TAFA4化合物及其用于治疗疼痛的用途
发明领域
本发明涉及用于预防、减轻或治疗受试者中疼痛的新化合物。本文中还描述了药物组合物、其制备和用途以及用于使用这类化合物和组合物预防、减轻或治疗疼痛的方法。
发明背景
疼痛是一种与当前或潜在的组织损伤有关的令人不快的感觉体验。因此，疼痛是多种损伤和疾病最常见的症状。存在疼痛的不同分类，例如伤害感受性(Nociceptive)疼痛，与组织损伤和免疫细胞的浸润有关的炎性疼痛，病理性疼痛，其为由对神经系统的损害(即神经病疼痛)或其异常功能(功能异常疼痛，如在纤维肌痛、肠易激综合征、紧张型头痛(tensiontypeheadache)等中)所致的疾病状态。疼痛通常是短时间的，仅持续至有害刺激消除或基础性损伤或病理已治愈，但一些疼痛状况，如类风湿性关节炎、周围神经病、癌症和特发性(idiopathic)疼痛(在创伤或病理已治愈后持续或在没有任何明显原因的情况下发生的疼痛)，可能持续数年。长时间的疼痛称为慢性的，而快速消退的疼痛称为急性的。传统上讲，急性和慢性疼痛之间的区分依赖于从发作起的绝对时间间隔；最常使用的两种标志是从疼痛发作起3个月和6个月(Turk,Okifuji,Paintermsandtaxonomiesofpain；In:Bonica,Loeser,Chapman,Turk,Butler,Bonica'smanagementofpain.Hagerstwon:LippincottWilliams&Wilkins,2001)，不过一些理论家和研究者已将急性到慢性疼痛的转变设为12个月(Spanswick,Main,Painmanagement:aninterdisciplinaryapproach.Edinburgh:ChurchillLivingstone,2000)。其他人认为持续少于30天的疼痛为急性，超过6个月持续时间的疼痛为慢性，而持续1至6个月的疼痛为亚急性的(Thienhaus,Cole,ClassificationofPain.于:Weiner,Painmanagement:apracticalguideforclinicians.BocaRaton:CRCPress,2002)。对慢性疼痛的一种流行的其他定义是“超出预期痊愈时间段的疼痛”，其不涉及绝对固定的持续时间(Turk,Okifuji,2001,Paintermsandtaxonomies.In Loeser,Butler,Chapman,等Bonica'smanagementofpain,LippincottWilliams&Wilkins.ISBN0-683-30462-3)。慢性疼痛可分类为癌症疼痛或良性(Thienhaus,Cole,2002,Classificationofpain.InWeiner,painmanagement:Apracticalguideforclinicians,AmericanAcademyofpainManagement,ISBN0-8493-0926-3)。
疼痛感觉由感觉神经元传递给脑，感觉神经元还称为伤害性感受器(伤害性感受器)。伤害性感受器被视为多模式的(polymodal)，因为它们可以应答有害或强烈刺激的多种形式，如热、机械性和化学刺激。伤害性感受器的感觉传入纤维在许多方面是异质的。例如，感觉神经根据其直径和髓鞘形成程度分为Aα、-β、-δ和C-纤维。然后，来自末梢的感觉输入通过涉及脊髓内的兴奋性和抑制性中间神经元的复杂环路被处理和传达给更高级脑区域(Basbaum等,2009；Todd,2010)。兴奋和抑制之间的平衡对于维持正常感觉功能是至关重要的，且这些环路的功能异常导致疼痛如炎性和神经病疼痛的形成。
疼痛的治疗包括使用阻断神经元传递和影响感觉以及疼痛的局部麻醉剂，和减轻疼痛且另外可能干扰炎症的化学介导物的活性的止痛剂。急性疼痛通常用药物如止痛剂和麻醉剂管理。然而对慢性疼痛的管理是困难得多的。
止痛剂的有效性依赖于它们怎样能阻断由疼痛受体送递至脑的神经信息。它们还对体温有影响，升温(称为发热)或降温。止痛药物以多种方式作用于周围和中枢神经系统；其包括扑热息痛(paracetamol)(对乙酰氨基酚，也称为醋氨酚(acetaminophen)或简称为APAP)，非类固醇类抗炎药物(NSAID)如水杨酸盐(salicylate)，和阿片样药物如吗啡和鸦片。
扑热息痛/醋氨酚的确切作用机制尚未确定的，但似乎是在中枢而非周围作用(在脑而非神经末梢)。阿司匹林和其他非类固醇类抗炎药物(NSAID)抑制环氧合酶，导致前列腺素产生的减少。这降低疼痛以及炎症(与扑热息痛和类鸦片相反)。扑热息痛具有很少的副作用且被认为是安全的，尽管超过推荐剂量的摄取可能导致肝损伤(这可能是严重和致命的)和偶尔的肾损伤。NSAID易于引起消化性溃疡、肾衰竭、过敏反应和偶尔的听觉丧失，而且其能通过影响血小板功能增加出血风险。阿司匹林在患有病毒性疾病的低于16岁儿童中的使用与Reye氏综合征关联，该病史一种罕见但严重的肝病症。吗 啡(原型阿片样物质)和多种其他物质(例如可待因、羟考酮(oxycodone)、氢可酮(hydrocodone)、双氢吗啡、哌替啶(pethidine))均对大脑阿片受体系统施加类似的影响。所有阿片样物质的给药可能受阿片毒性(意识混乱、呼吸抑制、肌抽跃(myoclonicjerk)和针尖瞳孔(pinpointpupils))、癫痫(曲马多(tramadol))限制，但在积累耐受的患者中没有剂量最高限度。
止痛剂选择也由疼痛的类型决定：对于神经病疼痛，传统的止痛剂不那么有效，而且经常受益于通常不认为是止痛剂的药物类别，如三环抗抑郁剂和抗惊厥药。已显示三环抗抑郁剂，特别是阿密曲替林(amitriptyline)以似乎是中枢的方式改善对疼痛的治疗。奈福泮(Nefopam)在欧洲用于与阿片样物质一起进行疼痛减轻。卡马西平(carbamazepine)、加巴喷丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)的确切机制同样是不清楚的，但这些抗惊厥药用于治疗神经病疼痛具有不同程度的成功。抗惊厥药最普遍用于神经病疼痛，因为其作用机制倾向于抑制疼痛感觉。
然而，某些组合止痛剂产品可能引起显著的不良事件，包括偶然的服药过量，最经常是由起因于这些组合的多种(且经常是非作用性)组分的混乱所致(Murnion,Combinationanalgesicsinadults.AustralianPrescriber(33):113–5.http://www.australianprescriber.com/magazine/33/4/113/5)。
不当的疼痛治疗在外科病房、特护病房、事故和急诊科室中，在一般实践、在所有形式的慢性疼痛(包括癌症疼痛)的管理中、和在生命护理结束时广泛存在。这种忽视扩大到所有年龄，从新生婴儿到虚弱老人。迄今为止，尤其是在考虑神经病、炎性和/或慢性疼痛时(此时不管是选择哪种已知的止痛剂分子治疗仍是不完全的)，患者仍高度要求有改进的疼痛治疗。
发明概述
本发明的目的是提供用于治疗疼痛的新的和有效的组合物和方法。具体地，本发明提出了用于预防或治疗疼痛和/的新组合物和方法，其通过调控神经元兴奋性。
本发明的一个目的更具体地涉及TAFA4蛋白或其激动剂，用作治疗或预防受试者中疼痛的活性成分。
本发明还涉及一种预防或治疗受试者中疼痛的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的TAFA4蛋白或其激动剂，单独地或与一种或多 种对疼痛有效的另外的活性化合物组合使用。
本发明的另一个目的涉及一种试剂盒，其包含i)TAFA4蛋白或其激动剂，或包含这类蛋白或激动剂的组合物，和ii)至少一种对疼痛有效的另外的不同活性化合物。
在一个具体的实施方案中，所述TAFA4蛋白包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列或与SEQIDNO:1或2具有至少90％同一性的序列。所述激动剂优选包含TAFA4蛋白的肽片段，其调控伤害性感受器或中间神经元，优选为C-纤维伤害性感受器(优选C-LTMR)或脊髓中间神经元(优选脊髓层IIi中间神经元)的兴奋性。典型地，所述激动剂是包含具有SEQIDNO:1或2的至少10个连续氨基酸残基，优选至少20,25,27或30个连续氨基酸残基的片段的肽，更优选所述激动剂包含SEQIDNO:3或4的氨基酸序列。
在此方面，本发明的又一个目的涉及TAFA4蛋白的多肽或肽激动剂。优选地，所述多肽激动剂包含TAFA4蛋白的片段且调控伤害性感受器或中间神经元，优选为C-纤维伤害性感受器(优选C-LTMR)或脊髓中间神经元(优选脊髓层IIi中间神经元)的兴奋性。
本发明适用于预防或治疗任何疼痛。具体地，其可用于治疗或预防神经病疼痛、炎性疼痛、伤害性感受器介导的疼痛、急性疼痛、亚急性疼痛、慢性疼痛、躯体疼痛、内脏疼痛、触诱发痛(allodynia)、痛觉过敏、或与神经损伤有关的疼痛。本发明尤其适用于治疗炎性和/或神经病疼痛。
所述TAFA4蛋白或激动剂可通过任何路径施用或应用，如局部、口服、经肛门、肌内、静脉内、腹膜内、皮肤、皮下、真皮、经皮或鞘内路径。
