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1、10申请公布号CN104288763A43申请公布日20150121CN104288763A21申请号201410444512722申请日20091020KCCM11036P20091007KCCM11037P20091007102009005517920090619KR200980111082420091020A61K39/295200601A61P15/00200601A61P35/0020060171申请人艾金株式会社地址韩国首尔72发明人金洪珍李奈暻赵良济张镇旭金亨真金光成74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华54发明名称宫颈癌疫苗57摘要本发明涉及。
2、人宫颈癌的药物疫苗组合物，其含AI16型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP、18型HPV的L1VLP，或上述之组合；及II脱酰基化的非毒性脂寡糖LOS；及B药学可接受载质；及制备人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的方法。本发明的药物疫苗组合物在针对HPV的TH1型免疫应答细胞免疫及TH2型免疫应答体液免疫中优于CERVARIXTM及GARDASILTM，作为人宫颈癌疫苗表现出优良功效。30优先权数据62分案原申请数据83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书19页序列表7页附图27页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书19页序列表7页附图27。
3、页10申请公布号CN104288763ACN104288763A1/1页21人宫颈癌的药物疫苗组合物，其含AI16型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP，18型HPV的L1VLP，或上述之组合，其中所述L1VLP不通过纯化过程获得，所述过程包括下列步骤1培养含编码所述16或18型HPV的L1的核苷酸序列的酵母；2裂解所述培养的酵母；3通过用硫酸铵沉淀所述酵母裂解物来除去杂质；及4对已除去所述杂质的所述酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析；及II作为脱酰基化的非毒性脂寡糖的CIA05，其通过从大肠杆菌ESCHERICHIACOLI分离的脂多糖的脂质A脱酰基化来脱毒；及B药学可接受载质。权利。
4、要求书CN104288763A1/19页3宫颈癌疫苗0001本申请是2009年10月20日提交的申请号为2009801110824的同名发明专利申请的分案申请。【技术领域】0002本发明涉及人宫颈癌的药物疫苗组合物，预防人宫颈癌的方法，及制备人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的方法。【背景技术】0003已知多于80种类型的人乳头瘤病毒HPV，及约30类型通过性接触引发宫颈感染，已知其中一半类型与宫颈癌相关ZURHAUSENH,MOLCARCINOGENESIS81471501988。其中，已知被16及18型HPV感染的女性的患癌率比正常女性高约500倍，且16及18型HPV感染生殖器官上。
5、皮细胞，经恶性转化引发宫颈癌ZURHAUSENH,MOLCARCINOGENESIS81471501988；HAUSEN,BIOCHEMICABIOPHYSICAACTA128855781996。0004目前已使用高危型HPV病毒样颗粒VLP开发了预防宫颈癌的疫苗。VLP是HPV的主衣壳蛋白L1蛋白，约55KDA，且作为疫苗候选物具有各种优势，包括A无需其他病毒基因产物如见于天然HPV病毒粒子自装配成VLP的能力；B持续长期免疫；及C由于针对基因型的类型特异性而高效。0005使用VLP的GARDASILMERCKCO，INC是使用针对最常见的6、11、16及18型HPV的各抗原，及使用ALUM。
6、作为免疫佐剂开发的疫苗。CERVARIXGLAXOSMITHKLINEPLC是使用作为引发宫颈癌的代表性因子的16及18型HPV，及使用独立开发的AS04作为免疫佐剂开发的疫苗。0006在GARDASIL中用作免疫佐剂的ALUM已被用于白喉、破伤风及乙型肝炎病毒疫苗，且据报道ALUM增强抗原稳定性及诱导细胞因子释放。但是，GARDASIL的使用受到以下限制A使不可能冻干或冷冻疫苗；B并非对所有抗原有效；及C其仅促进体液免疫应答。0007以诱导强力及持久的免疫应答为目的开发了含于GSK的CERVARIX的AS04，其由氢氧化铝及单磷酰脂质AMPL组成。本文中的术语“MPL”指能直接活化关键免疫应。
