格尔德霉素的制备工艺 【技术领域】
本发明涉及一种广谱抗癌抗生素——格尔德霉素的制备工艺，具体地说涉及从培养格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus var Geldanus)的培养液中利用大孔径层析介质制备高纯度的格尔德霉素的工艺。
本发明还涉及培养格尔德纳斯潮湿链霉菌的液体培养基。背景技术
抗癌抗生素是由微生物代谢产生的具有抗癌活性的小分子化学物质或其衍生物。抗癌抗生素种类繁多，已应用于临床恶性肿瘤治疗的有十余种，如丝裂霉素、阿霉素、柔红霉素、博来霉素、平阳霉素、更生霉素等天然来源的抗癌抗生素及经化学修饰的同类物，它们已成为治疗各类恶性肿瘤较常用的药物。近些年来，世界各国陆续报道了作用于不同靶位的新型抗癌抗生素，其主要靶位包括肿瘤血管、DNA模板、基质金属蛋白酶以及热休克蛋白90(HSP90)等。这其中，HSP90的抑制剂格尔德霉素(geldanamycin，GA)及其某些衍生物的抗癌效果格外引人注目。格尔德霉素是一种潮湿链霉菌分泌的含苯醌结构的化合物，属于苯醌安莎霉素(benzoquinone ansamycin)类抗生素。1971年，人们自潮湿链霉菌的培养液中发现了此种具有抗肿瘤活性的抗生素(美国专利US3,595,955)，该抗生素在水溶液中的溶解度较低，动物实验发现其对肝脏等有毒性。近年来的体外实验表明GA对多种肿瘤细胞的生长有良好的抑制活性，具有广谱抗增殖和抗肿瘤作用。
格尔德霉素通过对HSP90特异性的抑制，导致致癌蛋白的不稳定及降解。格尔德霉素对HSP90功能的抑制实现了对多种癌靶点和途径的抑制，这种多途径的组合抑制作用，使格尔德霉素具有了广谱抗肿瘤细胞活性。HSP90属应激反应蛋白，在正常组织中地含量极低，在恶性肿瘤组织中的含量较高，因此格尔德霉素类药物可以对肿瘤细胞发挥选择性的抑制作用。格尔德霉素的优势还在于其作用的广泛性，HSP90对维持某些关键的癌细胞伴随蛋白的构象、稳定其功能等非常重要。由HSP90负责维系的蛋白包括：受体酪氨酸激酶、跨膜传导调节蛋白、丝氨酸/苏氨酸激酶、突变的p53、c-erbB、Bcr-Abl、Rafl、Akt及低氧诱导因子1等，它们在导致增殖、细胞周期行进和凋亡的信号转导途径中起作用；另外，它们对于维持诸如浸润、血管生长和转移等恶性肿瘤表型的特点也很重要。GA通过HSP90对多种癌靶点的同时抑制作用还有另外一个优点，就是肿瘤细胞不易对其产生抗性，因为一个肿瘤细胞难以同时改变维持其生长的多种信号途径，以逃避，药物的杀伤作用。
GA虽然在人肿瘤细胞及荷瘤动物模型上表现出良好的抑制肿瘤活性，但由于其生产困难和对肝脏的毒性较大，未能应用于临床肿瘤的治疗。经过对多种格尔德霉素衍生物的筛选实验，发现17-烯丙胺基格尔德霉素(17-allylamino，17-demethoxygeldanamycin，17AAG)保持了GA对HSP90的抑制作用，在体外癌细胞培养和肿瘤移植模型中表现出了明显的抗肿瘤活性，在水溶液中的溶解度高于GA，且对肝脏毒性低于GA。体外细胞实验表明，格尔德霉素，17-烯丙胺基格尔德霉素可用于白血病、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种癌症的治疗。
格尔德霉素是合成多种抗肿瘤药物的原料，由于自潮湿链霉菌发酵液中提取高纯度的格尔德霉素较为困难，回收率较低，长期以来成为了研究苯醌安莎霉素类抗生素的障碍。潮湿链霉菌发酵产物中的成分十分复杂，从中提取格尔德霉素的工艺繁琐，多步骤的有机溶剂萃取是造成格尔德霉素回收率低的主要原因，因此在以往的报道中，未见每升发酵液中格尔德霉素产量超过100mg的报道。
以往的报道中，制备格尔德霉素的潮湿链霉菌发酵液的配方未经优化，采用的多是通用的链霉菌培养基配方，发酵密度不高，造成格尔德霉素单位体积产量较低。
格尔德霉素的纯化多采用烦琐的液相分配方案，主要利用的是格尔德霉素在不同溶剂中溶解度的差异，多步骤的反复萃取造成总体的回收率较低。
