一种功能性红曲菌快速固体培养方法 【技术领域】
本发明涉及一种功能性红曲菌快速固体培养方法。
背景技术
红曲米是我国的传统发酵产品，分为库曲，轻曲和色曲三大类，长期用于食品着色或酿酒。红曲在古代称为丹曲，较早的记载可追溯至唐朝后期陶谷撰写的《清异录》“以红曲煮肉”；至元、明代以后，有关红曲制备及应用的记载日渐增多，《本草纲目》、《本草从新》认为，红曲“甘温无毒”，“性温、味甘，具有活血化瘀、健脾消食之功效，主治淤滞腹痛、食积饱胀、跌打损伤等症”。值得一提的是，历代对于红曲酒，则记载有：“酿酒者，则辛热，有小毒”，如清代文献中，认为红曲酒“性热，不宜多饮”。至于红曲所酿成的酒性热，有小毒的说法，多年来一直是不解之谜。
1979年，日本远藤章从红色红曲菌(Monascus ruber)的培养液中发现为人体胆固醇合成关键酶抑制剂的活性物质，命名为Monacolin K(莫纳可林 K，也作Lovastatin，Mevinolin)；1981年香港Wang Hin-Chung等人发现粗萃取的红曲色素具有抗菌活性，当时将其命名为Monascidin A，但在1995年法国Blanc等人的研究发现其和Penicillium Citrinum所产生Citrinin(真菌毒素桔霉素)在吸收光谱、NMR、MS等分析方面具有相同的特征，被认定与Citrinin为同一物质，是一种具有神经毒性的次级代谢产物，它是一种肾毒素物质。此后，红曲菌功能性代谢产物的研究十分活跃，法国、日本、美国、荷兰及中国先后开展了研究，肯定了红曲及其相关产品中桔霉素的存在，并探讨了桔霉素的测定方法及部分影响因子。近年红曲产品在日本、法国等国家受到严格检验，明确从中国进口红曲，必须有安全生产菌种及产品不含桔霉素。因此，如何使红曲菌在产生色素和功能性代谢产物Monacolin K的同时抑制Monascidin A(Citrinin)的形成已成为一项重要课题，筛选不产生桔霉素或桔霉素产量极其微量的菌株，以及提高红曲色价和功能性代谢产物含量的菌株和相关工艺，成为国内外学者的研究热点。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种功能性红曲菌快速固体培养方法，使红曲菌在产生色素和功能性代谢产物Monacolin K的同时，抑制Monascidin A(Citrinin)地形成，产品不含桔霉素。
本发明的方法是建立一种变温、调湿及调控培养基料含水量的红曲菌菌丝体快速固体培养方法，在菌种培养袋或玻璃瓶装填培养基料中插入小通气管，通过调节培养室或塑膜温室送风量排风量或敞开式通风系统，在菌丝体生长对数期加大对菌种袋或瓶的通气量，达到变温、调湿及调控培养基料含水量的变化，抑制菌丝体生长对数期分泌淀粉酶的能力，降低对淀粉质培养基料液化糖化速率，使培养基料保持疏松，加速菌丝体生长速率及代谢产物Monacolin K的合成和积累。据分析检测，菌丝体培养周期在7d、14d、21d及28d时，红曲菌代谢产物Monacolin K含量分别达0.3％、0.9％、1.25％和1.6％，整个菌丝体培养周期未出现杂菌污染；所获得的功能性红曲未检测出桔霉素，极个别样品中桔霉素被检出含量极其微量(小于0.2ppm)。
本发明方法的具体步骤如下：
1、筛选不产生桔霉素或桔霉素产量极其微量的红曲菌菌株，包括红色红曲菌Monascus rubber vanTieghem、紫色红曲菌Monascus Purpureus Went、发白红曲菌Monascus albidus Sato、苍白红曲菌Monascus pallens Cannon，Abdullah and Abbas、佛罗里达红曲菌Monascus floridanus Cannon andBarnard、丛毛红曲菌Monascus pilosus Sato ex Hawksworth & pitt、烟色红曲菌Monascus fuliginosusSato；
2、淀粉质培养基料主要原料为大米(包括糙米)、麦粒(包括小麦、大麦)，培养基料配方为：大米10-96％、或麦粒10-96％，亦可添加麦麸4-30％，豆饼粉0.1-2％，无机盐0.01-0.5％，醋酸或醋酸盐0.01-0.8％，培养基料可以添加一种或一种以上；培养基料控制水分含量为25-95％，通常为35-45％；
3、大米、麦粒可先用水浸泡或直接加水煮熟或蒸熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐、醋酸或醋酸盐(溶于水后加入)，搅拌均匀；采用耐高温菌种袋或玻璃瓶装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管1至10条，辅助及加强菌丝体生长期间培养基料通气；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min或128℃灭菌20min，冷却至45℃以下；
4、小通气管采用可回收多次使用的竹管或不锈钢管或耐高温塑料管或陶瓷管；小通气管直径为4-12mm，通常为6-8mm；长度为100-350mm，通常为150-250mm；管壁排列有序或无序地钻有无数小孔，孔的大小为0.5-2mm，通常为1-1.2mm；
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用40％以上熟石灰水或饱和熟石灰水浸泡、干燥处理备用；
6、接种固体菌种或液体菌种，可采用散播法接种，促使接种后菌种多点萌发，使培养基料在极短时间布满红曲菌菌丝体，形成生长优势。接种量为1-15％，通常为3-6％；菌丝体培养温度16-34℃，通常为19-28℃；
7、在红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈；通过昼夜间调控培养室或塑膜温室送风量排风量及敞开式通风系统拉大昼夜间温差，调控昼间菌丝体培养温度为20-34℃，通常为24-27℃；相对湿度65-95％，通常为75-90％；夜间菌丝体培养温度为14-26℃，通常为16-23℃；相对湿度40-70％，通常为45-60％；实现昼夜之间培养环境温差变温及调湿的适应红曲菌生长和功能性代谢产物合成和积累的良好培养环境。
本发明涉及的无机盐为硫酸镁、碳酸钙、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾的一种或一种以上。
研究表明，菌种的筛选是提高功能性红曲色价、代谢产物Monacolin K含量及降低桔霉素产量的首要因素。红曲菌代谢产物Monacolin K的积累一般在菌丝体培养后期达到最高峰，由于传统工艺中红曲菌培养后期淀粉质培养基料被红曲菌分泌旺盛的淀粉酶液化出现培养基料通气环境恶化，杂菌伴随而生，桔霉素的形成在所难免。实验发现，红曲菌在生长对数期菌丝体细胞壁被液化糖化的高浓度、高渗透压的葡萄糖溶液浸润，菌丝体的生长代谢出现变态反应，代谢产物Monacolin K含量降低，次级代谢产物桔霉素产量显著增高。通过调节培养室或塑膜温室送风量排风量或敞开式通风系统，在菌丝体生长对数期加大对菌丝体生产环境的通气量，达到变温、调湿，调控培养基料含水量的变化，使培养基料保持疏松，加速菌丝体生长速率及功能性代谢产物Monacolin K的合成和积累。整个菌丝体培养周期未出现杂菌污染，所获得的功能性红曲未检测出桔霉素。具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