7、答的免疫刺激物质，发挥增强针对含于疫苗的抗原的免疫应答的作用。0008免疫佐剂最近受到注目，其用于各种疫苗例如宫颈癌疫苗及流感疫苗。其中，细菌DNA作为抗癌剂自上世纪60年代开始受到注目，且持续研究至今。但是，细菌DNA由于其低功效而未能单独用作抗癌剂GLICK,JLTHESPECICITYOFINHIBITIONOFTUMORCELLVIABILITYBYDNACANCERRES2723381967。尽管有此缺陷，已证实，已知细菌DNA无严重副作用地活化各种免疫细胞，且作为佐剂具有许多优势MCCLUSKIEMJ,ETAL,CPGDNAISAPOTENTENHANCEROFSYSTEMICAN。
8、DMUCOSALIMMUNERESPONSESAGAINSTHEPATITISBSURFACEANTIGENWITHINTRANASALADMINISTRATIONTOMICEJ说明书CN104288763A2/19页4IMMUNOLNOV1；1619446361998。0009对于细菌DNA的这些效果，日本的YAMAMOTO等人主张含CG的重复序列在细菌DNA的效果中起重要作用，这也被KRIEG等人证实YAMAMOTOSETALUNIQUEPALINDROMICSEQUENCESINSYNTHETICOLIGONUCLEOTIDESAREREQUIREDTOINDUCEIFNANDAUGME。
9、NTIFNMEDIATEDNATURALKILLERACTIVITYJIMMUNOL14840721992；KRIEGAM,ANTITUMORAPPLICATIONSOFSTIMULATINGTOLLLIKERECEPTOR9WITHCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESCURRONCOLREPMAR；6288952004。自上世纪90年代中期，CPG的相关研究显示了将含未甲基化的CG的合成的DNACPGODN作为抗癌剂的DNA抗癌剂的可能性，尤其研究了抑制短合成的DNA降解的二酯键中的S取代。通过这些努力，CPGODN相关产品不仅作为佐剂，也作为抗癌剂用于临床试验HTTP/WWWC。
10、OLEYPHARMACOM。0010但是，仍待解决的一些问题包括CPGODN的二酯键中的S取代的免疫原性及仍低的抗癌活性。目前临床中使用的CPG7909是诱发抗DNAAB的硫代磷酸酯寡核苷酸CLINIMMUNOLAUG；1002157632001，且其与自身免疫疾病例如SLE全身性红斑狼疮紧密相关JCLINIMMUNOLJULY；6429281986。此外，已知硫代磷酸酯结构发挥TIAG的作用，给针对感染的免疫保护带来扰乱MOLIMMUNOLDEC；35181161701998。0011对于自上世纪50年代开始已知具有抗癌效果的LPS，由于NG水平的LPS即可导致由败血症的死亡，使难以利用LP。
11、S。普遍认为LPS与DNA的连接引发严重细胞毒性，因而消除LPS被认为是在DNA相关的药品中非常重要的过程GAOJJETAL,BACTERIALDNAANDLIPOPOLYSACCHARIDEINDUCESYNERGISTICPRODUCTIONOFTNFALPHATHROUGHAPOSTTRANSCRIPTIONALMECHANISMJIMMUNOL166116855602001。在功效方面，认为由LPS刺激的免疫应答显著强于由DNA刺激的免疫应答，然而由于所述应答不是对于抗癌重要的TH1型应答，而是TH2型应答，所以LPS不适宜作为抗癌剂LEBMANDAETALINTERLEUKIN4CA。
12、USESISOTYPESWITCHINGTOIGEINTCELLSTIMULATEDCLONALBCELLCULTURESJEXPMEDSEP1；1683853621988。尤其是TH2型免疫活性抑制TH1型免疫活性，非常难以将LPS用作抗癌剂RENGARAJANJETALTRANSCRIPTIONALREGULATIONOFTH1/TH2POLARIZATIONIMMUNOLTODAYOCT；2110479832000。0012进行了试图对LPS脱毒的多种研究，在通过除去多糖链或脂质A脱酰基化来降低其细胞毒性中成功KATZSSETALDEACYLATIONOFLIPOPOLYSACCHARI。
