透明质酸凝胶及其制备方法，以及含有该 透明质酸凝胶的医用材料 【技术领域】
本发明涉及新颖的透明质酸凝胶及其制备方法，更特别涉及含有该透明质酸凝胶的适用于生体的良好的医用材料。
背景技术
透明质酸是β-D-N-乙酰葡糖胺和β-D-葡糖醛酸互相连结而成的直链状高分子多糖。透明质酸除了分布在哺乳动物的结缔组织之外，还分布在鸡的鸡冠中及链球菌的荚膜等处。除了将鸡的鸡冠和脐带作为提取材料使用之外，还可由链球菌的培养物调制出精制品。
从分子量看，天然透明质酸具有多分散性，不具备种及脏器的特异性，即使移植或注入生体中，也显现出良好的生体适应性。另外，由于适用于生体的透明质酸本身的易溶于水的缺陷，在生体内的滞留时间较短，这样就提出了多种多样的透明质酸的化学修饰物。
其中的代表例是以二乙烯基砜、二环氧化物和甲醛等二官能性试剂为交联剂制得的具有高溶胀性的交联透明质酸凝胶(参考美国专利第4,582,865号说明书，日本专利公报平6-37575号、日本专利公开公报平7-97401号、日本专利公开公报昭60-130601号)。
此外，揭示了利用透明质酸地四丁基铵盐溶于二甲基亚砜等有机溶剂这一特征的透明质酸的化学修饰法(日本专利公开公报平3-105003号)。还揭示了在二甲基亚砜中，加入三乙胺和碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓使透明质酸的四丁基铵盐反应，在透明质酸的羧基和羟基间形成酯键的方法(欧洲专利0341745A1)。
作为不使用可形成共价键的化学试剂而使透明质酸不溶于水的方法，揭示了使透明质酸和具有氨基或亚氨基的高分子化合物结合，让透明质酸的羧基和高分子化合物的氨基或亚氨基形成离子复合体来调制透明质酸高分子复合体的方法(参考日本专利公开公报平6-73103号)。
如果将透明质酸水溶液的pH值调整在酸性，如2.0～2.7的范围内，则可形成被称为聚集凝胶的冻胶状固化态凝胶，如果pH小于2.0，则不能形成聚集凝胶。
这种聚集凝胶投入中性水溶液中后，迅速溶解，所以，它与本发明中的所谓透明质酸凝胶是不同的。
此外，还揭示了在pH2.0～3.8、20～80重量％的水溶性有机溶剂存在下，由透明质酸水溶液制备透明质酸凝胶的方法(参考日本专利公开公报平5-58881号)。但是，该公报中还记载了利用上述制备方法获得的透明质酸凝胶在不加涂膜的情况下投入水中也会溶解的事实。
还提出了一般由高分子水溶液，通过反复的冷冻、解冻操作制备高分子凝胶的方法。其代表例包括聚乙烯醇和葡糖甘露聚糖(参考日本专利公开公报昭57-190072号、日本专利公开公报平5-161459号)。
但是，对透明质酸和包含透明质酸的生体样品进行精制或保存时，冷冻、解冻和冷冻干燥已作为一般方法被经常采用，由于通常都在中性条件下进行，所以目前还未出现利用上述方法形成透明质酸凝胶的报告。
透明质酸具有极高的粘着性和保湿性，本质上无抗原性，生体适应性很高，所以被用于变形性膝关节病的治疗药物和眼科手术助剂等。
此外，还对透明质酸溶液作为术后防粘连剂的情况进行了探讨。由于其在生体内的滞留性较短，所以效果较弱，又由于它的水溶性，所以在短时间内就会从创面扩散流动开来(Journal of Gynecologic Surgery vol.7 No.2 97-101(1991))。
还开发了以特表平5-508161号、特表平6-508169号为基础，利用碳化二亚胺类使羧甲基纤维素和透明质酸钠(sodium hyaluronate)进行交联、修饰而获得的薄膜状防粘连剂“Seprafilm”(Genzyme公司生产)。
可最大限度地利用透明质酸本身具有的良好生体适应性，不使用任何化学交联剂和化学修饰剂，也不与阳离子性高分子形成复合体，而可作为生体适应性医用材料使用的在生体内滞留时间较长的透明质酸凝胶尚未开发出来。
本发明者们为达到上述目的，对透明质酸本身的物理化学性质进行了认真探讨。其结果发现，将透明质酸水溶液的pH调整到特定值，对该水溶液进行至少1次的冷冻和解冻就可制得透明质酸凝胶。另外还发现，所得透明质酸凝胶在水中的溶解速度极慢。
利用传统方法制备改质透明质酸时，不论经过怎样的努力都必须使用化学反应性物质，这样就存在通过新的改质使透明质酸本身肯定带有毒性和生体不适应性等不良性能的问题。
例如，通过使用了化学修饰交联和金属盐等的离子的方法制得的透明质酸防粘连剂，即使其在生体内的滞留性等得到了改善，但改质后的透明质酸分子中以共价键和离子键的形式包含交联剂和金属等，这样已经与天然透明质酸的结构有所不同，更难说其生理作用和生体适应性，包含毒性在内的安全性等在本质上与透明质酸相同。而且，还很难完全避免交联剂等的残留毒性，包含在生体内的分解产物中的交联剂的安全性问题。
发明的揭示
本发明者们发现本发明的透明质酸凝胶作为医用材料具有理想的生体适应性和滞留性，特别是作为防粘连剂具有理想的生体适应性和滞留性，对术后粘连具有显著的抑制作用，从而完成了本发明。
即，本发明的医用材料具有以下12个特征：(1)凝胶仅由以难溶于中性水溶液为特征的透明质酸形成；(2)以在25℃的中性水溶液中形态可保持1天以上为特征的(1)记载的透明质酸凝胶；(3)以在25℃的中性水溶液中1天的溶解率在50％以下为特征的(1)记载的透明质酸凝胶；(4)以在37℃的中性水溶液中12小时的溶解率在50％以下为特征的(1)记载的透明质酸凝胶；(5)以在透明质酸的酸促进水解条件下对透明质酸凝胶进行处理而获得的增溶透明质酸具有支化结构，该增溶透明质酸中部分包含支化系数在0.5以上的分子量部分为特征的(1)记载的透明质酸凝胶；(6)以将透明质酸的pH在3.5以下的水溶液冷冻，然后解冻而形成为特征的(1)记载的透明质酸凝胶；(7)以将透明质酸水溶液的pH调整到3.5以下，至少对其进行1次冷冻、解冻为特征的(6)记载的透明质酸凝胶的制备方法；(8)以含有仅用同时满足条件(a)和(b)的透明质酸形成的凝胶为特征的医用材料，(a)在25℃的中性水溶液中的1天的溶解率低于50％，(b)在透明质酸的酸促进水解条件下对透明质酸凝胶进行处理而获得的增溶透明质酸具有支化结构，增溶透明质酸中部分包含支化系数在0.5以上的分子量部分；(9)以仅用透明质酸形成的凝胶的形状为选自片状、薄膜状、粉碎状、海绵状、块状、纤维状或管状中的至少1种为特征的(8)记载的医用材料；(10)包含在25℃的中性水溶液中的1天的溶解率低于50％、在透明质酸的酸促进水解条件下对透明质酸凝胶进行处理而获得的增溶透明质酸具有支化结构、增溶透明质酸中部分包含支化系数在0.5以上的分子量部分的透明质酸凝胶，以及未凝胶化的透明质酸的医用材料；(11)包含仅由透明质酸形成的片状、薄膜状、粉碎状、海绵状、块状、纤维状或管状的透明质酸凝胶，以及未凝胶化的透明质酸的医用材料；(12)以医用材料为防粘连剂作为特征的(8)～(11)的任一项记载的医用材料。
