亲和素连接于一种可检测的酶例如碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白或荧光素酶、或者使一种荧光标记或其它标记结合到抗地高辛配基抗体上)。通常用荧光计来完成荧光探针的检测，而可以用一台发光计或一张照相底片来检测发光标记。可以使用分支DNA技术及增强来自所述分析之信号的其它方法(Urdea等，1989，Clin.Chem.35(8)：1571-1575；第5,849,481号美国专利)。
其它分析使用探针作为扩增样品中SVII基因组DNA的引物。可使用例如聚合酶链反应、连接酶链反应、Q-β复制酶、NASBA(Compton，1991，Nature 350(6313)：91-92)等的方法，来产生存在于一种样品中的部分或完整SVII基因组DNA的大量拷贝。在这样的测定中的检测，通常是检测预期大小的扩增产物，一般则通过凝胶电泳和目测所存在的任何条带检测。
也可以用本发明的抗体检测样品中病毒蛋白的存在，来检测SVII病毒。可以结合本发明抗体使用本技术领域已知的各种各样免疫测定形式中的任一种，来检测SVII病毒或病毒蛋白。
在其大多数的基本类型方面，用于检测样品中的SVII病毒或SVII病毒蛋白的免疫测定检测出SVII蛋白与本发明抗体的复合体。虽然优选的免疫测定形式需要至少两种本发明的抗体，但至少需要一种本发明的抗体。
许多测定形式要求将样品或来自该样品的SVII蛋白固定在一种固体支持物上。可以用本技术领域已知的各种各样的方法来完成连接；最常用的是使其吸附到蛋白结合表面(例如聚苯乙烯板或硝化纤维或PVA膜)或结合到与基底相结合的抗体上。在“夹心”免疫测定中使用这第二种安排；且对于SVII病毒蛋白的检测，则优选这第二种安排。
在固定该样品(或该样品中的SVII蛋白)到所述基底上后，使一种检测抗体与该样品接触，并检测该检测抗体的存在。由于用染料或有色颗粒修饰了该检测抗体，因而该检测抗体本身可以是可检测的；可这样的修饰该检测抗体，以致一种检测试剂将结合到该检测抗体上，或者可以用一种作用于显色底物的酶来修饰该检测抗体。
当然，检测该检测抗体的确切详情，将取决于所使用的检测系统。通过例如简单检查、光学显微镜术或比色法(对于用有色颗粒例如乳胶微珠或胶态金属修饰的抗体)、放射分析(对于用一种放射性化合物修饰的抗体)或荧光测定或表面荧光显微镜术(对于用荧光染料标记的抗体)，可以检测可直接检测的检测抗体。一般通过在包含经一种酶加工后即成为可检测的底物的溶液中保温所述的试验样品，且用一种合适的方法(例如用于显色底物的比色法，用于荧光底物的荧光测定法等等)来检测任何已加工的底物，从而检测出已经过修饰而包含所述酶的检测抗体。可以修饰其它的检测抗体而为“间接”检测创造条件，其中结合到经修饰的检测抗体上的第二种试剂允许检测结合的检测抗体。修饰所述的第二种试剂，使其成为可检测的(或当用染料或当用有色颗粒时可直接检测，或当用一种酶与可检测底物时间接检测)。
实施例实施例1：SVII病毒DNA的分离
运用一种由Lititsyn等描述的表现度差异分析(RAD)法(1993，Science 259：946-951)的改良法，分离包含SVII基因组DNA的DNA克隆。这种方法利用一种“驱动者”DNA源来富集扩增“试验者”DNA源特有序列的扩增物。
将来自称为H101的一位原因不明性肝炎患者的血清用作“试验者”DNA之源。通过蛋白酶K消化，继之以苯酚与氯仿抽提而提取DNA。在37℃，用10个单位的Sau3A I消化分离自100μl H101血清的DNA达3小时，而至完成。通过在65℃保温20分钟而使该酶失活。
通过在T4 DNA连接酶缓冲液(具有ATP，来自New EnlandBiolabs)中将各1nmol的寡核苷酸接头R-Bgl-24(5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’)和R-Bgl-12(5’-GATCTGCGGTGA-3’)与经消化的DNA混合，通过在55℃保温2分钟来变性该混合物，通过在大约1小时期间将该混合物逐渐冷却至10-15℃而使所述接头退火，然后，添加800单位的T4 DNA连接酶(NewEnland Biolabs)并在12-16℃保温过夜；而把所述接头连接于消化的DNA上。