针对以上制备格尔德霉素中存在的不足，我们改进了培养基的配方，使其更加适合潮湿链霉菌的生长，提高了潮湿链霉菌发酵液单位体积格尔德霉素的产量。配合高选择性大孔径层析介质的使用，使得格尔德霉素的纯化更加简便。为大量制备格尔德霉素及其衍生物提供了可能。发明内容
本发明的目的在于提供一种制备格尔德霉素的新工艺，采用该工艺可大量获得高纯度的抗癌抗生素——格尔德霉索，为大量制备高纯度的格尔德霉素衍生物提供优质原料。该类抗癌抗生素对多种恶性肿瘤细胞具有较高的选择性，适用于多种恶性肿瘤的化疗。
根据本发明的一方面，提供了一种适合潮湿链霉菌生长的液体培养基，每升培养基中包括：
葡萄糖 0.1～100 克
胰蛋白胨 0.5～15 克
燕麦片 0.5～15 克
精制葵花油 1～50 毫升
蛋白水解物 0.1～25 克
酵母提取物 0.1～20 克
酵母氮碱 0.1～50 克
可溶性淀粉 0.1～15 克
糖蜜 0.1～10毫升；以及
适量的无机微量元素
培养基的pH为5.0～8.0。
本发明优选的培养基组成为：
每升含有：
葡萄糖 40 克
胰蛋白胨 2.5 克
燕麦片 1 克
可溶性淀粉 5 克
酵母提取物 2.5 克
精制葵花油 10 毫升
蛋白水解物 2.5 克
酵母氮碱 1 克
糖蜜 10 毫升
磷酸氢二钾 0.015 克
磷酸二氢钠 0.005 克
氯化钙 0.03 克
微量元素混合液 1 毫升
所述微量元素混合液含硫酸铜、硫酸锰、氯化铁、硫酸锌、氯化钴、锰酸钠、硼酸钠及硼酸，各自的浓度为0.1～10mmol/l；pH为7.0～7.2。
根据本发明的另一方面，提供了从培养潮湿链霉菌的液体培养基中采用层析法制备格尔德霉素的工艺，包括采用本发明的液体培养基于不同体积的生物反应器中发酵培养潮湿链霉菌，离心或过滤除去菌体等不溶性物质。利用格尔德霉素在低pH条件下与XAD-7等含类似功能基团的大孔树脂结合较稳定的特性，依次用纯水、甲醇流洗层析柱，将所获馏分置于真空干燥箱中干燥过夜，获得的固形物即为格尔德霉素。
根据本发明工艺制备的格尔德霉素经HPLC测定，纯度大于98.5％，因此，本发明工艺可获得高纯度的格尔德霉素。为在后续的工艺中获得高纯度的格尔德霉素衍生物奠定了基础。每升发酵液可获得高纯度格尔德霉素250mg以上。附图的简要说明
图1为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，50％乙腈流动相色谱图；
图2为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，甲醇色谱图，流动相：50％乙腈；
图3为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，格尔德霉素(甲醇溶剂)色谱图，流动相：50％乙腈；
图4为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，17-烯丙胺基格尔德霉素(甲醇溶剂)色谱图，流动相：50％乙腈。具体实施方式
下面通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明本发明：
实施例1 格尔德霉素的提取和纯化
格尔德霉素提取自格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)的培养液。链霉菌培养、产物提取及纯化工艺如下：
(1)培养基组成
液体培养基中含葡萄糖、胰蛋白胨、燕麦片、蛋白水解物、酵母提取物、酵母氮碱、可溶性淀粉、植物糖蜜等有机物，各主要成分含量在0.01～5％之间，同时适量加入磷酸氢二钾、磷酸二氢纳、氯化钙等无机微量元素，调节pH在5.0～8.0之间。
优选的一种液体培养基的成分如下(每升)：
葡萄糖 40 克
胰蛋白胨 2.5 克
燕麦片 1 克
可溶性淀粉 5 克
酵母提取物 2.5 克
精制葵花油 10 毫升
蛋白水解物 2.5 克
酵母氮碱 1 克
糖蜜 10 毫升
磷酸氢二钾 0.015 克
磷酸二氢钠 0.005 克
氯化钙 0.03 克
微量元素混合液 1 毫升
所述微量元素混合液含硫酸铜、硫酸锰、氯化铁、硫酸锌、氯化钴、锰酸钠、硼酸钠及硼酸，各自的浓度为0.1～10mmol/l；