对附图的简单说明
图1是实施例8和比较例6的GPC色谱图和各部分分子量的对比图。
图2是利用比较例6的直链状透明质酸算出的实施例8的支化系数和分子量的关系图。
实施发明的最佳状态
以下，对本发明进行详细说明。
用于本发明的透明质酸可以从动物组织中提取，也可以是利用发酵法制得的产物，其来源不必细究。
发酵法所用的菌株最好是从自然界分离出的链球菌属等具有透明质酸生产能力的微生物，或日本专利公开公报昭63-123392号记载的马链球菌FM-100(微工研菌寄第9027号)、日本专利公开公报平-234689号记载的马链球菌FM-300(微工研菌寄第2319号)等能够以高收率稳定地产生透明质酸的变异菌株。可使用对上述变异菌株进行培养和精制后的产物。
所谓凝胶在新版高分子辞典(朝仓书店，昭和63年)中被定义为“具有不溶于所有溶剂的三维网眼结构的高分子及其溶胀体”。在理化学辞典(岩波书店，第4版，昭和62年)中被定义为“溶胶(胶体溶液)固化成的冻胶状物质”。
本发明的透明质酸凝胶的特征是难溶于中性水溶液，将该透明质酸凝胶投入中性水溶液，与非凝胶化透明质酸相比，显现出明显的难溶性。难溶性根据在25℃的中性水溶液中凝胶形态的保持和凝胶的溶解率，以及在37℃的中性水溶液中的凝胶溶解率定义。这里的中性水溶液是指具有将pH调整为7的有缓冲能力的生理盐水。
本发明的透明质酸凝胶还具有投入碱性水溶液，例如pH11的碱性缓冲水溶液中会快速溶解的特征。
本发明的透明质酸凝胶是具有三维网眼结构的高分子及其溶胀体。三维网眼结构由透明质酸的交联结构形成。
本发明的透明质酸凝胶通过在透明质酸的酸促进水解反应条件下，对透明质酸凝胶进行分解和增溶处理而获得。增溶透明质酸在保持交联结构时，作为具有支化点的透明质酸，根据高分子溶液的理论能够与直链状透明质酸相区别。透明质酸本身是直链状高分子，并不具备支化结构(多糖生化学1，化学编，共立出版，昭和44年)。
本发明的透明质酸的酸促进水解反应条件是水溶液的pH为1.5、温度为60℃。众所周知，酸性和碱性水溶液比中性水溶液更能够促进通过透明质酸的糖苷键的水解而进行的主链断裂反应(Eur.Polym.J.Vol32，No8，p1011-1014，1996)。而且，反应温度越高越对酸水解反应有利。
本发明的透明质酸凝胶的酸促进水解的反应时间由透明质酸凝胶的结构，例如，原料透明质酸的分子量和分子量分布，交联度决定。
可选择增溶透明质酸的比例较大、支化系数较大的反应条件。反应条件较弱时，增溶透明质酸的比例较小。相反反应条件较强时，增溶透明质酸的分子量明显减小，所以，难以测定支化系数，而且，支化点本身分解的可能性增大。
反应条件最好可将反应时间控制在目视可确认透明质酸凝胶几乎消失，或增溶透明质酸的比例在50％以上的程度。
增溶透明质酸的分子量和支化系数的测定方法包括使用所用检测器为差示折射率计的凝胶渗透色谱法(GPC)和多角度激光散射检测器(MALLS)的GPC-MALLS法，使用所用检测器为差示折射率计的GPC和小角度激光散射检测器(LALLS)的GPC-LALLS法，或使用所用检测器为差示折射率计的GPC和粘度计的GPC-粘度法。
本发明中，使用GPC-MALLS法对利用GPC分离出的各分子量部分的分子量和支化系数进行在线连续测定。GPC-MALLS法能够对利用GPC分离出的各部分的分子量和惯性半径进行连续测定。GPC-MALLS法包括比较增溶透明的各部分分子量和惯性半径的关系及作为对照的直链状透明质酸的各部分的分子量和惯性半径的关系算出支化系数的惯性半径法，以及比较相同洗脱体积的部分的增溶透明质酸的分子量和作为对照的直链状透明质酸的分子量算出支化系数的洗脱体积法。
本发明中，采用洗脱体积法对支化系数进行了测定。支化系数是指对应于1个增溶透明质酸高分子链而存在的支化点数，对应于增溶透明质酸的分子量作图。
使用有限浓度的齐姆图(1)式，由散射角0°的外插值可算出各部分的分子量，由依赖角度的初期梯度可算出惯性半径，所用计算式如下：KcR(θ)=1MP(θ)+2A2c+......---(1)]]>
P(θ)-1＝1+1/3.k2<S2>+……k=4πλsin(θ/2)]]>
这里，M为分子量，<S2>为惯性半径2次方的平均值，K为光学常数，R(θ)为散射角θ的过剩还原散射强度，c为高分子浓度，P(θ)为粒子散射函数，λ为溶液中的激光波长，A2为第2维里系数，透明质酸的维里系数为0.002ml·mol/g2。采用透明质酸水溶液的折射率的浓度梯度(dn/dc：0.153ml/g)，由差示折射率计的输出可算出c值。
利用GPC-MALLS法，由过剩还原散射强度可算出分子量和惯性半径2次方的平均值，测定精度依赖于过剩还原散射强度的大小。利用(1)式，过剩还原散射强度成为浓度和分子量的函数。试样浓度和注入量由试样分子量决定。在选择区别各分子量部分的GPC柱时，在不对GPC柱产生浓度负荷的范围内，选择最大试样浓度和注入量。
利用以下的(2)式通过洗脱体积法计算各部分的支化系数。相同洗脱体积的部分，如支化高分子的分子量为Mb，直链高分子的分子量为M1，求出收缩因子g。
g＝(M1/Mb)(a+1)/e (2)
这里，a为Mark-Houwink常数，透明质酸的前述常数为0.78，e为穿流因子，计为1.0。
假定4官能性长链无序支化，则由(3)式可算出1个高分子链上的支化点数B(支化系数)。g=1[[1+B6]0.5[4B3π]]0.5---(3)]]>