13、DEINWHOLEESCHERICHIACOLIDURINGDESTRUCTIONBYCELLULARANDEXTRACELLULARCOMPONENTSOFARABBITPERITONEALINFLAMMATORYEXUDATEJBIOLCHEMDEC17；2745136579841999。例如通过除去LPS的多糖链而得到的脂质A的磷酸化来得到单磷酰脂质AMPL而开发了免疫治疗抗癌剂。但是，已知其功效相当低HTTP/WWWCORIXACOM。0013对此，本发明人已开发新免疫佐剂来弥补上述免疫佐剂的缺点韩国专利NO074023720070710。0014本申请通篇参考了各种专利及出版物，及在。
14、括号内提供了引文。这些专利及出版物的公开内容通过引用以其整体并入本申请，以更详细说明本发明及本发明所属领域的状说明书CN104288763A3/19页5态。【发明内容】0015【技术课题】0016本发明人经锐意研究开发了可克服上述常规宫颈癌疫苗的问题的新疫苗。结果，我们发现，可在使用16或18型HPV的L1VLP进行免疫的过程中将从脂质A除去部分脂肪酸的非毒性LOS脂寡糖用作免疫佐剂，从而比基于VLP的常规疫苗更显著诱导HPV免疫应答，使能成为预防人宫颈癌的优良疫苗。0017因此，本发明旨在提供人宫颈癌的药物疫苗组合物。0018本发明还旨在提供预防人宫颈癌的方法。0019本发明又旨在提供制备H。
15、PVL1VLP的方法。0020本发明还旨在提供编码16型HPV的L1VLP的新核酸序列。0021本发明还旨在提供编码18型HPV的L1VLP的新核酸序列。0022本发明还旨在提供经上述新核酸序列转化的酿酒酵母。0023本发明的其他目的及优势将通过以下详述及随附的权利要求书及附图而显而易见。0024【解决课题的技术方案】0025本发明的一方面，提供了人宫颈癌的药物疫苗组合物，其含AI16型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP，18型HPV的L1VLP，或上述之组合；及II脱酰基化的非毒性脂寡糖LOS；及，B药学可接受载质。0026本发明另一方面，提供了预防人宫颈癌的方法，包括给人施用上述药物。
16、组合物。0027本发明人经锐意研究开发了可克服上述常规宫颈癌疫苗的问题的新疫苗。结果，我们发现，可在使用16或18型HPV的L1VLP进行免疫的过程中将从脂质A除去部分脂肪酸的非毒性LOS脂寡糖用作免疫佐剂，从而比基于VLP的常规疫苗更显著诱导HPV免疫应答，使能成为预防人宫颈癌的优良疫苗。0028本发明的药物组合物中使用的VLP源于16或18型HPV的L1VLP。已知16或18型HPV是高危型HPV，且是诱导宫颈癌的代表性HPV。0029本文中的术语“HVPL1蛋白”指由HPV的L1基因表达的HPV衣壳中的主要蛋白。L1蛋白可在适宜条件下与构成HPV衣壳的另一次要蛋白L2蛋白一起或L1蛋白本。
17、身自我装配。0030本发明中使用的VLP包括编码天然16或18型HPV的L1蛋白，及其功能性L1蛋白衍生物的总序列。本文中的术语“功能性HPVL1衍生物”指序列虽不同于编码天然HPVL1蛋白的总序列，但能形成VLP且诱导免疫应答的天然HPVL1蛋白衍生物。例如，功能性HPVL1衍生物是除去了细胞核定位信号的截短的L1蛋白。能在本发明中使用的HPVL1蛋白的另一例包括除去了其C端的34个氨基酸的16型HPV的L1蛋白，或除去了其C端的35个氨基酸的18型HPV的L1蛋白。编码16或18型HPV的L1VLP的例示氨基酸序列分别示于SEQIDNO2及SEQIDNO4。0031作为本发明的药物组合物中。
18、诱导免疫应答的抗原，使用HPV16L1VLP或HPV18L1VLP，优选两者。说明书CN104288763A4/19页60032或者，除HPV16L1VLP或HPV18L1VLP之外，L1VLP作为抗原还可包括选自下列的至少1种L1VLP31型HPV，45型HPV，6A型HPV，6B型HPV，11型HPV，33型HPV，35型HPV，39型HPV，51型HPV，52型HPV，56型HPV，58型HPV及68型HPV的L1VLP。0033或者，本发明中使用的L1VLP可与其他蛋白例如L2蛋白融合。0034本发明的药物组合物的最大特征是利用脱酰基化的非毒性LOS脂寡糖作为免疫佐剂。本文中首先采用的。
19、术语“LOS脂寡糖”指具有短于天然LPS的糖链的低分子量LPS脂多糖变体。LOS在脱酰基化前具有5,00010,000DA范围的分子量。本文中的术语“脱酰基化的LOS”指从LOS除去与脂质A的葡萄糖胺经COO键连接的脂肪酸的LOS形式，导致细胞毒性相比LPS显著降低。脂肪酸与脂质A的葡萄糖胺通过COO键及CONH键连接。本发明的脱酰基化的LOS是通过脂质A脱酰基化除去了经COO键连接的脂肪酸的LOS。0035本发明的脱酰基化的非毒性LOS可根据各种方法制备，例如本发明人之前的专利包括韩国专利NO0456681；WO2004/039413；韩国专利NO0740237；及WO2006/121232。