调整pH至7.0～7.2。高压灭菌或过滤除菌后备用。
(2)种子菌接种及发酵：
本发明所用格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)菌种得自美国农业部农业研究机构保藏中心(Northern Utilizationand Research Division，Agricultural Research，U.S.Department of Agriculture，Peoria，Ill.，U.S.A.)，该菌种于1969年提交永久保藏，保藏号为：NRRL 3602，目前可无任何限制地发放给公众。
自-70℃冰箱或液氮罐中取出低温冻存的菌种接种到2个50ml烧瓶中，28℃，220转/分培养60小时后，转接入4个200ml烧瓶，28℃、200转/分继续培养36小时后，接种到6个2000ml烧瓶，28℃、220转/分培养，36小时后接种到150升的种子发酵罐中，连续培养30小时，每6小时取样检查一次(控制溶氧、pH及泡沫)，之后接种于1500升(或更大容积)的发酵罐中，培养过程调整精制葵花油的加入速度以消除泡沫(每升培养液葵花油的加入量为1-50ml，视泡沫控制情况而定)，同时控制溶氧、罐内空气压力(可达8psi)及pH，每6小时取样一次检测格尔德霉素的含量(高效液相色谱)，至格尔德霉素含量不再明显增加时停止培养，末次培养时间约为120～170小时(视发酵罐的体积有所不同)，终止发酵时格尔德霉素的含量可达300mg/L以上。发酵过程中亦可采用其它的消泡剂控制泡沫。
(3)格尔德霉素的提取
采用过滤或离心法澄清培养液，在过滤液或离心上清液中加入盐酸或硫酸等调整液体的pH至4.5，将样品流经预装XAD-7大孔树脂(或含类似功能基团的大孔树脂，如日本三菱化学生产的HP2MG树脂等)，紫外检测器(254nm/304nm)检测层析柱的流出液体，加样完成后，用10～60倍柱体积的纯水流洗层析柱，流洗至基线平稳后，用甲醇洗脱，收集洗脱峰，将所获馏分置于真空干燥箱或旋转蒸发器中干燥，获得的固形物即为格尔德霉素，HPLC测定纯度大于98％。
质谱仪测定分子量为560，熔点252-254℃，易溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂，稍溶于丙酮、甲醇等，微溶于水，冻干后室温保存稳定。
结果见图1、图2和图3。
实施例2 17-烯丙胺基格尔德霉素的化学合成
向盛有100ml三氯甲烷的磨口玻璃烧瓶中加入600mg格尔德霉素(纯度不低于98％)，充分振摇10分钟，完全溶解后，加入2ml烯丙胺(SIGMA/FLUKA/ALDRICH，纯度不低于99％)，低速搅拌反应20～24小时。此后向反应器中加入100ml于2～4℃预冷的超纯水，用6M盐酸调pH至3.0，高速搅拌至少30分钟，停止搅拌后将液体移入250ml玻璃分液漏斗内静置，待其自然分层，收集下层的三氯甲烷相。向水相中再次加入100ml三氯甲烷，充分搅拌，待其分层后收集三氯甲烷相，将两次收集的三氯甲烷相合并，倒入含无水硫酸钠的烧结玻璃漏斗内，用玻璃棒搅拌，抽滤除去固体硫酸钠，收集滤过液，用旋转蒸发器减压浓缩后得橙色固形物。此固形物用丙酮-n-己烷重结晶，减压干燥后可获617mg 17-烯丙胺基格尔德霉素(回收率98.1％)，熔点为212～214℃，质谱仪测定分子量约为586。结果见图4。
实施例3 用于癌症的治疗
实验研究发现，17AAG对肺癌细胞的生长能从多个方面发挥抑制作用，除了像在对其他肿瘤细胞那样发挥抗增殖及使肿瘤细胞对化疗药物敏感性增强等作用外，17AAG还能明显抑制erB1/erB2的表达，抑制肿瘤细胞分泌MMP-9及VEGF，增强E-钙粘素的表达，从而抑制肿瘤细胞的转移。动物体内实验表明，含有17AAG的化疗方案能较其他方案明显缩小裸鼠荷瘤的体积，延长小鼠生存期，17AAG治疗组约有50％的核瘤小鼠的肿瘤完全消失。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只有不脱离本发明的精神和内容，均应属于本发明所附权利要求的范围。