1、筛选不产生桔霉素的红色红曲菌Monascus rubber van Tieghem菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米90％，麦麸9.8％，豆饼粉0.1％，硫酸镁0.01％，碳酸钙0.07％，醋酸0.02％；培养基料控制水分含量为32-35％。
3、大米先用水浸泡2h，然后蒸熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐及醋酸(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用耐高温菌种袋装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管10条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用竹管；小通气管直径为10mm，长度为100mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为0.5mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用40％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为10％。菌丝体培养温度24℃。
7、在第3天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室送风量排风量通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度26℃，相对湿度85％；夜间菌丝体培养温度20℃，相对湿度45％。调控培养基料水分含量为30-32％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在7d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为0.3％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例二：
1、筛选桔霉素产量极其微量的紫色红曲菌Monascus Purpureus Went菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米80％，麦麸19％，豆饼粉1％，碳酸钙0.03％，磷酸二氢钾0.1％，醋酸0.08％；培养基料控制水分含量为40-45％。
3、大米先用水浸泡3h，然后蒸熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐及醋酸(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用耐高温菌种袋装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管3条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于128℃灭菌20min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用不锈钢管；小通气管直径为5mm，长度为150mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为1mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用饱和熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为3％，菌丝体培养温度为28℃。
7、在第4天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控培养室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度28℃，相对湿度90％；夜间菌丝体培养温度18℃，相对湿度50％。调控培养基料水分含量为35-40％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在14d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为0.9％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例三：
1、筛选桔霉素产量极其微量的发白红曲菌Monascus albidus Sato菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米50％，麦粒50％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.057％，醋酸钠0.1％，培养基料控制水分含量为40-43％。
3、大米、麦粒直接煮熟，添加无机盐及醋酸盐(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用玻璃瓶装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管8条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用陶瓷管；小通气管直径为12mm，长度为200mm，管壁排列无序钻有无数小孔，孔的大小为1.2mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用50％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种液体菌种，接种量为3％，菌丝体培养温度为20℃。
7、在第3天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度30℃，相对湿度95％；夜间菌丝体培养温度18℃，相对湿度53％。调控培养基料水分含量为36-42％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在28d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为1.6％，经检测，所获得的功能性红曲桔霉素被检出含量小于0.1ppm，未出现杂菌污染。