本发明的再一个目的涉及包含如本文中描述的TAFA4蛋白或其激动剂和优选地包含药学可接受的载体的组合物。
本发明的TAFA4化合物可单独或与进一步与一种或几种另外的活性化合物或治疗组合使用。用于本发明的化合物可同时、分别或序贯地配制或施用。
本发明的又一个目的涉及具有缺陷性TAFA4基因，更优选靶向失活的TAFA4基因的转基因啮齿动物。这类啮齿动物优选展现增强的机械性和化学超敏性和增强的神经元超兴奋性。
本发明可用于治疗任何哺乳动物受试者，特别是人中的疼痛。
附图简述
图1：TAFA4特异性标记C-LTMR。
(A)野生型成年小鼠的L4(n＝3；7.5％±1.3％)和T12(n＝3；19.2％±0.5％)DRG中TAFA4阳性神经元的百分比。
(B)DRGTafa4表达数据的示意图。图中圆的大小大致与由不同分子标志物所表示的细胞群体的大小成比例。
(C-H)Tafa4探针在成年小鼠腰(C-F)和胸(G,H)DRG切片中的原位杂交，接着是TrkA(C)、cRet(D)、MrgprD(E)、IB4(荧光素缀合的G.simplicifoliaIB4-凝集素)(F)、TH(G)和EGFP(H)的免疫染色或原位杂交。(比例尺＝100μm)。
图2：GFP+神经元显示C-无髓鞘的伤害性感受器的许多特性。
(A)TAFA4GFP/+(GFP+)神经元的细胞膜电容(Cm)和输入电阻(Rinput)的点状图。
(B,C)TAFA4GFP/+神经元中分离的Nav1.8-、T-型Ca2+-、IKA-和h-电流(B)和相应频率直方图(C)。显示了测试的神经元的数目。
(D)由短2ms-去极化步骤(左边图)或长持续时间去极化和超极化步骤(右边图)引起的TAFA4GFP/+神经元中的代表性动作电位和放电(firing)应答。注意到膜超极化上Ih介导的sag和由T型Ca2+电流触发的延迟反弹的电位。点线指示0mV水平。
(E)应答多种感觉刺激(如指示的)的GFP+-(TAFA4GFP/+)和GFP-神经元的百分比。右边图：在TAFA4GFP/+神经元中应答浴应用的低渗(200mOsmol/l)溶液和AITC(100μM)引发的钙信号的代表性例子。
(F)通过标准的8μm机械刺激物在4种不同的TAFA4GFP/+神经元中引发的MA电流的代表性迹线。机械性探针的速度在机械性刺激的前向运动期间是800μm/s。保持电位：-100mV。右边图：快速适应(RA)、缓慢适应(SA)、超缓慢适应(uSA)和混合的MA电流的频率分布。数据在33个TAFA4GFP/+神经元中收集且用标准的8μm机械刺激物刺激。
(G)TAFA4GFP/+神经元的速度相关的发放特性。注意到当机械性刺激物以缓慢开始速率施加时(n＝7)发放增强。
图3：组织损伤诱导的超敏性在TAFA4无义小鼠中增加。
(A)在CFA注射之前和之后，使用动态VonFrey装置，TAFA4无义小鼠(n＝12)和WT同窝出生小鼠(n＝11)的机械阈值。
(B-E)在角叉胶注射之前(第0天)和之后，使用4种具有递增口径(0.07,0.4,0.6和1.4g)的细丝(filament)，TAFA4无义小鼠(n＝12)和WT同窝出生小鼠(n＝7)的机械敏感性的时间过程。在D+7，打分是在鞘内注射2μg人重组TAFA4之前和之后15分钟时。
(F-H)使用3种具有递增口径(0.07,0.6和1.4g,n＝15)的细丝，TAFA4无义小鼠(n＝12)和WT同窝出生小鼠(n＝13)的坐骨神经收缩(CCI)之后的机械敏感性的时间过程。测量在CCI之前(第0天)和之后每5天测定。在D+30，打分是在鞘内注射2μg人重组TAFA4之前和之后15分钟时(TAFA4无义小鼠(n＝5),WT(n＝7))。
(I,J)在2％福尔马林注射后畏缩、咬和舔(flinching,bitingandlicking)行为中花费的时间过程和总时间(以2个阶段：第一0-10min和第二10-60min)(WTn＝11和TAFA4无义小鼠n＝12)。
(K)鞘内注射2μg人重组TAFA4在TAFA4无义小鼠中恢复了福尔马林引发的超敏性至WT水平(媒介物n＝8,hTAFA4n＝8)。
数据显示为均值±SEM.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，单向ANOVA然后是非配对t检验。
图4：TAFA4无义小鼠中的层IIi神经元兴奋性。
(A1)显示来自WT(上方)或TAFA4无义(下方)脊髓切片的神经元对2s去极化(+25)或超极化(-25pA)电流脉冲的应答的代表性记录。
(A2)由递增强度的电流脉冲(5至50pA)引发的AP的平均数目的定量。(ANCOVA,p<0.01)。
(A3)在WT和TAFA4无义小鼠的层IIi神经元中由2s去极化电流脉冲(+25pA)引发的不同时间放电的平均放电速率。
(A4)在2s超极化电流脉冲(-50和-25pA)之后反弹动作电位的平均数目。(t检验，p<0.05)。
(B1)来自WT和TAFA4无义神经元的对从-40至-100mV的向后和向前电压缓变的代表性电流应答。每条迹线代表5个连续应答的平均。(B2)在WT和TAFA4无义动物的层IIi神经元中在升压缓变结束时测量的向外电流的峰定量(t检验，p<0.05)。
(C1)在WT条件，和在20nM重组TAFA4、TEA(2.5mM)和4AP(1mM)的存在下TAFA4无义层IIi神经元对向后和向前电压缓变的应答。
(C2)TAFA4-层IIi神经元中在电压缓变的上升边缘结束时测量的向外电流的定量。注意在TAFA4应用后向外电流的增加(p<0.05)和通过4AP对该电流的阻断。
(D1,D2)在TAFA4无义动物的层IIi神经元中在TAFA5和TAFA2(各20nM)的表面灌流浴(bathsuperfusion)之后向外电流的代表性迹线和定量。
(E1)在WT中和重组TAFA4表面灌流之后低阈值向外电流的发生。
(E2)层GAD65/67阴性(左)和阳性(右)神经元的例子。图像是单共焦平面。白色箭头指示GAD阳性体细胞的标记。
图5：TAFA4GFP小鼠的生成和呈现。
(A)用于触发Tafa4基因座中的同源重组以生成TAFA4敲入小鼠的基于BAC的TAFA4GFP策略的示意图。
(B-C)使用Tafa4探针在来自WT(B)和TAFA4无义小鼠(C)(n＝5)的成年胸DRG切片上的原位杂交。
(D)WTDRG(n＝3,6209+/-385在T12中和7616+/-173在L4中)和TAFA4无义小鼠(n＝3,5933+/-324在T12中和7805+/-439在L4中)中神经元计数的总数。
(E,F)WT和TAFA4无义成年小鼠(n＝3)的T12(B)和L4(C)DRG中Ret,TH,TrkA,TrkB,TrkC和TAFA4阳性神经元的百分比。
(G,H)GFP在新生TAFA4GFP/+(G)和全封固成年DRG(H)的横向切片上的免疫染色。
(I,I’)在来自成年TAFA4GFP/+小鼠(I)和TAFA4无义小鼠(I’)(n>3)的腰椎脊髓切片上GFP和PKCγ的免疫染色和IB4染色。
(J,J’)在TAFA4GFP/+(J)或TAFA4无义成年小鼠(J’)(n>3)的背部皮肤切片上GFP和S100的免疫染色。
比例尺＝100μm.P>0.1单向ANOVA然后是非配对t检验。误差棒代表SEM。
图6：TAFA4无义小鼠就运动活动、焦虑、发痒(itch)、急性和损伤诱导的热超敏性而言表现正常。
TAFA4无义小鼠相比于WT同窝出生小鼠在以下测试中展现未改变的表型：使用开场测试评估的焦虑(n＝14WT,n＝17TAFA4无义)(A)，在使用转杆测试评估的运动协调(n＝22WT,n＝21TAFA4无义)(B)，在热板测试(n＝ 18WT,n＝17TAFA4无义)(C)，在使用梯度测试评估的急性热敏感(n＝15WT,n＝17TAFA4无义)(D)，在CFA诱导的热痛觉过敏(n＝12WT,n＝14TAFA4-null)(E)和在注射100μg致瘙痒(pruritogenic)试剂48/80的发痒测试(F)。P>0.1单向ANOVA然后是非配对t检验。误差棒代表SEM。
图7：TAFA4无义层IIi神经元的被动特性和低阈值阳离子流。
(A)WT和TAFA4无义动物的层IIi神经元中膜电位(A1)、细胞输入电阻(A2)、细胞电容(A3)和基电流(A4)的平均值。
(B1)显示WT和TAFA4无义动物中由-25pA超极化电流脉冲引发的Ihsag的代表性记录。
(B2)由-50和-25pA超极化电流脉冲引发的平均Ihsag的定量。(B3)在WT和TAFA4无义动物的层IIi神经元中在超极化脉冲(范围-5pA-50pA)期间峰和稳定态电位之间的关系。
(C1)WT和TAFA4无义层IIi神经元的代表性分离的T型样电流应答，其由从-100mV保持电位的递增幅度(25至60mV)的去极化电压步骤引发。
(C2)对T型样电流密度的定量揭示了WT和TAFA4无义小鼠之间的显著差异(t检验；p<0.05)。
(C3,C4)在浴应用人重组TAFA4之前和之后TAFA4无义神经元中测量的T型电流。
图8：在疼痛的角叉胶模型中鞘内TAFA4蛋白的体内止痛效果。