利用洗脱体积法计算支化系数的方法和利用GPC-LALLS法测定支化系数的方法相同，具体情况记载于Size Exclusion Chromatography(共立出版，平成3年)。
用GPC溶剂稀释增溶透明质酸以调整浓度，再用0.2μm的膜滤器过滤后供测定用。
本发明的透明质酸凝胶具有即使在透明质酸的酸促进水解反应条件下也稳定存在的交联结构时，增溶透明质酸的支化结构可通过高分子溶液理论确认。
本发明中，仅用透明质酸是指除了透明质酸之外，不使用化学交联剂和化学修饰剂，而且未与阳离子性高分子形成复合体。
透明质酸的化学交联剂是指与透明质酸的羧基、羟基、乙酰胺基反应形成共价键的多价化合物，其例子包括聚缩水甘油醚等多价环氧化合物、二乙烯基砜、甲醛、磷酰氯、并用碳二亚胺化合物和氨基酸酯、并用碳二亚胺化合物和二酰肼(dihydrazide)化合物。透明质酸通过与化学交联剂的反应形成了三维网眼结构。
透明质酸的化学修饰剂是指与透明质酸的羧基、羟基和乙酰胺基反应形成共价键的化合物，其例子包括并用乙酸酐和浓硫酸、并用三氟乙酸酐和有机酸、使用碘化烷基化合物。这些化合物可使透明质酸的亲水性基团疏水化，减弱透明质酸的水溶性。
与透明质酸形成复合体的阳离子性高分子是指可在透明质酸的羧基和高分子化合物的氨基或亚氨基间形成离子复合体的高分子，包括脱乙酰壳多糖、聚赖氨酸、聚乙烯基吡啶、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯。通过形成透明质酸和阳离子性高分子的复合体可使透明质酸不溶于水。
另外，与透明质酸导入交联结构，透明质酸的不溶化，难溶化无直接关系的物质，可在形成本发明的透明质酸凝胶时添加。混合透明质酸和与其具有同样生体适应性的材料，例如，硫酸软骨素、羧甲基纤维素等，使它们复合化可形成透明质酸凝胶，对其无任何限定。
此外，在形成透明质酸凝胶时，可添加药学或生理学上的活性物质，形成包含这些物质的透明质酸凝胶，对其也无特别限定。
本发明所用的透明质酸的分子量最好在约1×105～1×107道尔顿的范围内。如果透明质酸是由分子量超过上述范围的高分子经过水解处理等而获得的低分子量物质，只要透明质酸的分子量在上述范围内也可使用。
本发明的透明质酸的碱金属盐包括钠盐、钾盐和锂盐。
本发明所用的透明质酸水溶液通过混合搅拌透明质酸粉末和水而获得。透明质酸的浓度在5.0重量％以下时有利于获得水溶液。
使用分子量在2×106道尔顿以上的透明质酸时，其浓度最好在2.5重量％以下。
为调整透明质酸水溶液的pH而使用的酸只要是可将pH调整到3.5以下的酸即可，可使用任何酸。为减少酸的用量，最好使用强酸，如盐酸、硝酸、硫酸等。
透明质酸水溶液的pH值应调整到透明质酸的羧基有充分的比例质子化的程度。透明质酸浓度被无限稀释时，酸型透明质酸的解离平衡常数logK。＝4.25(Acta Chimica Hungarica-Models in Chemistry 129(5)671-683 1992)。调整的pH值由透明质酸盐的抗衡离子种类、透明质酸的分子量、水溶液浓度、冷冻及解冻的条件，以及生成的凝胶的强度等各种特性决定。本发明中，需要将pH调整到3.5以下，最好是在2.5以下。
将经过调整的透明质酸的酸性水溶液放入任何容器后，在规定温度使其冷冻，冷冻结束后，在规定温度解冻，至少操作1次。冷冻和解冻的温度及时间根据容器大小和水溶液量，在透明质酸的酸性水溶液的冷冻、解冻温度和时间范围内决定，一般，冷冻温度在冰点以下，解冻温度在冰点以上。
由于可缩短冷冻和解冻时间，所以，冷冻温度最好在-5℃以下的范围内选择，而解冻温度则在5℃以上的温度范围内选择。此外，所用时间只要在该温度下可完成冷冻和解冻即可，对其无特别限定。
冷冻经过调整的透明质酸的酸性水溶液，再解冻的操作的重复次数可根据所用透明质酸的分子量、水溶液浓度、水溶液的pH、冷冻和解冻温度及时间，以及生成的凝胶的强度等各种特性决定，通常较理想的是重复1次以上。
在重复进行冷冻和解冻操作时，每次的冷冻、解冻温度和时间可发生变化。
为了避免透明质酸的酸水解，通过调制成的透明质酸酸性水溶液的冷冻解冻制得的透明质酸凝胶必须除去调整酸性时所用的酸等组分。一般可通过水性溶剂的洗涤除去酸等组分。只要不破坏透明质酸凝胶的性能，对其无特别限定，例如，可使用水、生理盐水和磷酸缓冲液等，最好是使用生理盐水和磷酸缓冲液等。
此外，对洗涤方法也无特别限定，一般可采用分批洗涤法、过滤法、或将其填入柱子等中再通入洗涤液的方法等。洗涤条件中包括洗涤液量、洗涤次数等，只要可将需除去的组分浓度降低到目标浓度以下即可，可根据透明质酸凝胶的形态和用途作适当选择。
根据使用目的，经过洗涤的透明质酸凝胶可以浸泡在溶剂中的状态，包含溶剂的湿润状态，经过风干、减压干燥或冷冻干燥等处理的干燥状态作为医用材料使用。
在对透明质酸凝胶进行成型加工等时，通过选择经过调整的透明质酸酸性水溶液在冷冻时的容器和方法，可制成片状、薄膜状、粉碎状、海绵状、块状、纤维状和管状等所希望形态的透明质酸凝胶。例如，在板上浇铸再冷冻可制得薄膜状和片状凝胶，不与水混合而是在与有机溶剂剧烈混合搅拌的同时进行冷冻解冻可制得粉碎状凝胶。
制得透明质酸凝胶后的加工包括通过机械粉碎而形成微细粉碎状，通过压延薄膜化，纺丝等。另外，不进行特别的成型加工处理，而是通过选择适当的制作条件也能够获得具有理想形状的透明质酸凝胶。例如，通过对透明质酸浓度在0.1％以下，较好在0.05％以下的酸性溶液进行冷冻解冻，能够获得微细纤维片状的透明质酸凝胶。
本发明获得的透明质酸凝胶可用于一般的生体内分解性医用材料和使用透明质酸的领域，无特别限定。例如，可用于防粘连剂、药理活性物质的载体、创伤被覆剂、人工皮肤、组织置换型生体组织修复剂、关节注入剂、外科手术用缝合线、止血剂、人工脏器、人工细胞外基质或人工基底膜、诊断·治疗时所用的医疗仪器·医疗用具等生物医学制品或医药组合物。
透明质酸凝胶的各种成型加工品可以单一的形态使用，也可混合或并用不同形态的透明质酸凝胶，还可与未凝胶化的透明质酸混合或并用，以期获得更好的效果。