20、中公开的方法。例如，通过用强碱例如2NNAOH处理LPS脂多糖而脱酰基化来从脂质A除去LOS中的部分脂肪酸及脱毒。0036根据优选实施方式，本发明中用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性LOS通过由碱处理LPS脂多糖的脂质A脱酰基化来脱毒。碱的优选例包括NAOH、KOH、BAOH2、CSOH、SROH2、CAOH2、LIOH、RBOH及MGOH2，更优选NAOH、KOH、BAOH2、CAOH2、LIOH及MGOH2，再更优选NAOH、KOH及MGOH2，及最优选NAOH。0037LPS的脱毒程度可根据本领域技术人员已知的各种方法分析。例如，脱毒可通过测量用LPS处理的THP1急性单核细胞白血病中分泌的。
21、TNF瘤坏死因子的量来测定。本发明的脱酰基化的非毒性LOS相比常规LPS诱导相对少量的TNF分泌。0038本发明的脱酰基化的非毒性LOS的另一特征是具有低于一般常规LPS的分子量。本发明中使用的脱酰基化的非毒性LOS优选具有1,50010,000DA范围的分子量，更优选2,0005,000DA，再更优选2,0004,000DA，又再更优选3,0004,000DA，及最优选3,2003,700DA范围的分子量。分子量的测量可使用常规方法进行，例如MALDIMASS。0039根据优选实施方式，本发明的脱酰基化的非毒性LOS源于大肠杆菌ECOLI，及最优选由本发明人分离的大肠杆菌EG0021KCCM。
22、10374。0040本发明中使用的脱酰基化的非毒性LOS由于相比常规免疫佐剂免疫刺激效果更优良且细胞毒性显著低，因此非常适宜用于本发明的疫苗组合物。如下文实施例所证实，本发明的脱酰基化的非毒性LOS具有比为降低LPS细胞毒性而通过除去LPS的多糖链而得到的脂质A的磷酸化来得到的单磷酰脂质AMPL更低的细胞毒性。0041如下文实施例中所示见图2324，一起施用本发明的脱酰基化的非毒性LOS与HPVL1VLP还诱导与TH2型免疫应答体液免疫相关的IGG1以及与TH1型免疫应答细胞免疫相关的IGG2A水平，证实本发明的脱酰基化的非毒性LOS可与HPVL1VLP一起协同诱导免疫应答。0042本发明的疫。
23、苗组合物可仅以含HPV16L1VLP、HPV18L1VLP或上述之组合，及脱酰基化的非毒性LOS的基本组成发挥宫颈癌预防功效。或者，本发明的疫苗组合物还可包括其他免疫佐剂，例如包括选自MG、CA、SR、BA及RA的II族元素；选自TI、ZR、HF及说明书CN104288763A5/19页7RF的IV族元素；或铝的盐或它们的氢氧化物。盐优选以氧化物、过氧化物、氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、硫酸盐或硅酸盐形成。例如，还能用于本发明的疫苗组合物的免疫佐剂包括氢氧化镁、氢氧化碳酸镁五水合物、二氧化钛、碳酸钙、氧化钡、氢氧化钡、过氧化钡、硫酸钡、硫酸钙、焦磷酸钙、碳酸镁、氧化。
24、镁、氢氧化铝、磷酸铝及硫酸铝钾水合物ALUM。还能用于本发明的疫苗组合物的免疫佐剂最优选为氢氧化铝。0043根据优选实施方式，16或18型HPV的L1VLP通过纯化过程得到，所述纯化过程包括下列步骤I培养含编码16或18型HPVL1的核苷酸序列的酵母；II裂解培养的酵母；III通过用硫酸铵沉淀酵母裂解物以除去杂质；及IV对已除去杂质的酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析。0044以下详述纯化过程。0045本发明的药物疫苗组合物中的药学可接受载质可为制备制剂时常规使用的药物可接受载质，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡。
25、咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、及矿物油，但不限于此。本发明的药物组合物还可包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及防腐剂。适宜药学可接受载质及制剂的详述可见于REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES19THED，1995，其通过引用并入本文。0046本发明的药物组合物可经口服或肠胃外施用。当本发明的药物组合物肠胃外施用时，可通过静脉内、皮下、肌肉内、腹腔及经皮施用。0047本发明的药物组合物的适宜剂量可根据药物组合物的药物制剂方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病严重性、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度及敏感。