图9：在神经病疼痛的SNI模型中鞘内TAFA4蛋白的体内止痛效果。
图10：鞘内注射TAFA4之后对侧(contra–lateral)爪的应答
图11：在疼痛的角叉胶模型中皮下TAFA4蛋白的体内止痛效果。
图12：在神经病疼痛的SNI模型中皮下TAFA4蛋白的体内止痛效果。
图13：在神经病疼痛的SNI模型中，在术后7、14和21天时皮下TAFA4蛋白的体内止痛效果。
图14：重量监测。
发明详述
本发明提供用于治疗疼痛的新治疗办法。更具体地，本发明提供有效管理疼痛，特别是神经病疼痛和炎性疼痛的新解决方案。该解决方案牵涉通过使用TAFA4化合物调控感觉敏感性和/或神经元兴奋性。
TAFA4是一种属于分泌的小蛋白，其属于新近发现的TAFA趋化因子样蛋白家族(Tang等,2004)。TAFA4合成为140个氨基酸的前体，其含有35个氨基酸的信号序列和105个氨基酸的成熟链。人TAFA4与小鼠TAFA4具有90％氨基酸同一性。实时PCR分析指示TAFA4mRNA表达限制于中枢神经系统(CNS)，在丘脑中具有最高水平。
WO2006/013462涉及几种基因序列及其用途。然而，这些基因特别是NsG28的提出的用途基本是推测性的，且仅基于表达概况(profiles)。在此方面，尽管该参考文献提及疼痛，但对于所述用途没有原理且没有实验数据支持任何这类活性，至少对于其中一些基因，这表现为是错误的。此外，该参考文献未披露分离的蛋白的效果或用途，因而熟练技术人员不会将该文件视为提供任何技术教导。
在本发明之前，TAFA家族成员的生物学功能仍然是未确定的。
发明人现在令人惊讶地首次显示，TAFA4蛋白牵涉疼痛的控制。更具体地，本发明显示TAFA4在称为C-LTMR的背根神经节(DRG)神经元的特定子集(C-纤维低阈值机械感受器)中特异性表达。本发明进一步显示TAFA4无义小鼠在组织损伤后呈现持续的机械性和化学超敏性，两者均可通过施用人重组TAFA4蛋白逆转。
发明人还显示TAFA4无义小鼠呈现内部层II脊髓神经元的显著超兴奋性。不受理论束缚地，发明人认为，应答疼痛刺激，在病理学条件下，C-LTMR中升高的神经元活性增强TAFA4蛋白的分泌，其将经由对低阈值电流的激活调控脊髓的特定中间神经元的兴奋性。
有意思的是，发明人在实验部分还显示，TAFA4蛋白能特异性靶向机械和化学诱导的伤害感受信号，而不靶向温度诱导的信号。相比于也靶向热诱导的伤害感受的不那么特异性的已知治疗疼痛的产品，这是相当大的优势。
本发明的TAFA4化合物和组合物能激活新的止痛途径，其通过调控脊髓中间神经元(优选层IIi中间神经元)的C-LTMR-伤害性感受器介导的兴奋性，例如经由调控所述中间神经元上呈现的受体的活性(如钾离子通道、钙离子通道或低密度脂蛋白受体例如LRP1)。
本发明通过对下列定义的提述将得到最佳理解：
定义
在本发明的背景中，术语“TAFA4化合物”指TAFA4蛋白或TAFA4激动剂， 如下文定义的。
如本文使用的，术语“TAFA4蛋白”指属于TAFA趋化因子样蛋白的家族的蛋白质，优选包含SEQIDNO:1(其对应于人TAFA4氨基酸序列)或SEQIDNO:2(其对应于小鼠TAFA4氨基酸序列)的氨基酸序列，及其任何天然变体(例如在其他动物物种中呈现的变体，或多态性或剪接产生的变体)。在本发明的背景中，术语“TAFA4蛋白”还包括任意蛋白，其包含与SEQIDNO:1或2中显示的序列具有至少90％序列同一性(优选至少95％序列同一性或更高)的序列。典型地，TAFA4蛋白能调控伤害性感受器(nociceptor)敏感性和/或神经元兴奋性，如下文定义的。
在本发明的背景中，术语“TAFA4基因”指编码TAFA4蛋白的基因或核酸。具体地，“TAFA4基因”包括编码包含SEQIDNO:1或2的蛋白或这类蛋白的天然变体的任意核酸。
在本发明的背景中，术语“TAFA4激动剂”涵盖具有或介导或调控TAFA4活性的任意物质(例如肽、多肽、重组蛋白、缀合物、趋化因子、抗原、天然或人工配体、同源物、核酸、DNA、RNA、适体等或其组合)。具体地，TAFA4激动剂调控牵涉TAFA4活性的受体的活性，例如通过结合这类受体，由此调控神经元兴奋性。术语“激动剂”涵盖完全和部分激动剂两者。典型地，TAFA4激动剂指能调控感觉神经元(优选C-LTMR)的敏感性和/或中间神经元(优选脊髓IIi中间神经元)的兴奋性的任意化合物，特别是通过调控所述神经元上呈现的受体的活性，如本申请中描述的。
TAFA4激动剂涵盖TAFA4蛋白的任意肽片段，其调控伤害性感受器或中间神经元，优选为C-纤维伤害性感受器(优选C-LTMR)或脊髓中间神经元(优选脊髓层IIi中间神经元)的兴奋性。典型地，TAFA4激动剂是包含SEQIDNO:1或2的少于60个氨基酸残基的片段的肽。TAFA4激动剂优选包含SEQIDNO:1或2的至少10个连续氨基酸残基，优选至少20,15,25,27,28或30个连续氨基酸残基。在最优选的实施方案中，这类片段是包含如上文定义的“TAFA4蛋白”N末端部分的至少10,15,20,25,27,28或30个连续氨基酸残基的片段。在另一个实施方案中，TAFA4激动剂包含如上文定义的“TAFA4蛋白”C末端部分的至少10,15,20,25,27,28或30个连续氨基酸残基。TAFA4激动剂的具体例子为：(i)包含SEQIDNO:3(其对应于SEQIDNO:1的人TAFA蛋白的N末端部分的25个氨基酸残基)的氨基酸序列的肽；和(ii)包含SEQIDNO:4(其 对应于SEQIDNO:1的人TAFA蛋白的C末端部分的27个氨基酸残基)的氨基酸序列的肽。本发明的TAFA4激动剂能调控伤害性感受器敏感性和神经元兴奋性，如本申请中的。术语“序列同一性”如应用于核酸或蛋白序列时，指对至少两个比对的序列之间的核苷酸或氨基酸残基匹配的定量(通常为百分比)，其使用标准化的算法如Smith-Waterman比对(SmithandWaterman(1981)JMolBiol147:195-197)，CLUSTALW(Thompson等(1994)NucleicAcidsRes22:4673-4680)，或BLAST2(Altschul等(1997)NucleicAcidsRes25:3389-3402)。可以以标准化和可重复方式使用BLAST2，将缺口插入序列之一以优化比对和实现序列之间更有意义的比较。
在本发明的背景中，术语“疼痛”指与组织损伤有关的任意疼痛或敏感性。优选地，术语疼痛如用于其中的理解为异常敏感性，即典型为由伤害性感受器(特别是C-LTMR)介导的超敏性。术语疼痛包括选自以下的任意疼痛：伤害性感受器介导的疼痛(其中也称为伤害感受性疼痛)、神经病疼痛、炎性疼痛、病理疼痛、急性疼痛、亚急性疼痛、慢性疼痛、机械疼痛、化学疼痛、躯体疼痛、内脏疼痛、深躯体痛(deepsomaticpain)、体表疼痛、躯体形(somatoform)疼痛、触诱发痛、痛觉过敏、或与神经损伤有关的疼痛。“伤害感受性”疼痛或“伤害性感受器介导的”疼痛应答强烈或有害刺激对周围感觉神经元(伤害性感受器)的特定子集的激活而发生。根据本发明的伤害感受性疼痛包括机械性疼痛(压碎、撕开等)和化学疼痛(切口中的碘、眼中的辣椒粉)。伤害感受性疼痛的例子包括但不限于，创伤或手术疼痛、产痛(laborpain)、扭伤、骨折、烧伤、碰伤(bump)、擦伤(bruise)、注射、牙齿手术(dentalprocedure)、皮肤活组织检查和梗阻(obstruction)。伤害感受性疼痛包括内脏疼痛、深躯体痛和体表疼痛。内脏疼痛是弥散的，难以定位且经常指远端，通常表面的结构。它可能伴随恶心和呕吐，且可以描述为令人作呕、深处、挤压和迟钝的(sickening,deep,squeezing,anddull)。深躯体痛由对韧带、腱、骨、血管、筋膜和肌肉中伤害性感受器的刺激启动，且是迟钝的、作痛的、较差定位的(dull,aching,poorlylocalized)疼痛。深躯体痛的例子包括扭伤和骨断(brokenbone)。表面性疼痛由对皮肤或其他表面组织中伤害性感受器的激活启动，且是尖锐的、描述较多和清楚定位的(sharp,well-definedandclearlylocated)。产生体表疼痛的损伤的例子包括小伤口和小(一度)烧伤。炎性疼痛是在存在组织损伤或炎症的情况下发生的疼痛，包括术后、创伤后疼痛，关 节炎(类风湿或骨关节炎)疼痛和与对关节、肌肉和腱的损伤有关的疼痛，如在轴向下背部(axiallowback)疼痛中的。炎症导致周围感觉神经元的敏化，从而产生自发性疼痛并使疼痛超敏性无效。急性或慢性病理组织炎症通过敏化外周感觉神经元，导致局部和无效化疼痛超敏性来强烈地影响疼痛感知。已知炎性介导物增强伤害感受性主要传入纤维兴奋性，其部分通过修饰存在于神经末端的离子通道的表达和/或功能。神经病疼痛是一种常见的慢性、非恶性疼痛类型，其是周围或中枢神经系统中损伤或机能失常的结果。神经病疼痛可能具有不同的病因，且可能是由于例如创伤、手术、椎间盘突出(herniationofanintervertebraldisk)、脊髓损伤、糖尿病、带状疱疹感染(shingles)、HIV/AIDS、晚期癌症、截肢术(包括乳房切除术)、腕管综合征、长期酒精使用(chronicalcoholuse)、暴露于辐射、和作为神经毒性治疗剂(如某些抗HIV和化疗药物)的未意图的副作用所致而发生。它经常由慢性触诱发痛(定义为从普通不引起疼痛应答的刺激如轻触产生的疼痛)和痛觉过敏(定义为对正常疼痛刺激的增加的敏感性)表征，且在任何损伤组织的明显痊愈之外可能持续数月或数年。疼痛还可以存在于癌症患者中，这可能是由于多种起因；炎症、压迫、侵入、转移性扩散到骨或其他组织中。疼痛还包括与促使脑膜活动的感觉纤维活化有关的偏头痛和头痛。优选地，本发明的TAFA4化合物用于预防或治疗神经病和/或炎性疼痛。
