基因重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺 技术领域：本发明涉及一种生物工程、重组人源铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)的制备工艺。
超氧化物歧化酶(SOD)主要有抗衰老、抗炎症、防辐射、抗氧化等功能，可广泛应用于化妆品、保健品、食品、医疗等领域。
背景技术：目前，国内生产的SOD，主要从天然生物体中提取，其中，以动物血液提取SOD为主，由于血液制品提取的SOD，存在着外源性感染的危险性和非人源制品用于人体有抗原性，在医疗等领域很难发挥其应有的作用。从血液中提取SOD，原料来源有限，成本高、而且人血制品有外源性感染的危险性(如：肝炎病毒、爱滋病毒、支原体、衣原体等)。因此不易推广，难以形成批量生产。
发明内容：本发明目的是提供一种重组人源铜锌超氧化物歧化酶的制备工艺，本工艺原料充足、成本低、无外源性污染的危险性和免疫抗原性。而且生产的SOD活性半衰期长(水剂常温10天，水剂冷冻2年，冰干粉2、5-3年)。这样，应用领域可更加广泛。
基因重组人源铜锌SOD的制备工艺其技术方案特点是：挑取工程菌单菌落接种在含氨苄的LB培养基斜面培养，然后接种到含AMAP100μg/mlLB培养基的三角瓶中，30℃，180转/分振荡培养10小时，OD值达到1.0时，收集菌液；取菌液以1∶10的比例，接种到含有AMP100μg/ml的改良M9培养基的发酵罐中，30℃培养6小时，OD值达2.5-3.0时，迅速升温至42℃，热激诱导表达，然后在培养3-4小时，离心收集菌体，用0.9％的NaCl洗两次后，再用PH7.8TES缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下搅拌30分钟，加入稀释6倍的TES溶液冰浴条件下搅拌40分钟，离心取上清液，离心的菌体加TES溶液冷冻，取出速暖到冰水混合物状，加入稀释6倍数的TES溶液，搅拌40分钟，离心取上清液，将上述上清液经超滤浓缩，得粗酶液，粗酶液经透析，DEAE-Sephadex-A50离子交换柱层析，使其全部进入胶面，再用Sephadex-200分子筛柱层析，收集Cu、Zn-SOD活力部分。自动馏分收集器收集、冷冻、干燥。
目的蛋白以分泌性表达到细菌内膜、外膜之间的周质腔中，并且目的蛋白本身具有生物学活性，不需要进行体外变性，复性处理。因为渗透压法破坏了细胞外膜，所以，目的蛋白经缓冲液抽提，再经离子交换，分子筛柱层析就进一步得到纯化。
本发明与现有技术相比，由于基因重组人源铜锌SOD，半衰期长，因此，产品质量稳定，还有产量高，成本低、工艺简单等优点。
具体实施方式：
1、摇床培养：挑取工程菌(Cu、Zn-SOD/DH5α)地单菌落接种在含LB培养基(每升含：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，氨基苄100μg/ml，琼脂粉15g)进行斜面培养。然后转入填加AMP100μg/mlLB加培养基的三角瓶中，在30℃振荡培养10小时，OD值达到1、0时，收集菌液。
2、发酵缶培养：将上述培养的菌液以1∶10的比例，接种于含有改良M9培养基(配方：每升含K2HPO46g、KH2PO43g、(NH4)2SO41.5g、NaCl0.5g蛋白胨6g，酵母粉3g、1M MgSO4，葡萄糖10-20g，AMP100μg/ml、Cu2+0.5mM、Zn2+0.01mM)20L发酵缶中，在30℃进行发酵培养5-6小时，OD值达2.5-3.0，迅速升温42℃，热激诱导表达，通过升温，使阻遏蛋白失活，启动子开始启动，SOD蛋白基因开始表达SOD蛋白，再培养3-4小时，细菌生长到平衡期开始放罐，离心，得菌体500g。
3、目的蛋白粗提：取湿菌体500g，用0.9％的NaCl洗两次，然后用1000ml，PH7.8的TES缓冲液悬浮菌体(TES溶液配方：0.2M Tris.HCl，0.5mMEDTA，5M蔗糖)冰浴下搅拌30分钟后，加入稀释6倍的TES溶液化1500ml再悬浮菌体，12000转/分离心，取上清液，把菌体用于500mlTES溶液悬浮冷冻，取出速暖至冰水混合物状，再加入750ml稀释6倍的TES溶液，搅拌40分钟后，12000转/分离心，取上清液备用，再用稀释6倍TES溶液500ML悬浮，12000转/分离心取上清液，合并上清液共4250ml溶液。超滤浓缩至500ml溶液，此即为粗酶液
4、目的蛋白的精提：DEAE-Sephadex-A50离子交换柱层析。
(1)、粗蛋白在PH7.8层析用缓冲溶液10mMPBS(PBS缓冲液配方每升NaH2PO4，NaHPO4)以0.1mM EDTA置于10mMPBS溶液中，粗蛋白在溶液透析过液后，加到PBS平衡过的DEAE-Sephadex-A50柱上，样品全部进入胶面后，再用10mMPBS溶液进行梯度洗脱。收集目的蛋白峰溶液。
(2)、Sephadex-G200分子筛柱层析
收集DEAE-Sephadex-A50洗脱峰中含有Cu、Zn-SOD的酶液活力部分，用超滤器浓缩，在10mMPBS缓冲液中透析过也夜，样品上柱后用10mMPBS，PH7.8溶液洗脱，自动馏分收集器收集。经离子交换和分子筛柱层析分离后，Cu·Zn-SOD酶纯度可达95％以上，15％PAGE电泳可得单一条带。加入甘露醇即可冷冻干燥得冻干粉。目的蛋白获得率为6.4mg/g菌体，其比活性为1.025万μ/mg(邻苯三酚比色法测活)