促进细胞贴壁生长的聚合物材料表面处理方法 技术领域：
本发明涉及一种促进细胞贴壁生长的聚合物材料表面处理方法，对生物医用聚合物材料，包括薄膜、支架或器皿等进行表面处理，可以用于组织工程、医学工程和基础医学研究等领域。背景技术：
生物医用材料又称生物材料，是和生物系统结合以诊断、治疗或替换机体中的组织、器官或增进其功能的材料。20世纪80年代后期，工程学科与医学学科交叉产生了新兴的组织工程学。组织工程学是用工程学和生命科学的方法来研究生物组织的结构—性能关系、研制生物代用品，以恢复、维持或改善其功能的一门交叉学科。细胞与材料的相互作用是组织工程研究中的主要领域，其中细胞与材料的粘附是基础，细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增值。细胞与材料粘附能力的大小和细胞与材料表面的物理、化学性质有很大关系。如何改变或改善材料表面性能是目前组织工程学的一大难题。
大量的聚合物材料(如聚苯乙烯PS、聚乳酸等)被广泛应用于基础性医学研究及临床医学。这些材料存在着一个共有的缺点是细胞与材料表面的粘附能力不大，细胞在其上的贴壁能力差，由此导致细胞生长缓慢，甚至不能生长，这在很大程度上限制这些聚合物材料在医学研究尤其是在临床医学上的进一步应用。
目前国内外的专利以及文献报道所提到地用于促进细胞生长的聚合物表面处理方法主要有如下几种：离子溅射，等离子体处理，表面涂层等。US 5308704用高能离子枪产生20-500KeV的高能离子对PS表面进行轰炸，植入O、N以及一些其他离子，使得PS表面的亲水性增加，从而增强了细胞在其表面的粘附能力。之后这种方法逐渐形成了一个体系，并在西方一些国家实现了工业化生产，如美国的Corning公司的医用塑料(PS)系列都是经过了高能离子溅射处理的。但这种方法需要一套大型的粒子束设备，设备投资巨大，限制了它在一般工装条件下的应用。J.Neurosci.Method 84(1998)193报道了氧等离子体对PS的改性，这种方法是用一个等离子体发生器产生带几千电子伏特能量的氧粒子，这些粒子被引入到PS表面后大大增强了材料表面的亲水性，从而达到了细胞在其上的粘附能力得到增强的效果。但这种方法与上一种方法具有一个共同的缺点：需要一套庞大的等离子体发生设备。表面涂层技术主要是指在PS等材料表面涂上一层磷脂、胶原质以及纤维蛋白或血清蛋白等胶粘蛋白质，以此来提高细胞在材料表面上的粘附能力。如Langmuir 17(2001)5129提到用磷脂双分子层来改性PS表面性能。这种方法操作相对简便，但有一个致命弱点：细胞是通过基体材料表面的涂层粘附在基体材料上的，材料基体与细胞之间的作用力相对很弱，所以细胞在表面的粘附不稳定。发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便有效的用于促进细胞贴壁生长的聚合物材料表面处理方法，通过物理和化学两种方式，使细胞很容易在材料上粘附并有效促进细胞生长，操作简单、快速，同时对设备要求较低。
为实现这样的目的，本发明采用一定波长、能量的激光，特别是紫外激光，照射医用生物聚合物材料和器皿表面，使材料表面形成规整的微米或纳米结构，然后经紫外或高温消毒后可以直接用于细胞的培养。
本发明是将待处理的聚合物材料或已成型的器皿放置于移动平台上，通过计算机控制平台移动样品，使激光束按照一定的方式扫描辐射材料或器皿的表面。激光的脉冲宽度为1-20ns，脉冲频率为5-10Hz，入射光束的入射角度可以从0°变化到60-，入射光束功率密度为5-100mJ/cm2，偏振方向为面内偏振，移动速率为0.001-30mm/s。经过上述处理的材料或器皿表面形成亚微米到纳米尺寸的周期性微结构，然后经过紫外或高温消毒后可以直接用于细胞的培养。
激光波长可选择紫外区或可见区，根据聚合物材料的光吸收波长选择。
微结构的周期性和入射激光束的波长相近，根据入射条件，周期性也可能小于激光束的波长。微结构的周期性(Г)由激光波长(λ)、入射角(θ)和材料表观折射率(n)决定，且满足如下关系：Г＝λ(n-sinθ)。材料表观折射率介于空气折射率(1)和材料本体折射率(n0)中间的一个数值。
