结核杆菌CFP－10、ESAT－6与CD40L融合疫苗的制备及应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN02126719.7	申请日：	2002.07.14
公开号：	CN1467221A	公开日：	2004.01.14
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/195; A61K39/04; A61P31/06	主分类号：	C07K14/195; A61K39/04; A61P31/06
申请人：	王虹;
发明人：	王虹
地址：	510230广东省广州市海珠区东晓路雅敦街2号1503
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内容摘要

结核杆菌CFP－10、ESAT－6与CD40L融合疫苗的制备及应用其技术领域：生物医药基因重组疫苗CFP－10和ESAT－6是结核杆菌(MTB)感染宿主细胞后早期合成并分泌的两个小分子蛋白，也是致病性结核杆菌特有的成分。它们有T细胞表位，可以刺激产生T细胞免疫。CD40配体(CD40L)是主要分布于CD4+细胞上的免疫共刺激分子，具有刺激T、B淋巴细胞增殖和分化，增强免疫应答反应的作用，采用基因重组技术将CFP－10、ESAT－6基因与人CD40L基因连接成融合基因，并将融合基因克隆到自行构建的组成型分泌性甲醇酵母表达载体PGAP中。甲醇诱导并表达重组融合蛋白，液相色谱纯化重组融合蛋白。重组融合蛋白作为疫苗可用于结核杆菌感染的预防和治疗。

权利要求书

1： CFP-10和ESAT-6是致病性结核杆菌特有的成分。用基因重组技术将CFP-10和ESAT-6与免疫共刺激分子CD40配体(CD40L) 连接成为重组融合蛋白，并采用自行构建的组成型分泌性甲醇酵母表达系统表达。液相色谱法纯化重组融合蛋白。重组的CFP-10和 ESAT-6与CD40L的融合蛋白可作为预防性和治疗性疫苗用于结核杆菌感染的预防与防治。权利要求如下：
2：一种基因重组融合多肽，该多肽含有CFP-10、ESAT-6和CD40L 的主要氨基酸序列。
3：将CFP-10和ESAT-6分别与CD40L重组形成有多肽。
4：采用原核或真核细胞表达权利要求1和2所述的多肽。
5：一种结核杆菌感染防治方法，该方法应用权利要求1或2要求的多肽作为抗原或药物进行结核杆菌感染的防治。
6：采用重组技术对权利要求1或2的多肽进行增或减形成各种新的多肽。

说明书

结核杆菌CFP-10、ESAT-6与CD40L融合疫苗的制备及应用
(一)技术领域：生物医药基因重组疫苗(二)技术背景：培养上清滤过性蛋白(CFP-10)和早期分泌性抗原(ESAT-6)是结核杆菌(MTB)感染宿主细胞后早期合成并分泌的一组小分子蛋白中的其中两个主要蛋白，二者都是T细胞反应性抗原，主要刺激产生T细胞免疫反应。CFP-10和ESAT-6基因位于MTB基因组脱氧核糖核酸的同一个操纵子内，前后相连，其表达受控于同一个启动子和调节基因调控，因些，二者往往是平行表达。CFP-10和ESAT-6基因是致病性MTB特有的基因，卡介苗(BCG)及其它致病性分枝杆菌基因组没有这二个基因，以它们作为免疫原的疫苗可以弥补BCG的不足，并可作为治疗性疫苗在临床使用CD40配体(CD40L)是肿瘤坏死因子超家族的成员之一，全长261个氨基酸残基组成胞内区，胞外区和跨膜区等三个主要的功能区域，主要分在激活的T淋巴细胞，尤其是在CD4+T细胞中表达水平较高；其他一些免疫细胞，如嗜碱性细胞，肥大细胞和NK细胞中也有表达。CD40L具有刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，诱导B淋巴细胞分化。此外，它还作用于抗原递呈细胞(APC)，促进CD28、B7-1和B7-2等免疫共刺激分子的表达，提高APC的抗原递呈能力，增强免疫应答反应。(三)发明内容：采用基因重组技术将结核杆菌CFP-10和ESAT-6基因与CD40L cDNA基因连接形成融合基因，然后将融合基因克隆到自行构建的组成型分泌性甲醇酵母表达载体PGAP的克隆位点上，甲醇诱导表达，液相色谱法纯化重组融合蛋白。用重组融合蛋白的混合福氏免疫佐剂皮下接种人和动物，检测抗体产生的百分比和滴度，CD4+CD8+细胞计数验证重组蛋白的生物学活性。

细胞免疫是抗细胞内感染免疫的主要形式，此重组结核杆菌治疗性疫苗通过将二种MTB的T细胞抗原与CD40L的融合，能刺激机体产生抗MTB的细胞免疫，可以有效地抑制对BCG免疫产生耐受地MTB及其他致病性分枝杆菌感染。此外，CFP-10和ESAT-6融合抗原特异性高，不会引起非特异性免疫反应，可作为治疗性疫苗在临床应用。