26、性而变化。本发明的药物组合物优选以000011,000MG/KG体重的日剂量施用。0048根据本领域技术人员已知的常规技术，药物组合物可与上述药学可接受载质和/或赋形剂制成制剂，从而提供多种剂型包括单元剂型及多剂型。制剂可为油或水介质中的溶液，悬浮液或乳液，提取剂，粉剂，颗粒剂，锭剂及胶囊剂，且还可包括分散剂或稳定剂。0049本发明的药物疫苗组合物可比常规疫苗包括CERVARIXTM及GARDASILTM诱导更强的针对HPV的免疫应答，因而具有优良的宫颈癌预防功效。此外，本发明的药物疫苗组合物由于本发明中用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性LOS几乎无细胞毒性而具有优良安全性。0050如下文实施例所。
27、证实，施用本发明的药物疫苗组合物比施用CERVARIXTM及GARDASILTM显著提高与TH1型免疫应答细胞免疫相关的干扰素、IGG2A及IGG2B水平，以及与TH2型免疫应答体液免疫相关的IGG1水平。换言之，本发明的药物疫苗组合物可诱导均优于CERVARIXTM及GARDASILTM的针对HPV的TH1型免疫应答细胞免疫及TH2型免疫应答体液免疫。0051本发明另一方面提供了制备人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的方法，包括下列步骤0052I培养含编码HPVL1的核苷酸序列的酵母；0053II裂解培养的酵母；0054III用硫酸铵沉淀酵母裂解物以除去杂质；及0055IV对已除去杂质。
28、的酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析。说明书CN104288763A6/19页80056本发明人为开发用于制备针对HPV的疫苗的HPVVLP的酵母表达系统中简化产生HPVVLP的过程，及提高HPVVLP产率的纯化方法进行了锐意研究。结果我们发现，用硫酸铵沉淀酵母裂解物及进行肝素层析或阳离子交换层析可达到优良纯化效力产率及纯度。0057以下根据下列步骤详述本发明0058【I表达HPVL1蛋白的经转化酵母的培养】0059根据本发明的方法，对于作为L1蛋白来源的HPV类型不特别限制，其包括6A型HPV，6B型HPV，11型HPV，16型HPV，18型HPV，31型HPV，33型HPV，35型HP。
29、V，39型HPV，45型HPV，51型HPV，52型HPV，56型HPV，58型HPV及68型HPV，但不限于此。，本发明的L1蛋白优选源于选自下列的HPV6A型HPV，6B型HPV，11型HPV，16型HPV，18型HPV，31型HPV，33型HPV及45型HPV，且更优选16型HPV及18型HPV。0060本发明中用作宿主细胞的细胞是酵母，例如包括但不限于面包酵母、酿酒酵母、巴斯德酵母SACCHAROMYCESPASTORIANUS，酵母属，裂殖酵母SCHIZOSACCHAROMYCESPOMBE等。本发明的宿主酵母最优选为酿酒酵母。0061表达HPVL1蛋白的经转化酵母指经成功表达HPV。
30、L1蛋白的表达载体转化的酵母细胞。本领域技术人员已知的各种启动子例如包括可与待在表达载体中表达的HPVL1基因上游连接的GAL1启动子、GAL10启动子JOHNSON,M,ANDDAVIES,RW,MOLANDCELLBIOL,4144014481984、ADH2启动子RUSSELL,D,ETAL,JBIOLCHEM,25826742682,1983、PH05启动子EMBOJ6675680,1982或MFAL启动子；及可含于表达载体中的多聚腺苷酸化序列包括ADHI、MFAL或TPIDERIVED多聚A序列ALBER,TANDKAWASAKI,G,JMOLAPPLGENET14194341982。
31、。作为酵母表达载体，YEP6、YEPL3、YEP4及YEGSNKIM,ETAL,JVIROLMETHODS13920072430；RKIRNBAUER,ETAL,JVIROL67199369296936为本领域所熟知。经表达HPVL1蛋白转化的酵母可根据本领域技术人员已知的各种方法制备，例如包括美国专利NOUS7250170、US6613557、US5888516、US5871998、US5618536及US5437951，它们通过引用并入本文。0062根据优选实施方式，经转化的酵母在补充了一种或多种葡萄糖及半乳糖碳源的培养基中培养。根据另一优选实施方式，葡萄糖及半乳糖之比是葡萄糖半乳糖重量之。