例如，并用作为腹腔内术后防粘连剂的片状透明质酸凝胶和透明质酸溶液可获得局部效果，以及整个腹腔内的效果。
作为关节注入剂混合粉碎状透明质酸凝胶和透明质酸溶液，可获得即时效果和延迟效果。
以下，对本发明获得的透明质酸凝胶作为医用材料的有用性，作为药理活性物质的缓释用载体的使用情况进行举例说明。
使本发明的透明质酸凝胶的结构中包含药理活性物质，凝胶就可作为使这种药理活性物质缓慢释放的载体使用。这种情况下，根据药理活性物质的种类、使用形态、使用部位和必要持续时间对以透明质酸凝胶的分解性为代表的性质和形状进行控制，能够以各种使用形态用于各种药理活性物质。
进行适当的制剂化，根据所要达到的目的，能够获得可缓慢释放药理活性物质的医药品制剂。缓释制剂的给药方法可经口、经皮、经粘膜、注射和体内埋植等。
以下，对本发明的防粘连剂进行说明。
本发明获得的透明质酸凝胶的防粘连剂可以片状、薄膜状、粉碎状、海绵状、块状、纤维状和管状等形态用于外科手术。使用形态中，薄膜状或片状凝胶最好直接贴在外科手术部位。微细粉碎状凝胶最好通过注射器涂布在外科手术部位。或者，以凝胶状或薄膜状通过腹腔镜涂布在手术部位。
在透明质酸酸性溶液中混合入生理活性物质后进行冷冻解冻，能够获得包含生理活性物质的透明质酸凝胶的防粘连剂。
透明质酸凝胶的防粘连剂适用于出现粘连的任何动物，能够防止哺乳动物，特别是人类的术后粘连。
生体内的给药部位包括腹腔、胸腔内的各种脏器，腱鞘，头盖，神经和眼球等，对于腹部手术、妇产科手术、胸部手术、肌腱和韧带等的整形外科手术、脑膜神经外科手术等均有用。
本发明获得的透明质酸凝胶的防粘连剂的给药时间是能够防止术后粘连的所有时间，可在手术中或手术结束时使用，最好是在手术临结束前使用。
在以下，利用实施例对本发明进行更为详细的说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
将分子量为2×106道尔顿的透明质酸钠溶于蒸馏水中，调制成1重量％的透明质酸水溶液，所得透明质酸水溶液的pH为6.0。用1N的盐酸将该水溶液的pH调整为1.5后，将15ml透明质酸的酸性水溶液加入到30ml的玻璃瓶中，并将其放置在温度为-20℃的冰箱中。放置16小时后，于25℃解冻。其结果是，获得海绵状透明质酸凝胶。
实施例2
除了将透明质酸浓度变为0.1重量％来调制透明质酸水溶液之外，其他操作与实施例1相同。其结果是，获得海绵状透明质酸凝胶。
实施例3
除了溶解分子量为6×105道尔顿的透明质酸钠来调制透明质酸水溶液之外，其他操作与实施例1相同，将上述水溶液放置在-20℃的冰箱中。冷冻6小时以上，再于25℃解冻2小时以上，这样反复5次。其结果是，获得海绵状透明质酸凝胶。
实施例4
除了将冷冻温度设定在-10℃，在其中放置77小时后，于25℃解冻之外，其他操作与实施例1相同。其结果是，获得海绵状透明质酸凝胶。
实施例5
除了由0.4重量％的透明质酸水溶液调制pH为2.5的透明质酸的酸性水溶液，将15ml该透明质酸的酸性水溶液加入30ml玻璃瓶中，并将其放置在-20℃的冰箱中，冷冻6小时以上，再于25℃解冻2小时以上，这样反复8次之外，其他操作与实施例1相同。其结果是，获得了部分呈海绵状的透明质酸凝胶。
比较例1
除了不调整透明质酸水溶液的pH，反复冷冻解冻8次之外，其他操作与实施例1相同。其结果是，透明质酸水溶液无变化，即未凝胶化。
比较例2
使用实施例1调制而成的透明质酸水溶液，于60℃风干，获得厚度约为100μm的流延薄膜。将该流延薄膜用于透明质酸凝胶的溶解性试验。
比较例3
于-20℃冷冻实施例1调制而得的透明质酸水溶液，冷冻干燥后，获得海绵状透明质酸，将该海绵状透明质酸用于透明质酸凝胶的溶解性试验。
实施例6
透明质酸凝胶的溶解性试验
在生理盐水中加入浓度为50mM的磷酸缓冲成分，调制成pH为7的磷酸缓冲生理盐水。用蒸馏水洗涤上述实施例制得的海绵状透明质酸凝胶后，在滤纸上脱水。以对应于含有干燥重量为150mg的透明质酸的透明质酸凝胶，使用50ml磷酸缓冲生理盐水的比例，将透明质酸凝胶浸泡在磷酸缓冲生理盐水中。
同样，按照干燥重量150mg使用50ml磷酸缓冲生理盐水的比例，将比较例的透明质酸固形物浸泡在磷酸缓冲生理盐水中。
利用磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸浓度求出溶于25℃的磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸的比例。
这样，中性的25℃水溶液中的透明质酸凝胶的溶解性就可通过上述试验确定。
透明质酸浓度的测定
使用GPC，通过差示折射率检测器的峰面积求出磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸浓度。
利用以上方法，具体进行了实施例1～4的透明质酸凝胶及比较例2和3的透明质酸固形物的溶解性试验。其结果和目视观察透明质酸凝胶形态的结果如表1所示。
例如，对试验No.1的实施例1获得的透明质酸凝胶的溶解率进行测定时，1天的溶解率为3％，4天的溶解率为5％，7天的溶解率为6％。也就是说，即使经过7天，仍有94％的透明质酸凝胶残存，保持海绵状的形态。对应于此，对试验No.5的比较例2获得的厚度约为100μm的流延薄膜的溶解率进行测定时，1天的溶解率即为100％，完全溶解。4天和7天维持100％的溶解状态。
这样就可说明，比较例(试验No.5～6)所得的透明质酸固形物在水中的溶解速度极快，而本申请发明所得的透明质酸凝胶(例如，试验No.1～4)在水中的溶解速度极慢。
这就暗示本申请发明所得的透明质酸凝胶在生体内的滞留时间较长。
表1 试验 No. 透明质酸凝胶的溶解率(上行％)和形态(下行) 参考 1天后 4天后 7天后 14天后 1 3 海绵状 5 海绵状 6 海绵状 10 海绵状 实施例1 2 2 海绵状 4 海绵状 6 海绵状 15 海绵状 实施例2 3 9 海绵状 14 海绵状 28 海绵状 38 海绵状 实施例3 4 3 海绵状 5 海绵状 7 海绵状 11 海绵状 实施例4 5 100(完全溶解) 维持1天 后的状态 维持1天 后的状态 维持1天 后的状态 比较例2 6 100(完全溶解) 维持1天 后的状态 维持1天 后的状态 维持1天 后的状态 比较例3