在本发明的背景中，疼痛的“阈值”指产生疼痛所需要的最小刺激。具体地，疼痛感知阈值是刺激开始伤害时的点，且当受试者作用于停止疼痛时达到耐受阈值。例如，通过逐渐增加施加于身体的刺激如电流或热的强度来测量疼痛。
在本发明的背景中，术语“伤害性感受器”指介导域疼痛相关的伤害感受性信息的所有可能的感觉神经元。伤害性感受器促使皮肤组织活动(innervate)。术语“伤害性感受器”包括但不限于，机械感受器、机械-伤害性感受器、多模式(multimodal)伤害性感受器、化学感受器(chimioreceptor)和/或pruriceptor，其检测和转导多种有害刺激，包括化学、热或机械性刺激或这些刺激的组合。根据本发明的伤害性感受器的一个具体的例子对应于低阈值机械感受器(C-LTMR)，特定地应答机械和化学刺激。
伤害性感受器可通过本发明的TAFA4化合物调控，或者可以使用这类化合物以进一步调控脊髓特定中间神经元的兴奋性，例如经由激活低阈值电 流。
在本发明的背景中，术语“中间神经元”指在其他神经元之间传递信息的中继神经元。优选地，中间神经元是将伤害感受性信息从感觉神经元接替到脊髓投射神经元的神经元。根据本发明的优选的中间神经元是脊髓IIi中间神经元。中间神经元是神经化学上分散的，例如它们可以是兴奋性中间神经元(使用谷氨酸)和/或抑制性中间神经元(使用GABA或甘氨酸)。
典型地，根据本发明的中间神经元是直接和/或间接由如本申请中描述的TAFA4化合物调控的中间神经元。所述中间神经元表达多种组织化学标志物多种类型的受体，包括内吞作用受体、促代谢(metabotrobic)受体、变力性(inotropic)受体、生长因子受体，还有其他信号传导分子；且中间神经元兴奋性优选经由调控这类受体的活性来调控。
在本发明的背景中，术语“受体”包括选自促代谢受体、内吞作用受体(例如LRP1受体)和变力性受体如配体门控离子通道和电压门控例子通道(例如钾通道、钙通道和钠通道)或其组合的任意受体，其活性可通过本发明的TAFA4化合物调控。内吞作用受体包括介导多种胞外大分子和大分子复合物(包括脂蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂复合物和胞外基质蛋白)的内在化的受体。本发明的这类内吞作用受体的一个具体例子是低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1受体)。内吞作用受体包括还牵涉配体介导的信号转导中的受体。离子亚型受体包括离子通道、通道连接的受体和配体门控离子通道(LGIC)。电压门控离子通道(如钾通道、钠通道、钙通道)是在神经元兴奋性中起着基础性作用的通道，其直接负责动作电位的启动和传播，且牵连于不同的慢性疼痛病症。LGIC包括一组跨膜离子通道，其应答化学信息物(即配体)，如神经递质的结合打开或关闭。与离子传导孔所处位置相比，LGIC蛋白复合物上内源性配体的结合位点正常地位于该蛋白质的不同部分(变构结合位点)。配体结合和离子通道的打开或关闭之间的直接联系(配体门控离子通道特征性的)与促代谢受体的间接功能形成对比，后者使用第二信使。LGIC也不同于电压门控离子通道(其根据膜电位打开和关闭)，和伸展激活的(stretch-activated)离子通道(其根据细胞膜的机械变形而打开和关闭)。促代谢受体包含一个跨膜受体的大蛋白质家族，其感知细胞外部的分子并激活内部信号转导途径和最终的细胞应答。促代谢受体包括G蛋白偶联受体(GPCR)，也称为七跨膜域受体，七螺旋受体、蛇形(serpentine)受体和G蛋白连接受体 (GPLR)。
在本发明的背景中，术语“调控”或“神经元兴奋性的调控”指通过使用本发明的TAFA4化合物，牵涉疼痛信号的传递中的神经元的敏感性和/或兴奋性的变化。术语“调控”包括根据其活性受调控的中间神经元的类型，神经元兴奋性的“降低”和/或神经元兴奋性的“增加”。可由TAFA4调控的神经元是感觉神经元和/或中间神经元。神经元可由TAFA4直接或间接，电子或化学，经由受体或经由离子通道，或通过上述调控模式的任意组合来调控。伤害性感受器调控的一个例子是以下伤害性感受器调控，其包含对应答机械或化学刺激的躯体感知的阈值的控制。中间神经元调控的一个例子是对中间神经元兴奋性的调控，其包含调控脊髓中间神经元上存在的受体的活性。
在本发明的背景中，术语受试者中疼痛的“治疗”或“治疗”受试者中的疼痛指在应用或施用根据本发明的适宜TAFA4化合物或组合物后，延迟、稳定、治愈、愈合、缓和、减轻、改变、改善、改进、补救或影响如本文中描述的受试者中任意形式的疼痛，或与疼痛有关的任何疾病或状况(特别是与神经病疼痛有关的任何神经病状况)，或这类疾病或状况的任何症状。术语“治疗”还指在疼痛(其可能与任何损伤、病理或状况有关)的治疗中的任何成功指示物，包括任何客观或主观的参数，如消除、免除、延缓进展或严重性、稳定化、减少疼痛的症状、或使受试者对其更耐受。术语“治疗”疼痛还包括提高疼痛耐受和/或降低感知的疼痛。在具体的实施方案中，本发明的方法、化合物和组合物用于提高疼痛耐受和/或降低感知的疼痛。如本文中使用的，术语“疼痛耐受”指受试者能感知并在情感上和/或身体上击垮之前所能承受的疼痛量。疼痛耐受不同于疼痛阈值(产生疼痛所需的最小刺激)。如本文中使用的，“提高疼痛耐受”一般指其中受试者与之前状态相比能形成更大疼痛耐受(即更少感知的疼痛)的情况，例如在对受试者施用适宜的TAFA4化合物或组合物之后。
在本发明的背景中，对于受试者中疼痛的“预防”或“预防”受试者中的疼痛指在施用根据本发明的适宜的TAFA4化合物或组合物之后，至少降低受试者获得任何种类的疼痛的风险的可能性(或易感性)。例如，“预防”包括在暴露于或预先倾向于但尚未经历或展现疼痛症状的受试者中，使得至少一种疼痛的临床症状不形成。
活性成分
本发明的一个目的是TAFA4化合物用作预防或治疗受试者中疼痛的活性成分，所述疼痛具体为神经病疼痛、炎性疼痛、急性疼痛、亚急性疼痛、慢性疼痛、触诱发痛、痛觉过敏、经部分治疗的疼痛、化学诱发的疼痛、机械性诱发的疼痛、以及难治性疼痛，而优选地有利避免有害的副作用。在一个优选的实施方案中，所述TAFA4化合物将有效管理神经病疼痛或炎性疼痛。根据本发明的化合物还可以用于预防或治疗受试者中的慢性疼痛，所述受试者患有一般止痛剂(如吗啡)可能长时间段施用(任选地以延迟形式)的病理如癌症、烧伤等。依照本发明的化合物还可以与降低每日剂量的吗啡一起使用以改进患者的临床图谱(例如通过限制拟吗啡样物质的副作用，如肠病症)。
在一个优选的实施方案中，本发明的化合物是包含SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:1具有至少90％同一性的序列的TAFA4蛋白，或TAFA4激动剂，其优选包含SEQIDNO:1的片段，更优选其至少30aa的片段(如SEQIDNO:2的序列中指示的)，其调控脊髓中间神经元层IIi上存在的至少一种受体(特别是低密度蛋白LRP1受体或钾通道、或钙通道或另一种生理学相关的受体)的活性。在一个具体的实施方案中，本发明的TAFA4化合物有利地调控另外的受体(不同于第一受体)的活性。
受试者
在本发明的背景中，患者或受试者是动物，优选为脊椎动物，典型为哺乳动物。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人，不管其年龄或性别如何。哺乳动物可以进一步是动物，特别是驯养或饲养动物，特别是马、犬、猫等。在一个具体的实施方案中，所述受试者患有神经病疼痛或炎性疼痛，特别是慢性炎性疼痛。在另一个具体的实施方案中，受试者罹患有与以任何方式启动的疼痛有关的任何疾病或状况。
组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含如本文中描述的TAFA4化合物作为活性成分，和优选地药学可接受的载体。
“药物组合物”指本发明的化合物(活性成分)与本领域中一般接受的用于投递生物活性化合物至有此需要的受试者的介质的制剂。这类载体包括所有药学可接受的载体、稀释剂、介质或由此支持物。该载体可以选自例如甲基-beta-环糊精、丙烯酸的聚合物(如carbopol)、聚乙二醇和聚丙二醇的混合 物、单乙醇胺和羟甲基纤维素。可以采用常规的药学实践来向受试者提供适宜的制剂或组合物，例如以单位剂量形式。
该组合物通常是局部止痛/抗痛觉过敏组合物。
本发明的化合物和组合物适用于预防、减轻或治疗受试者中的疼痛，如上文描述的。