32、比0134，更优选葡萄糖半乳糖051354，且最优选为葡萄糖半乳糖13。本发明的培养基中使用的葡萄糖及半乳糖重量之比在上述范围内时HPVL1蛋白表达可最大化。0063培养经转化酵母中使用的例示培养基是YPDG培养基，其包括酵母提取物、胨、葡萄糖及半乳糖。0064【II培养的酵母的裂解】0065本发明中培养的酵母的裂解方法不限于特定方法，优选获得酵母细胞全裂解物的裂解方法。例如，能在本发明中使用的裂解方法包括但不限于超声处理或使用玻璃珠搅匀。0066【III酵母裂解物的用于除去杂质的硫酸铵沉淀】0067通过向酵母裂解物加入硫酸铵来沉淀表达蛋白及除去杂质。0068根据优选实施方式，待加入的硫酸铵的。
33、浓度在2060WT范围内，更优选在40说明书CN104288763A7/19页950WT范围内，及最优选在4248WT范围内。当硫酸铵浓度在不多于40WT范围内时，本发明中表达的HPVL1蛋白的沉淀效力降低。硫酸铵浓度在不少于50WT范围内时，本发明中表达的HPVL1蛋白的沉淀效力不随硫酸铵增加而提高。0069或者，裂解通过硫酸铵沉淀得到的蛋白沉淀物，且与不少于05M的NACL混合，之后于4温育至少12小时。0070【III2低浓度盐例如NACL中杂质的去除】0071在含低浓度盐例如NACL的缓冲液中透析从步骤III得到的溶液，然后于室温温育以除去不溶性杂质。0072根据本发明的一个实施例，低。
34、浓度盐的浓度使用000103M范围的浓度，更优选00102M，且最优选0108M，且待使用的盐选自NACL、KCL、MGCL2、CACL2、NA2SO4及NH42SO4，且最优选NACL。0073根据优选实施方式，低浓度盐处理过程在非离子型表面活性剂存在下进行。例如，非离子型表面活性剂包括聚氧基亚烷基山梨聚糖脂肪酸酯，山梨聚糖脂肪酸酯，亚烷基二醇脂肪酸酯，聚氧基亚烷基脂肪酸酯，脂肪酸酯，聚氧基亚烷基脂肪酸醚，C1624脂肪酸，脂肪酸单、二或聚甘油酯，聚氧基亚烷基烷基酚，烷基苯基醚，聚氧基乙烯聚氧基丙烯嵌段共聚物，脂肪酸胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺，烷基纤维素，羧基烷基纤维素或聚氧基亚烷基蓖麻油衍生。
35、物，且优选聚氧基乙烯山梨聚糖单或三月桂基，棕榈基，硬脂基或油基酯例如聚氧基乙烯20山梨聚糖单月桂酸酯TWEEN20，聚氧基乙烯4山梨聚糖单月桂酸酯TWEEN21，聚氧基乙烯20山梨聚糖单棕榈酸酯TWEEN40，聚氧基乙烯20山梨聚糖单硬脂酸TWEEN60，聚氧基乙烯20山梨聚糖三硬脂酸TWEEN65、聚氧基乙烯20山梨聚糖单油酸酯TWEEN80或聚山梨酯80或聚氧基乙烯20山梨聚糖三油酸酯TWEEN85。此外，优选用浓度0001001的非离子型表面活性剂处理。0074上述低浓度NACL处理步骤对于除去杂质非常有效，及显著贡献于本发明的方法中缩短过程及改善纯化效力。0075通过离心除去所述步骤中。
36、产生的不溶性蛋白，导致显著增加待通过肝素层析或阳离子交换层析洗脱的VLP的纯度。因此显示，所述步骤通过简单方法除去杂质来起提高纯化效力的作用。0076【IV肝素层析或阳离子交换层析】0077对除去了杂质的溶液进行肝素层析或阳离子交换层析。0078将除去了杂质的溶液用上述肝素层析或阳离子交换层析纯化时，可非常有效除去杂质。0079进行肝素层析的步骤中，在装载进肝素树脂柱前，将步骤III或III2的溶液用适宜肝素树脂的结合缓冲液平衡。结合缓冲液优选包括NACL及非离子型表面活性剂例如TWEEN80，且NACL优选以低浓度0102M使用。然后，样品施加肝素层析，然后将蛋白从树脂洗脱下来。洗脱方法优选。
37、使用线性NACL梯度。更优选以NACL033066M线性梯度洗脱杂质，然后以NACL0662M线性梯度洗脱希望的L1蛋白。0080可使用各种树脂进行阳离子交换层析，优选与硫、硫烷基例如硫甲基、硫乙基及硫丙基、磷酸或磷酸烷基官能团，且最优选磷酸官能团连接的阳离子交换剂。进行阳离子交换层析的步骤中，在装载进肝素树脂柱前，将步骤III或III2的溶液用适宜肝素树说明书CN104288763A8/19页10脂的结合缓冲液平衡。结合缓冲液优选包括NACL及非离子型表面活性剂例如TWEEN80，且NACL优选以低浓度0304M使用。之后，样品施加阳离子交换层析，然后将蛋白从树脂洗脱下。洗脱方法优选使用NA。