本发明所适用的材料，包括所有对激光波长有吸收的聚合物材料，特别是广泛用于生物医学的各种聚合物材料，如聚苯乙烯、聚乳酸、硅橡胶、聚胺酯、涤纶、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯等。
本发明可以在聚合物表面产生深度为10～150nm范围内的周期性微线条。线条的深度与激光的能量有密切关系：随着激光能量的增大，线条深度增加，但两者并非线形关系。在激光能量较低时，激光能量的增大，线条的深度变化不大，当激光能量达到一定的量值后，随激光能量的增大，线条的深度迅速增大，如果继续增大激光能量，线条深度又保持相对稳定，之后继续增大激光能量时聚合物表面线条开始扭曲，直至线条断裂发生激光消融。
本发明利用激光辐射的方法处理医用生物聚合物材料和器皿表面，使材料表面形成规整的微米或纳米结构，同时使材料表面的含氧含氮量增加，通过物理和化学两种方式的促进，使得细胞很容易在其上粘附，从而促进了细胞的生长。本发明的方法不但对设备要求较低(只要一台普通的激光发生器)，而且具有操作简单快速等特点。附图说明：
图1是本发明所使用的装置示意图。
从激光器1发出的激光一般要经起偏器2、变频器3进行起偏处理，变换到适宜的偏振态(Nd：YAG激光器可以直接使用)，该束激光被反射镜4反射到固定在移动平台6上的聚合物材料或器皿5的表面，反射镜的位置和角度是可以调节的，以控制激光入射角。移动平台受到计算机控制单元7程序的控制，可以在X、Y方向上移动，移动速率可以调节。移动平台6相对于坐标轴的转动角度a、b、c也可以加以调整(a＝0-60°，b＝0-60°，c＝0-360°)，如附图1中所示。
图2是本发明实例1中激光扫描过的PS细胞培养皿表面的原子力显微镜的形貌图。
从图中可以看到用本发明方法制备的聚合物的表面形成了比较规整的纳米条纹结构。
图3为实施例1口腔鳞腺癌细胞分别再激光处理前后的PS培养皿上的生长曲线图。
图4为实施例2口腔鳞腺癌细胞分别再激光处理前后的PS培养皿上生长情况的光学显微镜照片。具体实施方式：实施例1：
将未经任何处理的聚苯乙烯(PS)细胞培养皿置于样品移动平台，用Nd：YAG激光器四倍频(266nm)激光扫描辐射培养皿表面。激光辐射参数是：激光功率密度20mJ/cm2，频率10Hz，脉宽5ns，入射角0°，扫描速度X和Y轴分别为0.01mm/s和10mm/s。用激光处理的PS细胞培养皿和未经过任何处理的PS细胞培养皿进行人体口腔鳞腺癌细胞培养的对比实验。培养细胞前先将两种细胞培养皿在75％乙醇中浸泡24小时进行消毒。以人体口腔鳞腺癌细胞(取自上海市口腔医学研究所口外肿瘤生物实验室)为溶质，含10％胎儿小牛血清的1640+培养液为溶剂，配置起始浓度为5×104个/ml的细胞种子，直接加入经过消毒处理的PS培养皿中，置于5％CO2的细胞培养箱中培养1-7天，并用血小板对细胞进行计。
口腔鳞腺癌细胞分别在激光处理前后的PS培养皿上的生长曲线图如图3所示，计数区域面积为1mm2。由图中两曲线的对比，可以清楚的看出36小时以后细胞在激光处理后的PS培养皿上的生长速度比在未处理PS培养皿上的生长快好几个数量级。实施例2：
将未经任何处理的聚苯乙烯(PS)细胞培养皿置于样品移动平台，用Nd：YAG激光器四倍频(266nm)激光扫描辐射培养皿表面。激光辐射参数是：激光功率密度80mJ/cm2，频率5Hz，脉宽10ns，入射角20°，扫描速度X和Y轴分别为0.001mm/s和5mm/s。在同一个未经任何处理的PS细胞培养皿上分区激光处理，即细胞培养皿的底部一半经过了激光处理，一半没有经过处理，然后进行人体口腔鳞腺癌细胞的培养，并用光学倒置显微镜进行细胞生长的实时观察和拍摄。在图4的光学显微镜照片中，a、b、c、d分别为培养2，24，48，96小时。从图4可见，经过一段时间培养后，激光处理区域的细胞明显多于未处理区，且随着时间的增加，这种差别越来越明显。激光处理区域，细胞经过2小时的培养后，已有一部分开始表现贴壁生长趋势，24小时后，大部分细胞已经贴壁生长，而在未处理区域，细胞一直处于半悬浮的球形状态，未能很好地进行贴壁生长。这种差别同样体现在细胞在不同区域的扩散和增值能力上。