通过嵌套式聚合酶链反应而制备试验者扩增子；因为一轮PCR不产生可测定量的DNA。将所述连接产物的一部分与PCR缓冲液、dNTPs以及另外的250pmol R-Bgl-24寡核苷酸相混合，并用矿物油将其覆盖。通过在72℃保温该混合物3分钟而‘释放’所述的R-Bgl-12寡核苷酸。通过添加7.5单位的AMPLITAQTaq DNA聚合酶(PEBiosystems)以及于72℃再保温5分钟，而补平突出端。通过使该混合物经过20个于95℃1分钟和在72℃3分钟的循环，继之以最后的于72℃10分钟的延伸步骤，构建试验者扩增子。在第二轮聚合酶链反应中，于与第一轮相同的条件下，使用第一轮PCR的产物10μl及接头R-Bgl-25(5’-ACTCTCCAGCCTCTCACCGCAGATC-3’)，进行15个循环。然后，用苯酚/氯仿抽提该产物，并用乙酸钠和异丙醇将其沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干，并用TE(tris-EDTA)缓冲液重新悬浮。通过基本上如上所述进行Sau3A I消化而除去R-Bgl-24接头，继之以在65℃使该酶失活。在存在糖原的情况下，用乙酸钠和乙醇将所述消化产物沉淀；通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干，并用TE重悬浮。然后，在1×TAE中，于1％的琼脂糖凝胶电泳上，将所述产物分离；并切取对应于150-1500个核苷酸的凝胶部分。按照制造商的说明书，用QIAGENQiaex II凝胶提取(QIAGENQiaex II Gel Extraction)试剂盒从该凝胶中纯化出消化的试验者扩增子。基本上按照对于R-Bgl接头而描述的，将2μg的试验者扩增子DNA与J-Bgl-24接头和J-Bgl-12接头(分别为5’-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3’和5’-GATCTGTTCATG-3’)连接。
除了在第二次Sau3A I消化后不添加新的接头外，基本上按照对于试验者扩增子而描述的，由从得自10位健康献血者的混合血清提取的DNA制备驱动者扩增子。
以100∶1的质量比，混合驱动者扩增子和试验者扩增子；用苯酚/氯仿抽提，并用乙酸钠和乙醇将其沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干，并用4μl EE×3缓冲液(30mM EPPS，pH 8.0，3mM EDTA)重新悬浮。用矿物油覆盖混合物，通过在98℃变性5分钟，添加1μl的5M NaCl，于98℃保温另外的2分钟，然后在65℃保温20小时进行杂交。
在选择性地仅扩增双链试验者DNA的条件下，扩增试验者/驱动者的杂交混合物。除了在70℃进行延伸循环外，基本上如同为扩增J-Bgl连接的试验者DNA所做的，扩增该杂交混合物的一部分达10个循环。收集所述扩增的产物，用苯酚/氯仿/异戊醇抽提，然后，用乙酸钠和异丙醇将其沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干，并用TE重新悬浮。通过在30℃用绿豆核酸酶(New EnglandBioLabs)消化30分钟，除去单链的DNA；继之以在98℃热灭活该酶达5分钟。在存在追加的J-Bgl-24寡核苷酸的情况下，重新扩增所述消化产物达15个循环。
收集所述扩增的产物，用苯酚/氯仿/异戊醇抽提，用乙酸钠和异丙醇将其沉淀；通过离心收集该沉淀，用70％的乙醇洗涤，在除去上清液后，将其风干，并用TE重新悬浮，从而形成第一种差异产物(theFirst Difference Product)(DP1)。
基本上如上所述，把R-Bgl接头换成J-Bgl接头，通过用Sau3A I消化DP1，并用N-Bgl接头(N-Bgl-12和N-Bgl-24，分别为5’-GATCTTCCCTCG-3’和5’-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3’)取代J-Bgl接头；以1∶800的质量比，使N-接头DP1与驱动者扩增子杂交；且除了在72℃进行扩增期间的延伸外，按照对DP1所描述的，进行扩增/消化/扩增；从而产生第二种差异产物(the Second DifferenceProduct)(DP2)。