38、CL阶段性梯度。更优选使用含06M，07M，08M及1M的NACL的洗脱缓冲液洗脱希望的L1蛋白。0081【V浓缩】0082根据优选实施方式，将通过上述层析得到的L1蛋白级分用膜滤器浓缩。优选将层析级分使用能截留分子量50100KDA的蛋白的膜来浓缩。由于VLP具有平均约50NM的大小，相比其他蛋白大，从而无法通过膜而被浓缩，而大部分残余杂质能通过膜而被除去。从而，此步骤不仅增加HPV16L1蛋白的纯度，还提高HPV16L1蛋白的浓度。0083本发明的制备方法在进行本发明的层析步骤前通过利用在特定条件下处理细胞匀浆而除去杂质的方法来使L1蛋白的纯化效力最大化。用硫酸铵沉淀细胞匀浆来首次除去杂质。
39、，然后在低浓度盐条件下温育来二次除去杂质。上述方法可除去约80的杂质及回收不少于80的L1蛋白，从而简单地提高纯度。因此，本发明的方法具有许多优势，例如A无需进行多个层析步骤而以高纯度纯化L1蛋白；B将此方法应用于以试验及工业规模生产及纯化，则可显著节约生产蛋白中所需要的时间、成本及人工。0084本发明另一方面提供了编码16型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的核酸序列，其含SEQIDNO1的核苷酸序列。此外，本发明提供编码18型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的核酸序列，其含SEQIDNO3的核苷酸序列。0085本发明另一方面提供了酿酒酵母保藏号KCCM11036P，其经上述编。
40、码16型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的核酸序列转化。此外，本发明提供酿酒酵母保藏号KCCM11037P，其经上述编码18型人乳头瘤病毒HPV的L1病毒样颗粒VLP的核酸序列转化。0086SEQIDNO1及SEQIDNO3的核苷酸序列经优化以高效表达编码HPVL1蛋白的核苷酸序列。0087【发明效果】0088将本发明的特征及优势总结如下0089A人宫颈癌的药物疫苗组合物利用HPV16L1VLP、HPV18L1VLP，或者HPV16L1VLP及HPV18L1VLP作为抗原，及脱酰基化的非毒性LOS作为免疫佐剂。0090B脱酰基化的非毒性LOS在针对HPV的免疫应答中具有非常优良的免疫刺。
41、激效果，及由于几乎无细胞毒性而具有更高安全性。0091C此外，脱酰基化的非毒性LOS通过增强由HPVL1VLP诱导的TH1型免疫应答细胞免疫及TH2型免疫应答体液免疫两者来协同诱导针对HPV的免疫应答。0092D本发明的药物疫苗组合物在针对HPV的TH1型免疫应答细胞免疫及TH2型免疫应答体液免疫中均优于CERVARIXTM及GARDASILTM，作为人宫颈癌疫苗表现出优良功效。0093E本发明的HPVL1VLP制备方法允许通过一个层析步骤以高纯度纯化L1蛋白，及将此方法应用于以试验及工业规模生产及纯化，则具有可显著节约生产蛋白中需要的时间、成本及人工的效果。说明书CN104288763A10。
42、9/19页11【附图说明】0094图12是表达16型及18型HPVL1VLP蛋白的YEP酵母表达载体的DNA图谱。AMPR是氨苄西林抗性基因，URA3是合成乳清苷5磷酸脱羧酶的基因，2MICRON是复制原点，其他表示限制性内切酶位点。0095图3是显示用于纯化HPV16L1及HPV18L1的实验过程的流程图。用2种纯化方法分离前，通过硫酸铵沉淀样品及以低浓度NACL温育来除去不溶性污染物。方法1是肝素层析，方法2是阳离子交换层析方法。0096图46是显示HPV16L1纯化结果的电泳图谱。图4显示不经过除去不溶性污染物的步骤而肝素层析后得到的样品的SDSPAGE结果。图5是根据图3中的方法1的肝。
43、素层析的SDSPAGE结果。图6是肝素层析后的蛋白印迹结果。泳道1及2是装载的样品及未结合的样品。泳道3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16各代表样品级分9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45及48。箭标指示L1蛋白的分子量。0097图78是显示HPV16L1的纯化结果的电泳图谱。图7显示通过根据图3中的方法2的阳离子交换层析得到的样品的SDSPAGE结果。图8是阳离子交换层析后的蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别是装载的样品、未结合的样品及洗涤的样品。泳道4、5、6、7、8及9各代表样品级分1、2、3、4、5、6。样品级分1、2。