比较例4
将分子量为2×106道尔顿的透明质酸钠粉末用于透明质酸凝胶的溶解性试验。
比较例5
将分子量为2×106道尔顿的透明质酸钠粉末加压成型，制得圆盘状颗粒。将该颗粒用于透明质酸凝胶的溶解性试验。
实施例7
透明质酸凝胶的溶解性试验
在生理盐水中加入浓度为50mM的磷酸缓冲成分，调制成pH为7的磷酸缓冲生理盐水。用蒸馏水洗涤上述实施例制得的海绵状透明质酸凝胶后，在滤纸上脱水。以对应于含有干燥重量为20mg的透明质酸的透明质酸凝胶，使用50ml磷酸缓冲生理盐水的比例，将透明质酸凝胶浸泡在磷酸缓冲生理盐水中。
同样，按照干燥重量20mg使用50ml磷酸缓冲生理盐水的比例，将比较例的透明质酸固形物浸泡在磷酸缓冲生理盐水中。
利用磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸浓度求出在37℃搅拌下的磷酸缓冲生理盐水中溶出的透明质酸的比例。
这样，中性的37℃水溶液中的透明质酸凝胶的溶解性就可通过上述试验确定。
按照以上方法，具体进行了实施例1～4的透明质酸凝胶及比较例2～5的透明质酸固形物的溶解性试验。其结果如表2所示。
表2 试验 No. 透明质酸凝胶的溶解率(％) 参考 6小时后 12小时后 24小时后 7 12 14 16 实施例1 8 12 16 19 实施例2 9 13 22 23 实施例3 10 12 15 18 实施例4 11 100(完全溶解) 维持6小时 后的状态 维持6小时 后的状态 比较例2 12 100(完全溶解) 维持6小时 后的状态 维持6小时 后的状态 比较例3 13 100(完全溶解) 维持6小时 后的状态 维持6小时 后的状态 比较例4 14 100(完全溶解) 维持6小时 后的状态 维持6小时 后的状态 比较例5
例如，对试验No.7的实施例1获得的透明质酸凝胶的溶解率进行测定时，12小时后的溶解率为14％，24小时后的溶解率为16％。也就是说，即使经过24小时，仍有84％的透明质酸凝胶残存。对应于此，对试验No.11的比较例2获得的厚度约为100μm的流延薄膜的溶解率进行测定时，6小时后的溶解率即为100％，完全溶解。
这样就可说明，比较例(试验No.11～14)所得的透明质酸固形物在水中的溶解速度极快，而本申请发明所得的透明质酸凝胶(例如，试验No.7～10)在水中的溶解速度极慢。这就暗示本申请发明所得的透明质酸凝胶在生体内的滞留时间较长。
实施例8
透明质酸凝胶的增溶试验
用盐酸将蒸馏水的pH调整到1.5。用蒸馏水洗涤实施例1所得的海绵状透明质酸凝胶后，将其浸泡在实施例6记载的磷酸缓冲生理盐水中，洗涤后再用蒸馏水洗净。将洗净的透明质酸凝胶冷冻干燥，并将包含干燥重量为15mg的透明质酸的透明质酸凝胶浸泡在pH1.5的水溶液15ml中。将该溶液放置在温度设定为60℃的烘箱中。分别在2小时后、6小时后、12小时后取样0.5ml。6小时后目视可确认的透明质酸凝胶几乎消失。
比较例6
将分子量为2×106道尔顿的透明质酸钠溶于蒸馏水中，调制成0.1重量％的透明质酸水溶液。用1N盐酸将上述水溶液的pH调整到1.5。将15ml透明质酸的酸性水溶液在60℃的烘箱中放置4小时，进行直链状透明质酸的酸水解。
实施例9
增溶透明质酸的分子量和支化系数的测定
用GPC溶剂将实施例8所得的增溶透明质酸和比较例6所得的直链状透明质酸的酸水解物稀释2倍，将浓度调整为0.05重量％，用0.2μm膜滤器过滤后，注入0.1ml进行GPC-MALLS的测定。
使用1根昭和电工株式会社生产的SB806HQ作为GPC柱，日本分光株式会社生产的830-RI作为差示折射率检测器，Wyatt公司生产的DAWNDSP-F进行MALLS，以硝酸钠的0.2M水溶液为溶剂，在测定温度为40℃、流速为0.3ml/分、获取数据间隔为1次/2秒的条件下进行测定。散射强度用散射角为21.7°～90°的8检测器测定。数据处理软件为Wyatt公司生产的ASTRA Version4.10。
如上所述，对实施例8的增溶透明质酸和比较例6所得的直链状透明质酸的酸水解物进行测定，其测定结果如表3所示。
表3 试验 No.反应时间 (小时)重均分子量分子量分布 Mw/Mn增溶率 (％) 参考 15 2 36.8万 1.8 28 实施例8 16 6 37.8万 2.4 86 实施例8 17 12 10.7万 1.8 97 实施例8 18 4 24.7万 1.6 比较例6
如试验No.15的实施例8所述，反应2小时后取样时，透明质酸凝胶的增溶率较小。试验No.17于反应12小时后取样时，分子量大幅度降低，支化系数测定较困难。试验No.16于反应6小时后取样时，透明质酸凝胶的增溶率较大，这说明存在具有支化点的透明质酸，分子量分布为2.4，也较大。
试验No.16的实施例8中，在反应6小时后取样的增溶透明质酸和试验No.18的比较例6所得的直链状透明质酸的酸水解物的GPC色谱图和支化系数的计算结果如图1和图2所示。
从图1可看出，实施例8的GPC色谱图1和比较例6的GPC色谱图2相比，前者在高分子量侧存在台肩。如果比较相同洗脱体积的部分的分子量，则实施例8与比较例6相比，前者于洗脱体积8.6ml以下、分子量约20万以上的区域内具有明显大的分子量。
由于实施例8存在支化点，所以与比较例6相比，相同洗脱体积的部分的分子量较大。
图2表示以比较例6为直链状透明质酸计算而得的实施例8的支化系数和分子量的关系。即，采用式(2)和式(3)，由图1的相同洗脱体积的两部分的分子量计算支化系数。
从图2可看出，在分子量约20万以上的区域内，实施例8的支化系数从支化系数0.5开始急速增大。这就说明，即使在透明质酸的酸促进水解的条件下，本发明所得的透明质酸凝胶中也包含稳定存在的交联结构。
实施例10
透明质酸凝胶在碱性缓冲水溶液中的浸渍试验
