保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法.pdf

本发明公开一种保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法，通过增殖培养基的优选以及改善培养条件来达到，在玛咖组织培养过程中培养基采用MS、1/2MS，添加不同浓度的NNA和6-BA、改变蔗糖和琼脂的用量以及培养条件达到有效控制玛咖组培苗玻璃化现象，其步骤是：                                               ①玛咖无菌苗建立；②愈伤组织诱导；③丛生芽的增殖；④壮苗生根。本发明通过对激素浓度的优选，得到了适合玛咖增殖的最佳培养基与激素浓度配比，普遍提高了玛咖组培苗的增殖率，为组培苗正常、健康生长提供了有力的保证，玛咖组培苗玻璃化的比例趋向于0。

1.  一种保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法，其特征是依序包括以下步骤：
(1)玛咖无菌苗建立
取饱满玛咖种子，用水冲洗干净后用无菌水浸种6-8小时，用75%酒精消毒15-45秒，转入0.1%-1%升汞溶液中消毒8-12分钟，再用无菌水冲洗3-6遍；接种在MS培养基中，培养15-25天，待实生苗4片真叶长出，即得无菌苗；
(2)愈伤组织诱导
将上述带生长点的无菌苗接种在配方为MS+NAA0.2-0.5mg/L+6-BA1.0-2.0mg/L+琼脂5-8g/L+蔗糖20-40g/L，pH=5.8-6.2的诱导培养基中；接种深度0.3-0.5厘米，白天培养温度18-22℃，光照强度为1500-2000Lx，光照时间为8-12小时，夜间温度为14-16℃；培养20-30天，即得愈伤组织；
(3)丛生芽增殖
将长势良好的愈伤组织接种于增殖培养基中，所述的丛生芽增殖培养基为:MS+NAA0.2-1.0mg/L+6-BA2.0-3.0mg/L+琼脂5-8g/L+蔗糖20-40g/L，pH=5.8-6.2；在培养生长周期的过程中，白天培养温度20-24℃，光照强度为1800-2500Lx，光照时间为10-12小时；夜间温度为16-18℃；培养30-40天，得丛生芽；
(4)壮苗生根
将丛生芽在生根培养基中进行生根培养，形成生根的小植株，其生根培养基为1/2MS；生根培养基中附加0.2—0.5mg/L的NAA和1-2g/L的活性炭；培养15-25天。

2.  根据权利要求1所述的一种保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法，步骤（2）所述的愈伤组织诱导培养基为:MS+NAA0.3mg/L+6-BA1.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖40g/L，pH=6.0。

3.  根据权利要求1所述的一种保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法，步骤（3）所述的丛生芽增殖培养基为:MS+NAA0.5mg/L+6-BA2.5mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=6.0。