44、及3分别用含06、07及08MNACL的缓冲液洗脱。样品级分4、5及6用含1MNACL的缓冲液洗脱。箭标指示L1蛋白的分子量。0098图9是显示合并从肝素层析及阳离子交换层析的L1级分后，用截留大小50100KDA的膜滤器浓缩的纯化的HPV16L1样品的电泳图谱。图9A是SDSPAGE结果，图9B是蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别代表BSA、通过方法1纯化的HPV16L1及通过方法2纯化的HPV16L1。样品使用BRADFORD测定法定量，各泳道装载200NG的样品。0099图1011表示根据图3中的方法1及方法2纯化的HPV16L1蛋白的电子显微镜照片。将纯化的HPV16L1蛋白附着于包被了。
45、碳的网格，及用磷酸钨酸负染色。用透射电子显微镜以41,000放大倍数拍摄显微照片。误差棒是100NM。0100图1214是显示HPV18L1的纯化结果的电泳图谱。图12显示未经过除去不溶性污染物的步骤而肝素层析后得到的样品的SDSPAGE结果。图13是根据图3中的方法1的肝素层析的SDSPAGE结果。图14是肝素层析后的蛋白印迹结果。泳道1及2是装载的样品及未结合的样品。泳道3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16各代表样品级分9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45及48。箭标指示L1蛋白的分子量。0101图1516是显示HPV1。
46、8L1的纯化结果的电泳图谱。图15显示根据图3中的方法2的阳离子交换层析得到的样品的SDSPAGE结果。图16是阳离子交换层析后的蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别是装载的样品、未结合的样品及洗涤的样品。泳道4、5、6、7、8及9各代表样品级分1、2、3、4、5、6。样品级分1、2及3分别用含06、07及08MNACL的缓冲液洗脱。样品级分4、5及6用含1MNACL的缓冲液洗脱。箭标指示L1蛋白的分子量。0102图17是显示合并从肝素层析及阳离子交换层析的L1级分后，用截留大小50100KDA的膜滤器浓缩的纯化的HPV18L1样品的电泳图谱。图17A是SDSPAGE结果，图17B是蛋白印迹结果。。
47、泳道1、2及3分别代表BSA、通过方法1纯化的HPV18L1及通过方法2纯化的HPV18L1。样品使用BRADFORD测定法定量，各泳道装载200NG的样品。0103图1819代表根据图3中的方法1及方法2纯化的HPV18L1蛋白的电子显微说明书CN104288763A1110/19页12镜照片。将纯化的HPV18L1蛋白附着于包被了碳的网格及用磷酸钨酸负染色。用透射电子显微镜以41,000放大倍数拍摄显微照片。误差棒是100NM。0104图2021是显示各通过肝素层析及阳离子交换层析纯化的HPV16及18L1的中和活性的坐标图。3周间免疫接种3次纯化的L1蛋白。血清中的中和抗体效价通过基于S。
48、EAP的中和测定测量。X轴中，“对照”是仅用佐剂免疫接种的组；“肝素”是用通过肝素层析纯化的L1蛋白免疫接种的组；及“阳离子交换”是用通过阳离子交换层析纯化的L1蛋白免疫接种的组。Y轴是血清的稀释倍数。0105图22是显示具有低于MPL的细胞毒性TNF分泌的新佐剂CIA05的坐标图。0106图2324是显示依赖于新佐剂CIA05、HPV16L1VLP及氢氧化铝ALUM的各种浓度混合的抗体效价图23及其增加倍数图24的坐标图。空心棒是总IGG，灰色棒是IGG1及实心棒是IGG2A。0107图25是显示依赖于新的CIA05、HPV16L1VLP及氢氧化铝ALUM的各种浓度混合的从脾细胞的INF分泌。
49、水平的坐标图。灰色棒是用HPV16L1VLP处理2天的样品；实心棒是用HPV16L1VLP处理3天的样品。0108图2627是显示依赖于新的CIA05、HPV16/18L1VLP及氢氧化铝ALUM的各种浓度混合的总IGG效价分析结果的坐标图。图26是HPV16L1VLP的总IGG效价数据，图27是HPV18L1VLP的总IGG效价数据。0109图2829是显示依赖于新的CIA05、HPV16/18L1VLP及氢氧化铝ALUM的各种浓度混合的针对HPV16L1VLP的血清中IGG1效价图28及IGG2A效价图29的分析结果的坐标图。0110图30是显示依赖于新的CIA05、HPV16/18L1VLP及氢氧化铝ALUM的各种浓度混合的从脾细胞的INF分泌水平的坐标图。0111【实施方式】0112以下通过实施例更详细说明本发明。本领域技术人员明晰，这些实施例仅旨在更具体阐述本发明，本发明的范围将由随附的权利要求书确定，而不限于这些实施例。【实施例】0113【实施例116及18型人乳头瘤病毒VLPL1的蛋白表达及纯化】0114【产生16及18型HPVL1蛋白的重组酵母表达系统的构建】0115使用酵母酿酒酵母最佳密码子/表达，从序列表选择用于1。