用蒸馏水洗涤实施例1所得的海绵状透明质酸凝胶后，将其浸泡在实施例6所述的磷酸缓冲生理盐水中，并洗涤，再用蒸馏水洗净。将包含干燥重量为150mg的透明质酸的洗净的透明质酸凝胶浸泡在pH11的磷酸氢二钠-氢氧化钠25mM缓冲液50ml中，并于25℃放置，使其快速溶解，1小时后完全溶解。同样浸泡在pH10的碳酸氢钠-氢氧化钠25mM缓冲液中，7小时后崩解，18小时后完全溶解。
这就说明本发明所得的透明质酸凝胶具有难溶于中性水溶液，但在碱性水溶液中快速溶解的特征。
实施例11
透明质酸凝胶的溶胀度测定
用蒸馏水洗涤实施例1所得海绵状透明质酸凝胶后，将其浸泡在实施例6记载的磷酸缓冲生理盐水中并洗净，再用蒸馏水洗涤。然后，使洗净的透明质酸凝胶冷冻干燥。
将干燥重量为100mg的透明质酸凝胶浸泡在200ml蒸馏水中，室温放置24小时。取出溶胀的透明质酸凝胶在滤纸上脱水后，测定溶胀的透明质酸凝胶的重量。溶胀倍数为117倍。
这就说明本发明所得的透明质酸凝胶的溶胀倍数具有可测定的稳定性。
实施例12
透明质酸凝胶的细胞毒性试验
在非接触条件下使取自常人皮肤的成纤维细胞与本发明所得的透明质酸凝胶共存，并进行培养，通过观察细胞增殖的情况来评估细胞毒性。按照实施例8的处理方法使利用实施例1的方法获得的海绵状透明质酸凝胶成为冷冻干燥体。将该冷冻干燥体进行机械粉碎，取20mg装入Falcon公司生产的细胞培养内眼板(cell culture insert，孔径为3μm)，并浸入接种了细胞的培养基中。另外，将于不存在透明质酸凝胶的情况下进行培养作为对照。
培养条件
板：细胞培养用12孔板
培养基：DMEM培养基+10％胎牛血清，2ml/孔
温度：37℃(5％CO2)
接种细胞数：1×104个/孔
培养开始2天后、5天后、8天后，用倒置显微镜(inverted microscope)观察细胞密度发现，即使透明质酸凝胶共存，增殖情况也与对照组同样良好。这样就可确认本发明所得的透明质酸凝胶对细胞无毒性作用。
实施例13
将分子量为2×106道尔顿的透明质酸钠溶于蒸馏水，调制成1重量％的透明质酸水溶液。用1N盐酸将该水溶液的pH调整为1.5，获得透明质酸的酸性水溶液。将25ml该透明质酸酸性水溶液装入塑料培养皿中，然后放入温度设定为-20℃的冰箱中。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻，获得海绵状透明质酸凝胶。然后，于5℃将其用添加了50mM磷酸缓冲成分的pH被调整为7的磷酸缓冲生理盐水100ml浸泡24小时，进行中和，再用蒸馏水充分洗净。接着，用2块板夹紧进行压延，并冷冻干燥，其结果是，获得片状透明质酸凝胶的防粘连剂。
实施例14
除了使用分子量为6×105道尔顿的透明质酸钠之外，其他操作与实施例13相同。其结果是，获得片状透明质酸凝胶的防粘连剂。
实施例15
将实施例13调制的分子量为2×106道尔顿、pH为1.5的透明质酸的酸性水溶液25ml装入塑料培养皿中，然后将其放入温度设定为-20℃的冰箱。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻后，获得海绵状透明质酸凝胶。接着，与实施例13同样，将其浸泡在磷酸缓冲生理盐水中，并洗净后，用2块板夹紧压延，再用烘箱于40℃风干，历时3小时。其结果是，获得膜状透明质酸凝胶的防粘连剂。
实施例16
将实施例13所得的片状透明质酸凝胶50mg放入10ml无菌生理盐水中，用微型均化机(POLYTORON KINEMATICA AG生产)粉碎，获得粉碎状透明质酸凝胶的防粘连剂。
实施例17
将实施例13制得的分子量为2×106道尔顿、pH为1.5的透明质酸酸性水溶液15ml装入30ml容器中，然后将其放入温度设定为-20℃的冰箱。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻，获得海绵状透明质酸凝胶。然后，于5℃将其用添加了50mM磷酸缓冲成分的pH被调整为7的磷酸缓冲生理盐水100ml浸泡24小时，进行中和，再用蒸馏水充分洗净。接着，直接冷冻干燥，其结果是，获得海绵状透明质酸凝胶的防粘连剂。
实施例18
将实施例13制得的分子量为2×106道尔顿、pH为1.5的透明质酸酸性水溶液15ml装入30ml容器中，然后将其放入温度设定为-20℃的冰箱。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻，获得海绵状透明质酸凝胶。然后与实施例13同样，将其浸泡在磷酸缓冲生理盐水中，并洗净，离心脱水后压紧，再进行冷冻干燥。其结果是，获得块状透明质酸凝胶的医用材料。
实施例19
将分子量为2×106道尔顿的透明质酸钠溶于蒸馏水，使其浓度为0.05％，然后，用1N盐酸将其pH值调整为1.5，取100ml上述透明质酸的酸性水溶液装入200ml容器中，并将其放置在温度设定为-20℃的冰箱。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻后，获得纤维状透明质酸凝胶。然后，过滤回收，与实施例13同样，将其浸泡在磷酸缓冲生理盐水中，洗净并冷冻干燥。其结果是，获得纤维状透明质酸凝胶的医用材料。
实施例20
使5ml实施例13制得的分子量为2×106道尔顿、pH为1.5的透明质酸酸性水溶液注入管状模具中，并将其放置在温度设定为-20℃的冰箱。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻后，获得管状透明质酸凝胶。然后与实施例13同样，将其浸泡在磷酸缓冲生理盐水中，洗净并冷冻干燥。其结果是，获得管状透明质酸凝胶的医用材料。
实施例21
将25ml实施例13制得的分子量为2×106道尔顿、pH为1.5的透明质酸酸性水溶液装入塑料培养皿中，并将其放置在温度设定为-20℃的冰箱。反复进行2次22小时的冷冻和25℃的2小时解冻后，获得海绵状透明质酸凝胶。然后与实施例13同样，将其浸泡在磷酸缓冲生理盐水中，洗净并轻度脱水后，添加1重量％的透明质酸水溶液5ml，直接用2块板夹紧进行压延，并冷冻干燥。其结果是，获得并用了透明质酸的片状透明质酸凝胶的防粘连剂。
比较例7