本发明的组合物还可以包含至少一种另外的活性化合物。该化合物可有利地选自SAID、NSAID或阿片样药物。
在另一个实施方案中，本发明的化合物或组合物还可以例如与意图治疗同时发生的疾患的药剂(例如抗肿瘤药剂)一起施用。
用于本发明的化合物可以同时、分开或序贯施用。
产生本发明化合物的方法
本发明还涉及产生TAFA化合物的方法。
本发明的TAFA4化合物(例如蛋白或肽激动剂)可通过任何常规已知的蛋白表达方法和纯化方法产生。例如：(i)用于合成肽的方法；(ii)用于将其纯化并从活体或培养的细胞分离的方法；或(iii)用于使用遗传重组技术产生其的方法等等(例如，记载于例如MolecularCloning(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,ColdSpringHarborLaboratoryPress)(1989)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel,F.M.,JohnWileyandSons,Inc.(1989)中的标准技术)。用于本发明的优选的蛋白或激动剂因此是分离或纯化的。如通常使用的，“分离的”指示例如蛋白或激动剂至少从其天然或产生环境的一些组分(如细胞培养基或活生物体)分开。更优选地，蛋白或激动剂被用作分离的或纯的材料，纯度水平高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％、或甚至更优选地高于95％。然后，分离或纯化的蛋白或激动剂可与另外的成分如赋形剂或别的活性试剂组合或混合，如下面部分中描述的。
治疗/规程/方案
本文中还教导用于预防或治疗受试者中疼痛的方法。该方法的一个目的是使用如上文定义的TAFA4化合物或组合物调控神经元兴奋性。用于预防、减轻或治疗有此需要的受试者中伤害性感受器介导的疼痛(具体为C-LTMR介导的疼痛)的一个具体的方法包括对受试者施用有效量的如本文中描述的TAFA4化合物或组合物。
用于预防、减轻或治疗有此需要的受试者中的疼痛的进一步的具体方法包括对所述受试者施用治疗有效量的如本文中描述的TAFA4化合物或组合物的步骤，其可以与至少一种另外的活性化合物，如背景技术中提到的任意一种分子例如阿司匹林、布洛芬、扑热息痛、阿片样物质等组合。
优选地，治疗方法指治疗神经病疼痛或神经病，包括在这类神经病的症状中的任何改善或外表迹象的任何延迟或减轻，例如其频率、烦难或不适、疼痛中的降低，或者甚至神经病的总体消失。在具体的实施方案中，本发明的TAFA4化合物或组合物可用于在形成疾病的首先迹象之前预防神经病疼痛或预防神经病，从而保护受试者免于受试者可能暴露的这类神经病疼痛或神经病。
可以根据疼痛的不同形式(即急性或慢性神经病疼痛)改变施用本发明的化合物或组合物进行这类治疗的持续时间、剂量和频率。治疗可以是单独使用的或与其他活性成分同时或分开或序贯组合。
根据本发明的化合物或组合物可以多种方式或路径施用。本发明的化合物或组合物可通过肌内、静脉内、腹膜内、皮肤、皮下、真皮、经皮、鞘内、眼部(例如角膜)或直肠途径，或通过在炎性部位上的局部施用来施用，优选通过肌内或静脉内注射。
典型的方案包括在一天或数天(长达一年，且包括一周至约6个月，或者其可以是长期的)的时段内单次或重复施用有效量的TAFA4化合物。理解体内施用的本发明的药物化合物或组合物的剂量将依赖于接受者(受试者)的年龄、健康、性别和重量、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和期望的药物效果的性质。本文中提供的有效驾龄的范围不意图为限制性的且代表优选的剂量范围。然而，最优选的剂量将根据个体受试者而定，如相关领域技术人员所理解和能确定的(参见例如Berkowet等编,TheMerckManual,16thedition,MerckandCo.,Rahway,N.J.,1992；Goodmanetna.,eds.,GoodmanandCilman’sThepharmacologicalBasisofTherapeutics,10thedition,PergamonPress,Inc.,Elmsford,N.Y.,(2001))。
每次治疗所需的总剂量可由多个剂量或在单个剂量中施用，优选地早至早期疼痛症状()出现时，或者是预防性的，例如在手术之前或期间需要时。药物化合物可以单独地或连同至少一种针对该病理或针对该病理的其他症状的其他药物一起施用。根据本发明的化合物或组合物的有效量为约1μg至 100mg/kg体重，优选以4-24小时的时间间隔施用几天、或几周、或几月、或长达1年和/或其中的任何范围或值的时间段，如0.001-0.01,0.01-0.1,0.05-100,0.05-10,0.05-5,0.05-1,0.1-100,0.1-1.0,0.1-5,1.0-10,5-10,10-20,20-50,和50-100mg/kg，例如0.05至100mg/kg，优选0.05至5mg/kg，例如0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,2,3,4或5mg/kg，以1-4,4-10,10-16,16-24小时为时间间隔，达1-14,14-28,或30-44天或1-24周或其中的任何范围或值的时间段。典型的施用时间安排包含1μg至100mg/kg/天。
本发明的化合物和/或组合物的施用的接受者可以是如本文中限定的任意受试者，优选人。
制剂/浓度
根据本发明的化合物或组合物可以多种形式施用。如此，它们可以配制为软膏剂、凝胶、糊剂、液体溶液、悬浮液、片剂、明胶胶囊、胶囊、栓剂(特别是用于与胃肠综合征有关的疼痛)、散剂、鼻滴剂或气雾剂的形式，优选为软膏剂的形式。本发明的化合物通常以软膏剂、凝胶、油、片剂、栓剂、散剂、明胶胶囊、胶囊等的形式施用，任何地通过确保延长和/或延迟释放的剂量形式或装置。对于该类型制剂，有利地使用试剂如纤维素、碳酸盐或淀粉。对于注射，所述化合物一般包装在液体悬浮剂的形式中，其可例如经由注射器注射或灌注。在该方面，所述化合物一般溶解于盐水，生理学，等渗或缓冲的溶液等中，其与药物用途相容且是本领域技术人员已知的。如此，组合物可含有一种或多种选自以下的试剂或赋形剂：分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等。可用于液体和/或可注射制剂中的试剂或赋形剂尤其是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯树胶(acacia)等。理解本领域技术人员根据患者、观察到的疼痛、要治疗的区域、涉及到的一种或多种活性化合物、施用模式等可以调整施用的流速和/或剂量。
对于局部应用，优选将要治疗的受试者在目标区域暴露于有效量的根据本发明的药物化合物或组合物，所述目标区域例如皮肤表面、粘膜等，其临近于要治疗的周围神经元。
典型地，根据之前提到的标准，使用是预防性还是治疗性的和采用的局部媒介物的性质，所述化合物以可在约50μg至约5mg/kg体重之间变化的本发明化合物的剂量施用。优选的施用是肌内或静脉内或腹膜内注射。此外， 通过注射施用可包含几次(2、3或4次)施用每日，如果需要的话。另外，对于长期治疗，延迟或延长的系统可能是有利的，从而确保受试者有效和持久的疼痛治疗。
本发明还涉及试剂盒，其包含(i)如先前描述的TAFA4化合物或组合物，和(ii)对疼痛有效的至少一种另外的不同活性化合物，和任选地(iii)使用该试剂盒的书面用法说明。
依照一个特定的实施方案，本发明还涉及适用于通过本文所述方法治疗的试剂盒。这些试剂盒包含(i)如先前描述的TAFA4化合物或组合物，通常以本文中指示的剂量，和(ii)含有止痛化合物，优选鸦片类化合物的第二组合物，其剂量相比于经典处方的剂量一般降低，用于以根据本发明的有效量进行同时、分开或序贯施用。
附图和实施例例示了本发明而不限制其范围。
实施例
I.实验规程
所有动物(小鼠)均在标准居住条件下维持(22℃，40％湿度，12h光周期和自由可获食物和水)。特别进行努力以最小化下面实验中使用的小鼠的数目以及应激和受苦。所有方案均符合欧盟对于动物实验的建议。
I.1.具有靶向性失活的TAFA4基因的tafa4-GFPKI小鼠的生成
为了生成tafa4-GFPKI小鼠，我们使用了在胚胎干细胞中的基于细菌人工染色体(BAC)的同源重组。最终靶向性载体在pBAC(RP23-427L8)中小鼠tafa4基因座的209kb基因组克隆的基础上构建，获自129SVJ“BACPAC”ResourcesCenter(BPRC)文库(图2A)。在使用质粒载体pL452和pCS2/venussv40已组装的中间靶向性构建体的帮助下工程化RP23-427L8BAC载体中的细菌重组。tafa4基因外显子1的109bp被“YFP(Venus，后文GFP)-聚AloxP-EM7-PGK-Neo-loxP”盒替换。以使用Taqphusion聚合酶(Finnzymes)得到的271bp和265bpPCR产物分离同源性臂。在细菌中BAC的同源重组后，使用AscI位点线性化最终靶向性构建体并转染到129/SV来源的胚胎干细胞CK35中。通过使用位于构建体3’端的探针的Southern印迹和通过新霉素探针鉴定同源重组克隆。在ImmunologyCenter转基因设施处将两个靶定克隆注射 到C57Bl6/J来源的胚泡中。将所得嵌合体与C57Bl6/J雌性交配以产生重组等位基因的种系传递。