实施例四：
1、筛选不产生桔霉素的佛罗里达红曲菌Monascus flridanus Cannon and Barnard菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大麦90％，麦麸9.8％，豆饼粉0.2％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.02％，醋酸0.2％，培养基料控制水分含量为38-40％。
3、大麦先直接蒸熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐及醋酸(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用耐高温菌种袋装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管6条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于128℃灭菌20min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用竹管；小通气管直径为8mm，长度为200mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为1.5mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用40％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为5％，菌丝体培养温度为23℃。
7、在第3.5天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控培养室送风量及排风量通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度29℃，相对湿度95％；夜间菌丝体培养温度18℃，相对湿度50％。调控培养基料水分含量为35-38％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在21d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为1.25％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例五：
1、筛选不产生桔霉素的红色红曲菌Monascus rubber van Tieghem菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米98％，麦麸2％，豆饼粉0.1％，硫酸镁0.1％，醋酸0.08％；培养基料控制水分含量为42-43％。
3、大米直接煮熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐及醋酸(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用玻璃瓶装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管5条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用陶瓷管；小通气管直径为12mm，长度为230mm，管壁排列无序钻有无数小孔，孔的大小为0.8mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用40％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为1％，菌丝体培养温度为22℃。
7、在第5天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度30℃，相对湿度88％；夜间菌丝体培养温度20℃，相对湿度52％。调控培养基料水分含量为28-31％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在28d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为1.61％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例六：
1、筛选不产生桔霉素的紫色红曲菌Monascus Purpureus Went菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：糙米45％，大麦47％，麦麸8％，醋酸0.02％；培养基料控制水分含量为38-48％。
3、糙米、大麦先用水浸泡2h，然后蒸熟，添加麦麸、醋酸(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用耐高温菌种袋装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管8条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用竹管；小通气管直径为10mm，长度为100mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为0.5mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用60％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为12％，菌丝体培养温度为27℃。
7、在第2.5天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度26℃，相对湿度93％；夜间菌丝体培养温度20℃，相对湿度52％。调控培养基料水分含量为39-42％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在7d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为0.41％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例七：
1、筛选不产生桔霉素的红色红曲菌Monascus rubber van Tieghem菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米61％，麦粒39％，豆饼粉0.1％，碳酸钙0.1％，培养基料控制水分含量为55-60％。