使用实施例13制得的透明质酸水溶液，用1N氢氧化钠将其pH值调整为7.0，在塑料培养皿中倒入25ml上述水溶液，于-20℃冷冻，在冷冻干燥后，获得片状透明质酸。
比较例8
使用实施例13制得的透明质酸水溶液，用1N氢氧化钠将其pH值调整为7.0，在塑料培养皿中倒入25ml上述水溶液，于60℃风干，获得片状透明质酸。
比较例9
使用实施例13制得的透明质酸水溶液，用1N氢氧化钠将其pH值调整为7.0，在烧杯中倒入25ml上述水溶液，于-20℃冷冻，在冷冻干燥后，获得海绵状透明质酸。
比较例10
将1.1g磷酸氢二钠水合物溶于30g水，用2％的氢氧化钠将pH调整为10后，使分子量为6×105道尔顿的透明质酸钠0.6g溶于该溶液。然后，将0.05g氰尿酰氯溶于1.5ml二噁烷，再将其添加到上述透明质酸溶液中，于室温使它们反应3小时。接着，将其装入透析膜中，用水透析1天，使其流入附有模板的玻璃板上，并干燥，获得薄膜。
实施例22
透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的溶解性试验
在生理盐水中添加50mM浓度的磷酸缓冲成分，调制成pH为7的磷酸缓冲生理盐水。将包含干燥重量为150mg的透明质酸的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料浸泡在50ml磷酸缓冲生理盐水中，并轻轻振荡。由其形态求出25℃时溶于磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的溶解性。
按照以上步骤，具体进行了实施例13～21和比较例7～9的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的溶解性试验。其结果如表4所示。
表4 试验 No. 透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的形态 参考 1天后 4天后 7天后 19 不变 不变 部分溶解 实施例13 20 不变 部分溶解 部分溶解 实施例14 21 不变 不变 部分溶解 实施例15 22 不变 部分溶解 部分溶解 实施例16 23 不变 不变 不变 实施例17 24 不变 不变 不变 实施例18 25 不变 不变 部分溶解 实施例19 26 不变 不变 部分溶解 实施例20 27 不变 部分溶解 部分溶解 实施例21 28 完全溶解 维持1天后的状态维持1天后的状态 比较例7 29 完全溶解 维持1天后的状态维持1天后的状态 比较例8 30 完全溶解 维持1天后的状态维持1天后的状态 比较例9
从表4可看出，与比较例(试验No.28～30)的仅由透明质酸形成的片状、海绵状成型物在1天内就可完全溶于25℃的中性水溶液相比，实施例(试验No.19～27)的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料即使在7天后也只部分溶解或无变化，这就暗示其形态可保持1天以上。
实施例23
透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的溶解性试验
在生理盐水中加入50mM浓度的磷酸缓冲成分，调制成pH为7的磷酸缓冲生理盐水。将包含干燥重量为150mg的透明质酸的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料浸泡在50ml磷酸缓冲生理盐水中，并慢慢搅拌。由磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸浓度求出37℃时溶于磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸比例。
透明质酸浓度的测定
利用GPC，通过差示折射率检测器的峰面积求出磷酸缓冲生理盐水中的透明质酸浓度。
按照以上步骤，具体进行了实施例13～21及比较例7～9的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的溶解性试验。其结果如表5所示。
表5试验No.透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料的溶解率(％) 参考12小时后 1天后 4天后 7天后 31 6 15 24 29 实施例13 32 15 21 38 55 实施例14 33 6 18 26 35 实施例15 34 8 21 29 40 实施例16 35 8 16 22 28 实施例17 36 6 15 20 26 实施例18 37 8 15 26 32 实施例19 38 8 14 24 30 实施例20 39 12 21 30 36 实施例21 40 100 100 100 100 比较例7 41 100 100 100 100 比较例8 42 96 100 100 100 比较例9
从表5可看出，与比较例(试验No.40～42)的仅由透明质酸形成的片状、海绵状成型物12小时后在37℃的磷酸缓冲生理盐水中的溶解率为96～100％相比，实施例(试验No.31～39)的透明质酸凝胶的防粘连剂及医用材料在7天后的溶解率为26～55％，这就暗示其在水中的难溶性。
实施例24
透明质酸凝胶的防粘连剂的生体适应性试验和生体内的滞留性试验
将实施例13和实施例14获得的片状透明质酸凝胶的防粘连剂，作为对照组的比较例7获得的片状透明质酸和比较例10获得的氰脲酰氯交联的透明质酸都裁成1cm×1cm的正方形，供以下试验用。
取20只12周龄的雌性DDY小鼠(平均体重33g)，在其中的5只中埋入透明质酸凝胶(分子量2×106道尔顿)、5只中埋入透明质酸凝胶(分子量6×105道尔顿)、作为比较例在5只中埋入经过冷冻干燥的透明质酸，剩下的5只中埋入氰尿酰氯交联的透明质酸。
埋入的方法是用戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉后，沿腹部正中切开约1.5cm，将各种透明质酸放置在盲肠上再缝合。
