L-亮氨酸的生产方法 本发明涉及发酵生产L-亮氨酸的方法。L-亮氨酸是一种对人和动物具有重要营养作用的氨基酸，用于药物、食品、饲料填加剂等。
对直接发酵生产L-亮氨酸，已知使用埃希氏菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属或节杆菌属的微生物的方法。关于培养埃希氏菌属的微生物生产L-亮氨酸的方法，例如，已知培养抗β-2-噻吩基丙氨酸的埃希氏菌属的微生物的方法(日本公开的未审查专利申请No.72695/81)。
关于培养抗亮氨酸类似物的微生物生产L-亮氨酸的方法，已知培养沙门氏菌属(Science 156，1107(1967)、节杆菌属(JP-A-125086/75和JP-A-220692/83)、棒杆菌属或短杆菌属(美国专利No.3,865,690)的微生物的方法。
从工业角度看，总要求生产L-亮氨酸的有效方法。
本发明提供一种L-亮氨酸的生产方法，包括在培养基中培养属于埃希氏菌属对亮氨酸类似物有抗性并具有产生L-亮氨酸能力的微生物，让L-亮氨酸在培养物中积累，并从中回收L-亮氨酸。
在本发明中，可以使用属于埃希氏菌属、对亮氨酸类似物有抗性并有产生L-亮氨酸能力的任何微生物。
用于本发明的亮氨酸类似物包括4-氮杂亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等。
用于本发明的适宜微生物可以这样得到：将属于埃希氏菌属的产L-亮氨酸微生物进行常规诱变，如用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理及X射线照射，将形成的微生物分布在含亮氨酸类似物的最小琼脂板培养基上，挑出在此最小琼脂培养上生长的菌落。
另外，可以对源自野生株并对亮氨酸类似物有抗性的突变株为提高L-亮氨酸产率进行诱变，从而得到适宜的微生物。
适宜地微生物还可以对具有亮氨酸类似物抗性的属于埃希氏菌属的L-缬氨酸产生菌进行上述诱变而得到。作为大肠杆菌的L-缬氨酸产生菌可提及大肠杆菌(Escherichia coli)H-9068。
用于本发明的适宜微生物的优选实例包括抗4-氮杂亮氨酸的大肠杆菌H-9070和抗5，5，5-三氟亮氨酸的大肠杆菌H-9072。
按照本发明，可以常规方式培养适当的微生物进行L-亮氨酸的生产。作为培养基，可使用任何合成的和天然的培养基，只要它含有适当的碳源、氮源、无机物和所用菌株需要的痕量其它营养物。
作为碳源，可使用碳水化合物如葡萄糖、果糖、乳糖糖蜜、纤维素水解物、粗糖水解物和淀物水解物；有机酸如丙酮酸、乙酸、富马酸、苹果酸和乳酸。另外，还可使用甘油、醇如乙酸等，只要它们可被所用菌株同化。
作为氮源，可使用氨；各种无机或有机铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；胺、蛋白胨、肉汤、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物、各种培养细胞和它们的消化产物等。
作为无机物，所使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养在通气条件下进行，如通气下摇动培养和搅拌培养，培养温度为20-40℃，优选28-37℃。培养基的PH保持在5-9范围内，优选中性左右。用碳酸钙、无机或有机酸、碱溶液、氨、PH缓冲剂等调节PH。
通常，培养1-7天后，L-亮氨酸在培养物中积累。
培养结束后，通过离心等除去沉淀如细胞，用离子交换处理、浓缩、盐析等结合，从上清液中回收L-亮氨酸。
下列实施例说明本发明的某些实施方案。
实施例1
制备对4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的突变株。
原养菌株大肠杆菌H-9068是从需要蛋氨酸和二氨基庚二酸的菌株大肠杆菌ATCC21530经回复突变自动产生的，将其用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(0.5mg/ml，33℃，30分钟)进行常规突变处理，然后分布在含1g/l 4-氮杂亮氨酸的最小琼脂板培养基上(0.5％葡萄糖、0.2％氯化铵、0.3％磷酸二氢钾、0.6％磷酸二钠、0.01硫酸镁、20mg/l氯化钙、2％琼脂，PH7.2)。在33℃培养2-5天后，挑出在此培养基上生长的大量菌落作为对4-氮杂亮氨酸有抗性的突变株，然后进行L-亮氨酸生产试验，以选择L-亮氨酸生产能力大于母菌株的菌株，频率为约10％。在这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的菌株称为大肠杆菌H-9070。