保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法。
背景技术
玛咖主产于南美洲秘鲁海拔3500-4000米的安弟斯高原，属十字花科独行菜属一年生草本植物，是一种珍稀高山药食两用植物，不仅含有丰富的蛋白质、人体必需氨基酸、多种矿物质（K、Ca、Fe、Zn）和多种维生素（VB₁、VB₂、VC）等营养物质，而且含有玛咖生物碱、芥子油苷与甾醇类等次生代谢活性成分。大量研究表明玛咖具有提高生育力、改善性功能、调节内分泌、增强免疫力、抗氧化、抗压力、抗疲劳和抗癌的作用，并对风湿症、呼吸疾病、抑郁症、贫血症等有很好的治疗效果。现云南省大理、丽江、迪庆等多个地方已成功引种。但繁殖中存在种子价格高，种性易退化，品种混杂等瓶颈。通过植物组织培养可纯化玛咖良种特性，避免种性退化，可在短期内提供大量的优良无性系种苗和繁殖材料。
在玛咖组培苗培养过程中易出现玻璃化苗，导致组培苗的畸形、病态、降低了苗的质量和增殖率。由于玻璃苗不能移栽成活，因此玛咖组培苗玻璃化控制的方法成为提高组培苗成活率、控制生产成本的关键问题之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种保健药材玛咖组培苗玻璃化控制的方法，以提高组培苗的增殖率和成活率。本发明的目的通过增殖培养基的优选以及改善培养条件来达到，在玛咖组织培养过程中培养基采用MS、1/2MS，添加不同浓度的NNA和6-BA、改变蔗糖和琼脂的用量以及培养条件达到有效控制玛咖组培苗玻璃化现象，依序包括以下步骤：
1、玛咖无菌苗建立
取饱满玛咖种子，用水冲洗干净后用无菌水浸种6-8小时，用75%酒精消毒15-45秒，转入0.1%-1%升汞溶液中消毒8-12分钟，再用无菌水冲洗3-6遍；接种在MS培养基（基本培养基）中，培养15-25天，待实生苗4片真叶长出，即得无菌苗。
2、愈伤组织诱导
将上述带生长点的健康无菌苗接种在配方为MS+NAA（萘乙酸）0.2-0.5mg/L+6-BA（6-苄基氨基嘌呤）1.0-2.0mg/L+琼脂5-8g/L+蔗糖20-40g/L，pH=5.8-6.2的愈伤组织诱导培养基中；接种深度0.3-0.5厘米，白天培养温度18-22℃，光照强度为1500-2000Lx，光照时间为8-12小时，夜间温度为14-16℃；培养20-30天，得愈伤组织。
3、丛生芽增殖
将长势良好的愈伤组织接种于增殖培养基中，所述的增殖培养基为:MS+NAA0.2-1.0mg/L+6-BA2.0-3.0mg/L+琼脂5-8g/L+蔗糖20-40g/L，pH=5.8-6.2；在培养生长周期的过程中，白天培养温度20-24℃，光照强度为1800-2500Lx，光照时间为10-12小时；夜间温度为16-18℃；培养30-40天，得丛生芽。
4、壮苗生根；
将丛生芽在生根培养基中进行生根培养，形成生根的小植株，其生根培养基为1/2MS；生根培养基中附加0.2-0.5mg/L的NAA和1-2g/L的活性炭；培养15-25天。
优选的是，步骤（2）所述的愈伤组织诱导培养基为:MS+NAA0.3mg/L+6-BA1.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖40g/L，pH=6.0。
优选的是，步骤（3）所述的丛生芽增殖培养基为:MS+NAA0.5mg/L+6-BA2.5mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=6.0。
本发明的有益效果包括以下几点：
通过对激素浓度的优选，得到了适合玛咖增殖的最佳培养基与激素浓度配比，普遍提高了玛咖组培苗的增殖率，为组培苗正常、健康生长提供了有力的保证。
本发明通过蔗糖和琼脂浓度的变化以及改善培养条件，优越性在于方法简便、可靠，有效降低了玛咖组培过程中玻璃化现象的发生，玛咖组培苗玻璃化的比例趋向于0。
具体实施方式
实施例1
取MS培养基，按每升添加蔗糖20g和琼脂8g，同时调节pH=6.2，作为基本培养基，取1/2MS培养基，按每升添加蔗糖20g和琼脂8g，同时调节pH=6.2，作为1/2MS培养基；取饱满玛咖种子，用水冲洗干净后用无菌水浸种8小时，用75%酒精消毒45秒，转入1%升汞中消毒8分钟，再用无菌水冲洗6遍。接种在MS培养基中，培养温度20℃，光照强度为1500Lx，光照时间为10小时，培养18天，待实生苗4片真叶长出，得无菌苗；