通过用Sau3A I消化DP2，并用J-Bgl接头取代N-Bgl接头；再继之以4×105∶1的驱动者∶试验者的质量比，与驱动者扩增子杂交；且按照对DP1所描述的，进行扩增/消化/扩增；从而产生第三种差异产物(the Third Difference Product)(DP3)
在三轮扣除杂交和选择性扩增之后，在凝胶电泳后，当与最初的试验者扩增子的‘不清晰的成片’带型比较时，看到了清楚的带。按照制造商的说明书，用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGENGelExtraction Kit)(目录号：28704)从各条带中分离出DNA；然后，将该DNA连接于TA质粒2.1(In Vitrogen Cat.K2000-01)中。然后将所产生的质粒文库转化到大肠杆菌中，并将大肠杆菌铺平板。选择来自每个文库的30个菌落，并按照制造商的说明书，用一种PE Biosciences PCR测序试剂盒，将其测序。在DNA和蛋白水平上，针对GenBank数据库，比较序列。将显示出与所述数据库没有显著同源性的克隆分为“未知类”。使用根据每种“未知”序列设计的引物，通过PCR，测试每种“未知物”是否在人类基因组DNA中存在。对任何存在于人类基因组DNA中的序列，则终止分析。选择一种最初称为“克隆33”或“H101.c33”的、371个核苷酸的未知物，供进一步的特性鉴定。在图1中显示了H101.c33的核苷酸序列。
通过概念上的、按所有六种可能之阅读框架的翻译，来分析克隆33的核苷酸序列。鉴定出了一个大的可读框(ORF)：ORF 1。在图1中也显示了ORF 1的氨基酸序列。
通过PCR，证实了克隆33的非人类起源。在用克隆33特异性的PCR引物扩增人类基因组DNA后，没有检测到扩增的产物。因证实了克隆33的非人类起源，故将其重新命名为岗哨病毒II或SVII。
运用对SVII特异性的PCR引物，在对应于峰值ALT水平的两个时间点，证实了SVII在患者H101之血清中的存在。实施例2：SVII病毒粒子的物理特性鉴定
通过密度梯度超速离心，将SVII阳性血清分级分离，以测定SVII病毒粒子的浮力密度。
在连续的蔗糖密度梯度(20-65％的蔗糖，w/w)的表面上，铺上掺入HBV作为标记的500μl SVII阳性血清样品。在6℃，用BeckmanSW41Ti转头以39,000rpm离心该样品15小时。借助于连接于聚硅氧烷管的玻璃毛细管，通过从离心管底抽吸，而收集级分(500μl)。
运用嵌套式PCR，分析各级分中的SVII。第一轮使用引物对33.1/33.2(分别为5’-GGATTGACGACGACGACGAC-3’、5’-TGTCAAATACCCGCTCAGGA-3’)，且第二轮使用引物对33.3/33.4(分别为5’-GACGACGACGACGACATTG-3’和5’-CAAATACCCGCTCAGGAAGG-3’)。同样，运用两轮的PCR，来分析各级分中的HBV；第一轮用引物HBV1和HBV4(分别为5’-CATCTTCTTRTTGGTCTTCTGG-3’和5’-CAAGGCAGGATAGCCACATTGTG-3’)以及引物HBV3(5’-CCTATGGGAGTGGGCCTCAG-3’)和HBV4。在对应于1.26g/cm3的级分中，发现了SVII病毒。
也测定了SVII在CsCl梯度中的浮力密度。在一支合适的离心管中，将掺入HBV作为标记的500μl SVII阳性血清样品与同质的CsCl溶液(密度4.2g/cm3且折射率为1.3645)相混合。在6℃，用BeckmanSW41Ti转头，以35,000rpm离心该样品达70小时。通过穿刺靠近该管底部的侧壁且收集500μl的各级分，来收集级分；并如同对该蔗糖梯度实验所描述的，分析所述的级分。在对应于1.26-1.28g/cm3的级分中，发现了SVII。实施例3：SVII感染的流行