3、大米、麦粒直接煮熟，添加豆饼粉、无机盐及醋酸盐(溶于水后加入)，调节水含量，搅拌均匀。采用玻璃瓶装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管2条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用耐高温塑料管；小通气管直径为6mm，长度为180mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为0.6mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用40％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为8％，菌丝体培养温度为25℃。
7、在第3天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度31℃，相对温度92％；夜间菌丝体培养温度25℃，相对湿度60％。调控培养基料水分含量为60-70％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在14d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为0.9％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例八：
1、筛选不产生桔霉素的紫色红曲菌Monascus Purpureus Went菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米96％，麦麸4％，碳酸钙0.07％，磷酸二氢钾0.15％，醋酸0.02％；培养基料控制水分含量为27-28％。
3、大米先用水浸泡1h，然后蒸熟，添加麦麸、无机盐及醋酸(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用耐高温菌种袋装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管7条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用陶瓷管；小通气管直径为12mm，长度为250mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为1.6mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用40％熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为2％，菌丝体培养温度为28℃。
7、在第4天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室敞开式通风系统，拉开昼夜间温差，昼间菌丝体培养温度25℃，相对湿度95％；夜间菌丝体培养温度18℃，相对湿度48％。调控培养基料水分含量为37-40％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在21d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为1.25％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例九：
1、筛选不产生桔霉素的红色红曲菌Monascus rubber van Tieghem菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：小麦96％，麦麸2％，豆饼粉2％，硫酸镁0.35％，醋酸钠0.01％，培养基料控制水分含量为44-45％。
3、小麦直接煮熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐及醋酸盐(溶于水后加入)，调节水分含量，搅拌均匀。采用玻璃瓶装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管4条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用不锈钢管；小通气管直径为8mm，长度为180mm，管壁排列无序钻有无数小孔，孔的大小为0.8mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用饱和熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种液体菌种，接种量为3％，菌丝体培养温度为26℃。
7、在第3天红曲菌菌丝体生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控培养室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间培菌丝体培养温度28℃，相对温度95％；夜间菌丝体培养温度19℃，相对温度60％。调控培养基料水分含量为40-50％。
8、红曲菌菌丝体培养周期在28d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为1.62％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。
实施例十：
1、筛选不产生桔霉素的红色红曲菌Monascus rubber van Tieghem菌株。
2、淀粉质培养基料原料配方：大米90％，麦麸8.8％，豆饼粉1.2％，磷酸二氢钾0.07％，磷酸氢二钾0.06％，醋酸0.01％，培养基料控制水分含量为80-88％。
3、大米先用水浸泡1h，然后蒸熟，添加麦麸、豆饼粉、无机盐及醋酸(溶于水后加入)，搅拌均匀。采用耐高温菌种袋装填培养基料，在装填培养基料后插入小通气管10条；培养基料装填后套塞特制双层通气棉塞，然后置于121℃灭菌30min，冷却至45℃以下。
4、小通气管采用竹管；小通气管直径为8mm，长度为200mm，管壁排列有序钻有无数小孔，孔的大小为1mm。
5、特制通气棉塞由三层纱布罩及棉塞组成，纱布用饱和熟石灰水浸泡、干燥处理备用。
6、接种固体菌种，采用散播法接种，将菌种粒用接种棒分散于培养基料中，接种量为5％，菌丝体培养温度为22℃。
7、在第4天红曲菌菌丝生长旺盛的生长对数期，除去特制通气棉塞的上层棉塞，并扎紧留下的三层纱布罩于瓶颈。通过调控塑膜温室敞开式通风系统，拉大昼夜间温差，昼间菌菌丝体培养温度27℃，相对湿度95％；夜间菌丝体培养温度20℃，相对湿度55％。调控培养基料水分含量为68-69％
8、红曲菌菌丝体培养周期在14d时，红曲菌中功能性成分Monacolin K含量为0.9％，经检测，所获得的功能性红曲菌未检测出桔霉素，未出现杂菌污染。