在基本MS培养基中按每升添加NAA0.5mg、6-BA2.0mg，在超净工作台上，剪取4片真叶的带生长点的无菌苗接种到该培养基中，接种时将茎段下端插入培养基中，深度为0.3厘米，白天培养温度20℃，光照强度为1500Lx，光照时间为8小时；夜间温度为14℃；培养30天得到愈伤组织；
在基本MS培养基中按每升添加NAA0.2mg、6-BA3.0mg，在超净工作台上，剪取2厘米长势良好的愈伤组织接种到该培养基中，白天培养温度22℃，光照强度为2200Lx，光照时间为12小时，夜间温度为16℃，培养35天得到丛生芽簇；
在1/2MS培养基中按每升添加NAA0.5mg、活性炭2g，在超净工作台上，将丛生芽簇切分成单株接种到该培养基中，接种时将茎段下端插入培养基中，深度为0.5厘米，白天培养温度22℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12小时；经过20天的培养生根，至此发育成完整植物。将丛生芽簇进行3次继代培养，增殖倍数达到8倍以上且无玻璃化现象。
实施例2
取MS培养基，按每升添加蔗糖30g和琼脂7g，同时调节pH=6.0，作为基本培养基，取1/2MS培养基，按每升添加蔗糖30g和琼脂7g，同时调节pH=6.0，作为1/2MS培养基；取饱满玛咖种子，用水冲洗干净后用无菌水浸种7小时，用75%酒精消毒30秒，在转入0.1%升汞中消毒12分钟，再用无菌水冲洗5遍。接种在MS培养基中，培养温度20℃，光照强度为1500Lx，光照时间为10小时，培养18天，待实生苗4片真叶长出，得无菌苗；
在基本MS培养基中按每升添加NAA0.2mg、6-BA1.0mg，在超净工作台上，剪取4片真叶的带生长点的无菌苗接种到该培养基中，接种时将茎段下端插入培养基中，深度为0.4厘米，白天培养温度22℃，光照强度为1800Lx，光照时间为10小时；夜间温度为15℃；培养25天得到愈伤组织；
在基本MS培养基中按每升添加NAA0.5mg、6-BA2.0mg，在超净工作台上，剪取1厘米长势良好的愈伤组织接种到该培养基中，白天培养温度22℃，光照强度为2500Lx，光照时间为10小时，夜间温度为16℃，培养40天得到丛生芽簇；
在1/2MS培养基中按每升添加NAA0.2mg、活性炭1g，在超净工作台上，将丛生芽簇切分成单株接种到该培养基中，接种时将茎段下端插入培养基中，深度为0.4厘米，白天培养温度22℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12小时；经过20天的培养生根，至此发育成完整植物。将丛生芽簇进行3次继代培养，增殖倍数达到8倍以上且无玻璃化现象。
实施例3
取MS培养基，按每升添加蔗糖40g和琼脂6g，同时调节pH=5.8，作为基本培养基，取1/2MS培养基，按每升添加蔗糖40g和琼脂6g，同时调节pH=5.8，作为1/2MS培养基；取饱满玛咖种子，用水冲洗干净后用无菌水浸种6小时，用75%酒精消毒30秒，在转入0.5%升汞中消毒10分钟，再用无菌水冲洗4遍。接种在MS培养基中，培养温度20℃，光照强度为1500Lx，光照时间为10小时，培养18天，待实生苗4片真叶长出，得无菌苗；
在基本MS培养基中按每升添加NAA0.3mg、6-BA1.5mg，在超净工作台上，剪取4片真叶的带生长点的无菌苗接种到该培养基中，接种时将茎段下端插入培养基中，深度为0.5厘米，白天培养温度18℃，光照强度为1600Lx，光照时间为9小时，夜间温度为16℃，培养30天得到愈伤组织；
在基本MS培养基中按每升添加NAA0.5mg、6-BA2.5mg，在超净工作台上，剪取1.5厘米长势良好的愈伤组织接种到该培养基中，白天培养温度23℃，光照强度为2300Lx，光照时间为11小时，夜间温度为18℃，培养35天得到丛生芽簇；
在1/2MS培养基中按每升添加NAA0.3mg、活性炭1.5g，在超净工作台上，将丛生芽簇切分成单株接种到该培养基中，接种时将茎段下端插入培养基中，深度为0.3厘米，白天培养温度22℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12小时；经过20天的培养生根，至此发育成完整植物。将丛生芽簇进行3次继代培养，增殖倍数达到8倍以上且无玻璃化现象。