埋入后的第3、5、7、9、14天，利用颈椎脱臼的方法处死埋入了透明质酸凝胶的小鼠和埋入了经过冷冻干燥的透明质酸的小鼠各1只，切开它们的腹部，观察埋入部位的状态。然后，用生理盐水清洗腹腔，回收包括片状物在内的残存透明质酸。
在上述回收液中加入等量的0.02N的氢氧化钠，静置1小时后，加入盐酸中和。然后，进行离心分离，通过薄膜(孔径为0.45μm)过滤。接着，对所得试样进行GPC分析，对回收液中的透明质酸进行定量。以埋入的片状物中的透明质酸量为基准，算出透明质酸回收率，其结果和对埋入部位进行观察的结果一起列于表6。
表6试验No.埋入的片状物埋入后 天数透明质酸的回收率(％)片状物的状态组织的状态 43实施例13的透明质酸凝胶(分子量2×106道 尔顿) 3 5 7 9 14 83 63 28 15 0保持原形保持原形呈断片状略有残余未发现○○○○○ 44实施例14的透明质酸凝胶(分子量6×105道 尔顿) 3 5 7 9 14 59 13 2 0 0保持原形略有残余略有残余未发现未发现○○○○○ 45比较例7的经过冷冻干燥的 透明质酸 3 5 7 9 14 0 0 0 0 0未发现未发现未发现未发现未发现○○○○○ 46比较例10的氰尿酰氯交联的 透明质酸 3 5 7 9 14 73 46 10 0 0保持原形保持原形略有残余未发现未发现△△△△△
(注)○：无异常，△：轻微炎症
每一只小鼠都能够正常发育，埋入了透明质酸凝胶及经过冷冻干燥的透明质酸的局部组织状态未见异常，但埋入了比较例10获得的氰尿酰氯交联的透明质酸的组织有轻微炎症。
实施例25
透明质酸凝胶的防粘连剂对小鼠子宫模型的粘连防止效果试验
将实施例13获得的透明质酸凝胶的防粘连剂裁成1cm×2cm的长方形，在实施例13获得的透明质酸凝胶的防粘连剂中添加实施例13制得的透明质酸溶液，再将作为对照的比较例7制得的片状透明质酸、实施例13制得的透明质酸溶液及比较例10获得的氰尿酰氯交联的透明质酸裁成1cm×2cm的长方形，将上述试样用于以下试验。
在7周龄的雌性ICR小鼠(体重25～30g)的腹腔内注射戊巴比妥进行麻醉后，从腹腔正中剖开，在子宫角用碘酒涂搽约10mm长使其损伤。分别使各组的10只小鼠不加处置作为对照，或各用上述透明质酸凝胶、片状透明质酸、氰尿酰氯交联的透明质酸的1cm×2cm长方形片状物缠绕损伤部位。另外，使用透明质酸溶液时，将1ml实施例13调制的透明质酸溶液涂布在伤处。并用透明质酸凝胶和透明质酸溶液时，首先将透明质酸凝胶缠绕在伤处，然后在腹腔内加入透明质酸溶液1ml。在缝合腹腔时，每次使用5-0地塞米松。
术后第10天，通过颈椎脱臼的方法处死不加处置、使用透明质酸凝胶、并用透明质酸凝胶和透明质酸溶液、使用片状透明质酸、使用了透明质酸溶液及使用了氰尿酰氯交联的透明质酸的小鼠各10只，然后，再次打开腹腔，判定是否存在粘连的现象。成膜状的极轻微的粘连不判定为粘连，如果出现纤维状、且较厚、即使用外科镊子牵拉也不容易剥离的强度粘连才判定为形成粘连。其结果如表7所示。
表7 试验No. 组别形成粘连的比例 参考 47 无处置 9/10 比较例 48实施例13的透明质酸凝胶 1/10 实施例 49实施例13的透明质酸凝胶中添加了实施例13调制的 透明质酸溶液 0/10 实施例 50比较例7的片状透明质酸 5/10 比较例 51实施例13调制的透明质酸 溶液 6/10 比较例 52比较例10的氰尿酰氯交联 的透明质酸 3/10 比较例
从表7可看出，与未进行过处置的10只小鼠中，形成粘连的占9只，而仅用透明质酸形成的片状物是10只中占5只，透明质酸溶液是10只中占6只，氰脲酰氯交联的透明质酸是10只中占3只相比，实施例13的透明质酸凝胶的防粘连剂是10只中占1只，在实施例13调制的透明质酸凝胶的防粘连剂中添加了实施例13调制的透明质酸溶液是10只均未发生粘连，这就说明后两种具有良好的粘连防止作用。
实施例26
透明质酸凝胶的防粘连剂对大鼠盲肠模型的粘连防止效果试验
分别将实施例13制得的透明质酸凝胶的防粘连剂、作为对照的比较例7获得的片状透明质酸、比较例10获得的氰尿酰氯交联的透明质酸裁成2cm×2cm的正方形，供以下试验用。
在10周龄雄性Wistar大鼠(体重约250g)的腹腔内注射氯胺酮(60mg/1kg体重)和赛拉嗪(10mg/1kg体重)进行麻醉后，从腹腔正中剖开，在盲肠处约10×10mm的区域内用量规(gauge)磨擦(约20次)直到出现出血点为止，形成擦伤。分别使各组的5只大鼠不加处置作对照，或在损伤部位分别添加上述透明质酸凝胶、片状透明质酸、氰尿酰氯交联的透明质酸的2cm×2cm的正方形片状物进行处理。缝合腹腔时，每次使用3-0地塞米松。
术后第14天，处死不加处置、使用透明质酸凝胶、使用片状透明质酸、使用了氰尿酰氯交联的透明质酸的大鼠各5只后，再次打开腹腔，判定是否形成粘连。成膜状的极轻微的粘连不判定为粘连，如果出现纤维状、且较厚、即使用外科镊子牵拉也不容易剥离的强度粘连才判定为形成粘连。其结果如表8所示。
表8试验No. 组别形成粘连的比例 参考 53 无处置 4/5 比较例 54实施例13的透明质酸凝胶 1/5 实施例 55比较例7的片状透明质酸 3/5 比较例 56比较例10的氰尿酰氯交联 的透明质酸 2/5 比较例
从表8可看出，与未进行过处置的5只大鼠中形成粘连的占4只，而仅用透明质酸形成的片状物是5只中占3只，氰脲酰氯交联的透明质酸是5只中占2只相比，实施例13的透明质酸凝胶的防粘连剂是5只中占1只，这就说明该防粘连剂具有良好的粘连防止作用。
产业上利用的可能性
以上，利用本发明获得了不使用任何化学交联剂和化学修饰剂的难溶于水的透明质酸凝胶。这样可避免因使用化学交联剂和化学修饰剂而引起的对生体适应性的不良影响，可延长其在生体内的滞留时间，所以，能够用于生体适应性材料领域。特别是本发明的水难溶性透明质酸凝胶(1)作为防粘连剂，能够获得理想的生体内滞留性，(2)通过大幅度改善在创面的滞留时间可显著抑制术后粘连，(3)完全解决了以往的化学改质透明质酸的毒性和生体适应性问题，提供了安全性极高的优质防粘连剂。