将下列寡核苷酸用于基因分型PCR：
GFP436:GAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG,
1585:CTGTGGAGGAAATGGTTTCAACT,
1587:CTGCAAAGAGAAGCCAAAGCTAC。
使杂合雄性和雌性交配以生成手册的行为测试中描述的群体。为了提高GFP对于细胞和分子实验的可视化，我们还生成了TAFA4GFP-NEO-系。通过使TAFA4GFP/+小鼠与cre-deleter小鼠系杂交除去Neo盒。Neo盒的不存在由PCR确认。除了行为分析和来自具有附接的背根的脊髓薄片的全细胞膜片钳记录外，将Cre重组的TAFA4GFP小鼠用于所有实验。
I.2.组织切片和原位杂交/免疫荧光
为了获得成体组织，将小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(ketamine/xylazine)的混合物深度麻醉，然后用低聚甲醛4％于PBS(PAF)的冰冷溶液经心脏灌注。在解剖后，将其在相同固定剂中在4℃后固定(postfix)至少24h。P0收集到冰冷的PBS1X中，轻柔清洗，并在4％PAF中固定24h。对于皮肤免疫荧光，从麻醉的小鼠切取躯干皮肤并在15％(v/v)酸苦味酸–2％甲醛中在4℃直接固定24h。然后，将组织转移到30％(w/v)蔗糖溶液中用于冷冻保护，接着冷冻并储藏于-80℃。使用标准低温恒温器(Leica)将样品切片(12至40μm)。按照标准方案实施原位杂交和免疫荧光(Moqrich等,2004)。使用基因特异性PCR引物和来自胚胎或成年小鼠DRG的cDNA模板合成RNA探针(Tafa4,TH,Vglut3,TrkB,MrgprD,SCG10)。更具体地，使用地高辛和/或荧光素/生物素标记的探针的组合实施原位杂交。将探针在55℃过夜杂交，并将载玻片与辣根过氧化物酶抗地高辛/荧光素/生物素抗体(Roche)温育。使用荧光素/cy3/cy5TSAplus试剂盒(PerkinElmer)实现最终检测。对于双荧光原位实验，将第一抗体使用H2O2处理失活。
将以下寡核苷酸用于巢式PCR的探针合成：
tafa4-F1:TGCTCAGAAGTTCATAGCCAAA,
tafa4-R1:TAAAGGAACATTTGCAAGCTCA,
tafa4-F2:ATATGTGCAGTGTGG,
tafa4-R2+T7:TAATACGACTCACTATAGGGCAGCCAAGTTCAAAC,
TH-F1:AAGCCAAAATCCACCACTTAGA,
TH-R1:CCGTGGAGAGTTTTTCAATTTC,
TH-R2+T7:
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGCAAGTCCAATGTCCT,
Vglut3-F1:TAGCTCAGTTTCCAGGAATGGT,
Vglut3-R1:GGAGATCTAACAACATCTGATAACAC,
Vglut3-F2:CCCCCTAGAGTATCAGGAATTT,
Vglut3-R2+T7:
TAATACGACTCACTATAGGGTGGGAAGTTTTAAAAATCTATGATTAG,TrkB-F1:
CTGAGAGGGCCAGTCACTTC,
TrkB-R1:CATGGCAGGTCAACAAGCTA,
TrkB-F2:CAGTGGGTCTCAGCACAGAA,
TrkB-R2+T7:
TAATACGACTCACTATAGGGCTAGGACCAGGATGGCTCTG,
MrgprD-F1:GGGCATCAACTGGTTCTTACTC,
MrgprD-R1:AGGGATTGTCTTGACTGTCG,
MrgprD-F2:AACGGGATGTGAGGCTACTTTA,
MrgprD-R2+T7:
TAATACGACTCACTATAGGGATTTATGCCTTGACTTCCCTGA,
SCG10-F1:GCAATGGCCTACAAGGAAAA,
SCG10-R1:GGCAGGAAGCAGATTACGAG,
SCG10-F2:AGCAGTTGGCAGAGAAGAGG,
SCG10R2+T7:
TAATACGACTCACTATAGGGGGCAGGAAGCAGATTACGAG。
对于免疫荧光，将一抗在PBS-10％驴或山羊血清(Sigma)-3％牛白蛋白(Sigma)-0.4％TritonX-100中稀释并在4℃过夜温育。一抗浓度和参照为：家兔抗TrkA1:1000(Interchim)，山羊抗TrkC1:1000(R&DSystems)，山羊抗Ret1:500(R&DSystems)，家兔抗CGRP1:2000(Chemicon)，鸡抗绿色荧光蛋白(GFP)1:1000(AvesLabs)，家兔抗PKCγ1:1000(SantaCruzBiotechnology)，抗S1001:400(Dako)，和山羊抗小清蛋白(parvalbumin)1:1000(Swant)。将相 应的驴或山羊抗家兔、抗鸡和抗山羊Alexa488、555或647(Invitrogen或Molecularprobe抗体)用于次级检测。以1:100使用异凝集素IB4缀合物对AlexaFluorR568(IsolectinIB4ConjugatestoAlexaFluorR568)染料(Invitrogen)。
I.3.细胞计数和统计学分析
将胸(T12)和腰(L4)DRG的12μm系列切片分别分配到6和8个载玻片上并经受包括泛神经元标志物SCG10在内的不同标志物(subjectedtodifferentmarkersincludingthepan-neuronalmarkerSCG10)。除了提供神经元的总数之外，该办法还允许我们将所有计数表示为SCG10+神经元的百分比。对于每种基因型，在至少3个独立小鼠中计数到2至4个DRG。统计学显著性设为p<0.05并使用单向ANOVA继之以非配对t检验评估。
I.4.电生理学记录和钙成像
下文描述了DRG神经元培养物和来自具有附接的背根的脊髓薄片(fromspinalcordsliceswithattacheddorsalroot)的全细胞膜片钳记录以及钙成像方案：
用于膜片钳记录的DRG神经元培养物
将7至14周龄杂合或TAFA4无义(null)雄性小鼠使用氟烷(halothane)麻醉并通过依照实验室动物护理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)切断颈动脉处死。从切出的腰DRG实现DRG神经元的解离和培养并从其结缔组织鞘分离，如之前描述的(Hao和Delmas,2010,2011)。将其在含有2mg/ml胶原酶IA的酶溶液中在37℃温育45min和在Hank氏培养基(GIBCOBRL)中磨碎。将所得悬浮液铺板于用10ng/ml层粘连蛋白(laminin)(Sigma)包被的Nunclon皿中。培养基为Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)，其补充有10％热灭活的FCS、100U/ml青霉素-链霉素、2mMl-谷氨酰胺、25ng/ml神经生长因子(NGF7S,SigmaAldrich,France)和2ng/ml神经胶质来源的神经营养因子(GDNF,Invitrogen,France)(均来自GIBCOBRL)。在记录前神经元在潮湿空气(5％CO2,37℃)中维持12h。
全细胞膜片钳记录
使用具有范围为2至3MΩ的电阻的硼硅酸盐电极实施膜片钳记录。Nav1.8和ICaT的记录使用基于CsCl的移液管溶液，其组成为(mM)：125CsCl, 10Hepes,5NaCl,0.4NaGTP,4MgATP,1MgCl2,4.8CaCl2和10EGTA(用CsOH调整为pH7.3)。IKA，h电流和MA电流使用基于KCl的移液管溶液记录，其含有(mM)：134KCl,10Hepes,4MgATP,0.4NaGTP,1MgCl2,4.8CaCl2,10EGTA(pH7.3)。将相同的基于KCl的移液管溶液用于电流-钳记录。标准的外部溶液组成为(mM)：132NaCl,1KCl,1MgCl2,2.5CaCl2,10HEPES,10D-葡萄糖和TTX(500nM,AscentScientific)(用NaOH调整为pH7.3，300mOsm/l)。以2-3ml/min的流速将神经元用浴溶液灌注。
机械刺激
在别处已详细描述了使用压电(piezoelectrically)驱动的机械探针的机械刺激(Hao和Delmas,2010)。简言之，将粘固于压电操动件(StepDriverPZ-100；Burleigh)的火炼(fire-polished)玻璃微量移液器用作机械探针并以离水平45°角放置。探针朝细胞的向下移动由pClamp程序(MolecularDevices)驱动。探针在向前移动命令的缓变部分(rampsegment)期间具有800μm/s(否则注意到)的速度，且应用刺激的持续期间范围在200ms至几秒。除非另外指出，以-100mV的保持电位记录电压钳MA电流。