对于SVII的存在，通过PCR分析了不止700份的血清样品。将所述样品分成：(a)“超正常”献血者(正常血液值，无肝炎标志，且≥5次献血，不牵连有关输血的事件)；(b)“正常”献血者(符合献血标准)；(c)“不合格的”献血者(在现行标准中不适合于献血的健康个体)；以及(d)“肝炎”患者，分为急性肝炎、HBV慢性肝炎、HCV慢性肝炎、原因不明性肝炎(非A-E)、及超感染肝炎(HBV加HCV或HBV加HDV)的“肝炎”患者。
使用引物对33.1/33.2和引物对33.3/33.4，通过嵌套式PCR扩增提取自血清样品的DNA，来分析样品。在来自符合献血筛选标准之个体的血清样品中，没有检测出SVII基因组DNA；且在不符合献血筛选标准的健康个体中，发现SVII基因组DNA仅以非常低的水平流行。然而，在来自急性肝炎患者的血清中，发现SVII以高度流行；且在来自慢性肝炎患者的血清中，尤其在来自慢性HCV患者和被多过一种类型的肝炎病毒超感染之患者的血清中，也发现了SVII。在表1中概括了结果。
表1组别 样品数 阳性超正常 100 0％正常 96 0％不合格 172 2％肝炎 374 18％
急性肝炎 24 63％
慢性HBV肝炎 79 1％
慢性HCV肝炎 98 29％
原因不明性肝炎 94 23％
慢性HBV/HCV/HDV肝炎 79 4％
序列表<110>Liu，en-Kuei
Lewis，Samantha
Batz，Hans-Georg
Ramaswamy，Latha
Bohenzky，Roy
Lin，Yu-Huei
Montiel，Janine
Chen，Benjamin<120>岗哨病毒II<130>RDID 0070<150>US 60/202271<151>2000-05-05<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>371<212>DNA<213>岗哨病毒II<400>1gatcmggaaa cgyttsgctc ggtgcatgca gaaggacggg wtgaaggcgg acgggattga 60cgacgacgac gacattgcga tgaaagatgg gaccgcygac gtccttggcg gggcggagcg 120cgagaaccaa gacgacgagg acgaggacgt ctacgcgcgc atccgtttcc ttcctgagcg 180ggtatttgac acctccgcat tgctgatcct gaagttctcg cttgcagacg ctgattcagc 240gccgcttcgt cgcacctgct ttggacgctg caaaccgcac ggctcggacc atcgtcagtt 300tcctgcttca gaggtgaatt tccgaccccg ttggactttg ctctctcttc tctctctacc 360cgacgacgat c 371<210>2<211>372<212>DNA<213>岗哨病毒II<220><221>misc_feature<222>(372)..(372)<223>未知：可以是a、t、g、c，或者在该位置可能不存在核苷酸。<400>2gatcgtcgtc gggtagagag agaagagaga gcaaagtcca acggggtcgg aaattcacct 60ctgaagcagg aaactgacga tggtccgagc cgtgcggttt gcagcgtcca aagcaggtgc 120gacgaagcgg cgctgaatca gcgtctgcaa gcgagaactt caggatcagc aatgcggagg 180tgtcaaatac ccgctcagga aggaaacgga tgcgcgcgta gacgtcctcg tcctcgtcgt 240cttggttctc gcgctccgcc ccgccaagga cgtcrgcggt cccatctttc atcgcaatgt 300cgtcgtcgtc gtcaatcccg tccgccttca scccgtcctt ctgcatgcac cgagcwaarc 360gtttcckgat cn 372<210>3<211>123<212>PRT<213>岗哨病毒II<220><221>Miscellaneous<222>(14)..(14)<223>该残基可以是Met或Leu。<220><221>Miscellaneous<222>(5)..(5)<223>该残基可以是Phe或Leu。<400>3Ile Arg Lys Arg Xaa Ala Arg Cys Met Gln Lys Asp Gly Xaa Lys Ala1 5 10 15Asp Gly Ile Asp Asp Asp Asp Asp Ile Ala Met Lys Asp Gly Thr Ala