菌株H-9070已于1994年6月21日在布达佩斯条约下的日本National Institute of Bioscience and Human-TechnologyAgency of Industrial Science and Technology保藏，保藏号为FERM BP-4704。
重复上述方法，只是用0.3g/l的5，5，5-三氟亮氨酸代替1g/l的4-氮杂亮氨酸，挑出大量菌落作为抗5，5，5-三氟亮氨酸的突变株。在这些突变株中，得到频率约为10％的L-亮氨酸生产能力大于母菌株的菌株。这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的菌株称为大肠杆菌H-9072。
菌株H-9072已于1994年6月21日在布达佩斯条约下的日本National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency ofIndustrial Science and Technology保藏，保藏号为FERM BP-4706。
菌株H-9070和H-9072也已按中国专利法实施细则第25条的规定于1995年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏编号分别为CCTCC M95037和CCTCC M95038。
用以下方法比较突变菌株和母菌株抗4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸的程度。
将突变株和母菌株分别在天然琼脂板培养基(1％ tripton，0.5％酵母膏，1％氯化钠、2％琼脂pH7.2)上培养24小时。将所培养细胞悬浮在无菌水中，将细胞悬液铺在含表1和2所示量4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸的上述最小琼脂板培养基上，使细胞密度为约1×103细胞/cm2。在33℃培养72小时，观察生长程度。用生长程度来表达对4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸的抗性程度。结果示于表1和2中。H-9070和H-9072菌株分别高于母菌株H-9068对4-氮杂亮氨酸和5，5，5-三氟亮氨酸的抗性程度。 表1 菌株 4-氮杂亮氨酸的量(g/l) 0 0.5 1.0 H-9068 H-9070 + + - + - +
+：充分生长 -：不生长
表2 菌株 5，5，5-三氟亮氨酸的量(g/l) 0 0.1 0.3 H-9068 H-9072 + + - + - +
+：充分生长 -：不生长
实施例2
L-亮氨酸的生产试验
将实施例1中所得大肠杆菌H-9070和大肠杆菌H-9072以及母菌株大肠杆菌H-9068接种在300ml的Erlenmeyer烧瓶中的20ml种子培养基中(2％葡萄糖，1％蛋白胨，1％酵母膏，0.25％氯化钠，PH7.0)，在30℃摇动培养16小时。将形成的种子培养物(2ml)接种在2升Erlenmeyer烧瓶中的250ml发酵培养基中(6％葡萄糖、0.2％玉米膏、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、4％磷酸镁，1％碳酸钙，PH7.0)，在30℃摇动培养72小时。
培养结束后，用高效液相色谱测定所积累的L-亮氨酸的量。结果示于表3中。 表3 菌株 L-亮氨酸的量(g/l) H-9068 H-9070 H-9072 0.0 3.4 3.9
将培养菌株H-9070和H-9072所得发酵液各1升，在3000rpm下离心10分钟，从中除去细胞和其它杂质。将如此所得的各上清液通过用强酸性阳离子变换树脂DLALON(H+型，日本Mitsubishi Chemical Corporation的产品)填充的柱子，以吸附L-亮氨酸。用水洗涤柱子，用0.5N氨水洗脱，收集L-亮氨酸流份。浓缩所收集流份，向浓缩液中加入乙醇。将此混合物冷藏，分别从H-9070和H-9072菌株的发酵液中得到2.6g和3.0g纯度为98％或更高的L-亮氨酸结晶。