使用Chebyshev非线性最小二乘方拟合程序(Hao和Delmas,2010)将MS电流衰变的时间常数与指数拟合。当前的迹线(trace)使用单指数或双指数函数拟合。双指数函数如下：I(t)＝A1·exp(-t/τ1)+A2·exp(-t/τ2)+Ao，其中τ1和τ2代表快速和缓慢指数分量(component)，A1和A2代表每个相应分量的幅度(amplitude)，而Ao代表基线电流。具有超过两个指数分量的拟合未显著增强电流衰变的描述，如由残差分析(residulanalysis)评价的。如果在-100mV引发的电流的主分量(≥80％)单指数衰退，则细胞归类为表达特定的MS阳离子电流。不满足该要求的MS电流归类为混合型的。基于目前的衰变时间常数，可以区分3种类型的MS电流：快速适应电流(adaptingcurrent)(IR,3–6ms)、缓慢适应电流(IS,200–300ms)和超缓慢适应电流(IuS.,≥1000ms)。
数据采集和分析
使用Axopatch200B放大器(MolecularDevices)进行电压和电流记录，在1kHz过滤并以40–100μs取样。使用75–85％系列电阻补偿(seriesresistancecompensation)将电压误差(voltageerror)最小化。细胞电容从通过10mV超极化步骤瞬时引发的电流的衰变相的时间常数估测。所有实验均在室温完成。 将PRISM4.0(GraphPad)软件用于实施数据分析。结果呈现为均值±SEM且n代表检查的神经元的数目。统计学分析使用Student'st检验且P<0.01被视为统计上显著的。
来自具有附接的背根的脊髓薄片的全细胞膜片钳记录
按照Mourotetal(Mourot等,2012)中描述的方案，制备来自幼年(P21至P34)TAFA4无义和WT小鼠的具有附接背根的横向脊髓薄片用于进行全细胞记录。将小鼠用异氟烷深度麻醉，接着快速取头部。在椎板切除术(laminectomy)后，快速取出含有脊柱和周围肌肉的组织片并浸没在冰冷的加氧低钙人工脑脊髓液(ACSF)中(按mM：NaCl101；KCl3.8；MgCl218.7,MgSO41.3；KH2PO41.2；HEPES10；CaCl21；葡萄糖1)，轻柔地移出脊髓并将其腰椎部分置于小3％琼脂糖块中。在开始膜片钳记录之前，使用LeicaVTS1000振动切片机切取脊髓切片(300μm厚)并转移到用95％O2-5％CO2平衡至少1小时的温(31℃)ACSF(按mM：NaCl130.5；KCl2.4；CaCl22.4；NaHCO319.5；MgSO41.3；KH2PO41.2；HEPES1.25；葡萄糖10；pH7.4)中。将脊髓切片置于以温(31℃)ACSF为浴的记录室中。使用multiclamp2B(Moleculardevices)在OlympusBX51显微镜的控制下实施电生理学测量。将膜片移液管(7-11Ω)用适宜的移液管溶液(按mM：KGluconate120；KCl20；CaCl20.1；MgCl21.3；EGTA1；HEPES10；GTP0.1；cAMP0.2；亮肽素(Leupeptin)0.1；Na2ATP3；D-甘露醇77；pH7.3)填充。对于T型钙电流的测量，膜片移液管具有以下浓度(按mM：甲烷磺酸Cs盐(CsMethaneSulfonate)120；CsCl20；CaCl20.1；MgCl21.3；EGTA1；HEPES10；GTP0.1；cAMP0.2；亮肽素0.1；Na2ATP3；D-甘露醇77；pH7.3)，并添加TTX(0.5μM),CNQX(5μM),DL-APV(10μM),番木鳖碱(strychnine)(10μM),荷包牡丹碱(bicuculline)(5μM)和TEA(2.5mM)至ACSF以阻断钠电压激活的和突触性电流。使用连接于Master8(A.M.P.InstrumentLtd)刺激器的玻璃吸附电极来刺激背根。典型地，使用高持续时间(500μs)高强度刺激(350μA)来在记录的薄片中募集大部分初级传入纤维。未校正液体接界电位(计算值-16.5mV)。
脊髓层Iii(spinalLaminaeIIi)记录的中间神经元的分子鉴定
为了确定记录的层II神经元的神经递质表型，将生物胞素(Biocytin)以0.5％添加到移液管记录溶液中。在记录结束时，小心取出膜片移液管以尽可能多的保留记录的神经元的完整性。然后，将脊髓切片在4℃在4％PFA中过 夜固定并在-4℃在0.5％PFA中保持用于生物胞素和GAD的后期揭示。将切片在PBST中漂洗3次并与一抗(抗GAD6567,sigmaG5163,1/2000于PBST0.5％BSA中)在4℃温育48小时。将切片在PBST中漂洗3次并在二抗(山羊抗家兔alexa568,MolecularProbesA-11011,1/500)和链霉亲合素alexa488(invitrogenS-11266,1/500)的混合物中过夜温育。将切片在PBST中漂洗3次，并封固在Dako荧光封固剂中。使用x63油浸物镜在LeicaSPE共焦显微镜上实施采集。
Ca2+成像
将来自杂合子或敲除7至14周龄TAFA4小鼠的腰椎DRG神经元接种于用层粘连蛋白包被的玻璃底室(fluorodishWPI)上，并在37℃在B27补充的NeurobasalA培养基(Invitrogen,France)中培养16-22小时，所述培养基具有100ng/mlNGF7S(SigmaAldrich,France),2ng/mlGDNF(Invitrogen,France)和10ng/mlNT4(Peprotech,France)。钙成像在接种后12-17小时实施。在记录之前，将神经元与5μMfura-2AM在Tyrode氏溶液中在37℃温育1小时。荧光测量使用装备有coolsnapHQ照相机(RoperScientific,France)的倒置显微镜(OlympusIX70)进行。Fura-2在340nm和380nm激发且在510nm的发射荧光比与浴温度使用Metafluor软件(UniversalImaging)同时获得。温度用重力驱动的灌注(1-2ml/min)控制，用与电阻加热器(CellMicroControls)串联嵌入的peltier装置降温。在应用于室上之前，灌注首先在12℃冷却然后在37℃加热。用位于灌注出口附近(总是在同一位置)的热敏电阻器探头监测温度。通过关闭加热实现的从37℃至低于15℃的快速降温通常费时不到40秒。将几种瞬时受体离子通道的药理学激动剂(100μM薄荷醇、100μM异硫氰酸丙烯酯(AITC)、0.5μM辣椒素、10μM孕烯醇酮硫酸盐)制备到Tyrode溶液中并在37℃序贯施用到神经元达几秒。对于等渗和低渗刺激，制备胞外溶液，其保持NaCl的浓度恒定且改变manitol的水平以调控渗量(osmolarity)。等渗溶液(300mOsm)含有(按mM)：87NaCl,100甘露醇,3KCl,1MgCl2,2.5CaCl2,10Hepes,10葡萄糖；而低渗溶液(200mOsm)含有(按mM)：87NaCl,51甘露醇(Manitol),3KCl,1MgCl2,2.5CaCl2,10Hepes,10葡萄糖。数据使用metafluor、excel和graphpadprism线下分析。
II.行为测定
在8-12周龄同窝出生雄性小鼠上进行所有行为分析(开场(Open-field)、转杆(Rotarod)、热板(Hotplate)、冷板(Coldplate)、热梯度(ThermalGradient)、两温度选择、热伤害感受性阈值(Hargreave氏测试)、发痒测试(Itchtest)、VonFrey、动态VonFrey和福尔马林测试)。下文提供了对所有这些测试的详细描述。下文还描述了完全弗氏佐剂(CFA)和角叉胶后爪注射、鞘内注射重组TAFA4和长期压缩坐骨神经(CCI)。Studentt检验用于所有统计学计算。
更具体地，在具有混合的C57BL6/129SV遗传背景的8-12周龄同窝出生小鼠上进行所有行为测定。在所有在室温(～22℃)完成的实验之前，使动物对其测试环境适应20分钟。实验组在测试期间不知晓小鼠的基因型。Student’st检验用于所有统计学计算。所有误差棒代表均值的标准误差(SEM)。一般行为(运动和学习活动)使用转杆装置(LSILeticaScientificInstruments)测量。梯度、热板、开场、Hargreaves和VonFrey装置均来自Biosebinstruments。
II.1.一般行为测定
II.1.A.开场测试
开场测试普遍用于评价运动、试探和焦虑样行为。它由被墙壁包围以防止动物逃脱的空旷且明亮的方形场所(40x40x35cm)组成。将动物各自放在场所的中央，并在5分钟时段内用摄像机记录其行为。焦虑相关的行为通过由Bioseb跟踪软件分析的啮齿动物避免中央区域(20x20cm)的程度来测量。