20 25 30Asp Val Leu Gly Gly Ala Glu Arg Glu Asn Gln Asp Asp Glu Asp Glu
35 40 45Asp Val Tyr Ala Arg Ile Arg Phe Leu Pro Glu Arg Val Phe Asp Thr
50 55 60Ser Ala Leu Leu Ile Leu Lys Phe Ser Leu Ala Asp Ala Asp Ser Ala65 70 75 80Pro Leu Arg Arg Thr Cys Phe Gly Arg Cys Lys Pro His Gly Ser Asp
85 90 95His Arg Gln Phe Pro Ala Ser Glu Val Asn Phe Arg Pro Arg Trp Thr
100 105 110Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Asp Asp Asp
115 120<210>4<211>124<212>PRT<213>岗哨病毒II<220><221>Miscellaneous<222>(111)..(111)<223>该残基可以是Ala或Pro。<220><221>Miscellaneous<222>(119)..(119)<223>该残基可以是Gln或His。<220><221>Miscellaneous<222>(120)..(120)<223>该残基可以是Ser或Asn。<220><221>Miscellaneous<222>(123)..(123)<223>该残基可以是Gly或一个终止密码子。<400>4Asp Arg Arg Arg Val Glu Arg Glu Glu Arg Ala Lys Ser Asn Gly Val1 5 10 15Gly Asn Ser Pro Leu Lys Gln Glu Thr Asp Asp Gly Pro Ser Arg Ala
20 25 30Val Cys Ser Val Gln Ser Arg Cys Asp Glu Ala Ala Leu Asn Gln Arg
35 40 45Leu Gln Ala Arg Thr Ser Gly Ser Ala Met Arg Arg Cys Gln Ile Pro
50 55 60Ala Gln Glu Gly Asn Gly Cys Ala Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg65 70 75 80Leu Gly Ser Arg Ala Pro Pro Arg Gln Gly Arg Xaa Arg Ser His Leu
85 90 95Ser Ser Gln Cys Arg Arg Arg Arg Gln Ser Arg Pro Pro Ser Xaa Arg
100 105 110Pro Ser Ala Cys Thr Glu Xaa Xaa Val Ser Xaa Ser
115 120<210>5<211>25<212>PRT<213>岗哨病毒II<220><221>Miscellaneous<222>(12)..(12)<223>该残基可以是Ser或Thr。<220><221>Miscellaneous<222>(24)..(24)<223>该残基可以是Leu或Arg。<400>5Met Ser Ser Ser Ser Ser Ile Pro Ser Ala Phe Xaa Pro Ser Phe Cys1 5 10 15Met His Arg Ala Lys Arg Phe Xaa Ile
20 25