II.1.B.转杆测试
使用转杆装置(LSILeticaScientificInstruments)来探索小鼠中的协调运动、平衡和学习机能。将小鼠置于杆上，杆在5分钟内从4rpm缓慢加速到44rpm恒定旋转速度，并记录在该时段内落下的等待时间。测试连续进行4天。每天对动物测试3次，相隔至少5min休息时段。如(Moqrich等,2005)中描述的实施对温度选择测试的应答和对温度梯度测定的应答，不过使用Bioseb装置。
II.2.热敏感性测试
II.2.A.热板
为了评估热敏感性，通过Plexiglass柱体20cm高将小鼠各限于维持在48 ℃，50℃或52℃的金属表面，并测量对伤害感受性反应(舔，摇动或后爪的跳跃)的等待时间(latency)。为了防止组织损伤，将小鼠在伤害感受性响应后或在最多分别90，60秒和45秒后，立即从板上移开。每个小鼠经测试两次，每次测试之间5分钟的等待时间；撤回时间对应于两次测量的均值。考虑每个测试温度之间至少有1小时的等待时间。
II.2.B.冷板
为了测试冷敏感性，将小鼠各置于维持在22°、10°或4℃的plexiglass室中。测量在头一分钟内小鼠的后腿站立时间。将每只小鼠对每个温度暴露3次，在试验之间最小有5分钟休息时段，且在温度之间有1小时分隔时段。
II.2.C.热梯度测试
该测试之前已有描述(Moqrich等,2005)。简言之，在热梯度装置(Bioseb)的4个分开的场所追踪单个小鼠90min。使用位于铝地板的每端的两个Peltier加热/降温设备，维持14℃至53.5℃的受控和稳定的温度梯度。将每个场所肉眼分成15个具有不同且稳定温度的大小相等的地带(8cm)。追踪使用由制造商提供的软件控制的摄像机进行。
II.2.D.两温度选择测试
将两只小鼠同时放置到两温度选择装置(Bioseb)的每一道中。使用Bioseb软件追踪小鼠10min。在第一天内，两个板在10min期间均保持在20℃。在该适应阶段后的数天，将2个板各自升温或降温至不同的温度(42℃至16℃)并在适宜温度保持用于10min测试。在2次不同测试之间考虑1h时间间期。
II.2.E.热伤害感受性阈值(Hargreave氏测试)
为了评价后爪热敏感性，使用足底测试装置(Bioseb)进行Hargreave氏测试。将小鼠各自置于在升高的玻璃平台上的Plexiglass室中并允许在测试前适应至少30分钟。然后，经由玻璃板对爪的无毛表面施加具有恒定强度的移动性辐射热源，测量爪撤回的等待时间。爪撤回等待时间报告为对于两只后爪在测量之间至少5min中止的3次测量的均值。将IR源调整为20％，且应用20s的截留(cut-off)以避免组织损伤。
II.3.机械敏感性测试
II.3.A.动态VonFrey
为了评价后爪机械敏感性，使用Bioseb装置进行动态VonFrey测试。在 20s内使用高达7g的递增强度应用Vonfrey细丝。将注射和未注射后爪挤压3次，之间至少有5min等待时间，计算撤回的平均(g或秒)。
II.3.B.VonFrey细丝测试
对于长期收缩模型，我们使用具有3种不同弯曲力(0.07,0.6和1.4g)的VonFrey发丝。对于角叉胶模型，使用具有4种不同弯曲力(0.07,0.4,0.6和1.4g)的VonFrey发丝评价机械性触诱发痛和痛觉过敏。详情参见“单侧周围单一神经病”和“角叉胶注射”段落。
II.4.化学敏感性测试
II.4.A.福尔马林测试
从福尔马林储液(FischerScientific)(注意福尔马林储液对应于37％甲醛溶液)在PBS1X中以2％制备福尔马林溶液。使小鼠各自居于Plexiglass室中，允许习惯测试环境30分钟。在左后爪的皮下注射10μl福尔马林后，将动物各自立即置于观察室中，然而监测疼痛行为(晃动、舔和咬注射的爪)达60min。以5分钟时间间隔计算注射爪的疼痛行为累积时间。对第一阶段(0-10min)和第二阶段(10-60min)记录展现这些疼痛行为花费的时间。
II.4.B.使用致瘙痒剂48/80的发痒测试
致瘙痒剂48/80(Sigma-Aldrich,C2313)在PBS1X中以2μg/μl制备。将100μg(50μl)注射到小鼠颈。计算发痒累积时间达40分钟。
II.4.C.CFA注射
使用Hamilton注射器将10μl的完全弗氏佐剂(CFA)注射到麻醉小鼠的左后爪中，以产生炎症和在伤害感受性感知中的改变。在注射后24小时，评价注射爪中急性炎症的迹象，如水肿和发红。在注射前(第0天)以及CFA注射后1、3和7天(仅对于机械性)测量对热和机械刺激的应答。未注射的右后爪充当对照。
II.4.D.角叉胶注射
使用Hamilton注射器将20μlPBS1X中1％λ-角叉胶Sigma-Aldrich,22049-5G-F)注射到小鼠左后爪中。
对于角叉胶模型，在注射之前和之后使用具有4种不同弯曲力(0.07,0.4,0.6和1.4g)的VonFrey发丝评价机械性触诱发痛和痛觉过敏。对于每种细丝，应用两次五种刺激，时间间隔为3至5秒。未注射的右后爪充当对照。
II.4.E.单侧周围单一神经病
对于坐骨神经长期收缩(CCI)模型，在用氯胺酮(40mg/kgip)和甲苯噻嗪(5mg/kgip)麻醉的小鼠中诱导单侧周围单一神经病(Unilateralperipheralmononeuropathy)，将3个铬肠线(4_0)绑带松散地(有约1mm间隔)绑在总坐骨神经(commonsciaticnerve)周围(Bennett和Xie,1988)。
将神经收缩至几乎不能区分的程度，从而使得经由神经外膜血管系统的循环不被中断(Descoeur等,2011)。对于长期收缩模型，在手术之前和手术后每隔5天使用具有3种不同弯曲力(0.07,0.6和1.4g)的VonFrey发丝评价机械性触诱发痛和痛觉过敏。对于每种细丝，应用两次五种刺激，时间间隔为3至5秒。
II.4.F.鞘内注射重组TAFA4
体积为10μl的TAFA4(200μg/ml，人重组TAFA4,R&Dsystems)或媒介物(PBS)的鞘内(i.t.)注射在福尔马林测试前15min完成。通过腰带将小鼠放在一只手中，并将连接于20μlHamilton注射器的25号针插入腰椎骨L5和L6之间的蛛网膜下间隙中，直至引发甩尾。
III.结果
III.1.TAFA4是C-LTMR的特异性标志物
有意思的是，发明人发现Tafa4转录物在成年DRG和三叉神经神经元中高度富集。使用原位杂交，发明人证明Tafa4转录物分别在总的腰(L4)和胸(T12)成年DRG神经元的约8％和19％中表达(图1A)。双荧光标记实验显示Tafa4从TrkA+神经元完全排除，并鉴定出Ret+神经元的子集(图1C和1D)。TAFA4+神经元不结合IB4且完全不同于mrgprd+神经元(图1E和1F)。相比之下，TAFA4主要与TH和VGLUT3共表达(图1G)。使用VLUT3-EGFPDRG切片(Seal等,2009)，发明人发现92+/-4％的TAFA4+神经元共表达EGFP且94+/-6％的EGFP+神经元共表达TAFA4(图1H)，从而鉴定了TAFA4是C-LTMR的特异性标志物。与TH和VGLUT3形成对比的是，TAFA4几乎局限在DRG和三叉神经神经元，在中枢神经系统神经元(即在松果体缰中和脑干及下丘脑的核中的神经元分散群体中)低表达。
III.2.表达TAFA4的神经元展现机械-伤害性感受器的特性
为了研究TAFA4在C-LTMR中的作用，发明人生成了敲入小鼠模型，其允许遗传性标记表达TAFA4的神经元并以靶向性方式(即不影响未知基因)消除TAFA4蛋白(图5A)。发明人首次确认TAFA4转录物在TAFA4GFP/GFP纯合小鼠(本文中的TAFA4无义小鼠)中完全消除(图5B和5C)。GFP+神经元中心投射到层II的最内层并专有地周围性促使皮肤的多毛部分受神经支配(projectedtotheinnermostlayeroflaminaIIcentrallyandexclusivelyinnervatedthehairypartoftheskinperipherally)(图5G-5J)。
使用膜片钳记录和钙成像，发明人发现GFP+神经元展现C-无髓鞘伤害性感受器的许多特性，包括小细胞电容、高输入电阻、短持续时间动作电位没有在复极化阶段中的突出峰、和TTX抗性Nav1.8、低阈值T型Ca2+(ICaT)、A型K+电流(IKA)和超极化激活的h(Ih)电流的显著的伴随表达(图2A-2C)。ICaT介导的反弹电位也在复极化时典型观察到(图2D)。IKA的激活在分别应答正或负电流步骤的动作电位(AP)或反弹电位的发生中导致延迟(图2D和6)。这些不同电流的同质性存在以独特的方式塑造了细胞放电(cellfiring)，由于Ih对负电流步骤有去极化"sag"应答且应答去极化电流步骤在AP放电中有‘缺口’。这些激活特性可用作将表达TAFA4的神经元分类的特定标准。
GFP+神经元不应答许多假定的伤害感受性试剂(包括辣椒素、薄荷醇、孕烯醇酮硫酸盐和5HT)或快速降温(图2E)。相反，GFP+神经元展现出对TRPA1激动剂、异硫氰酸丙烯酯(AITC)和对低渗溶液(图2E)的不同应答，表明在C-LTMR中的一些功能异质性。
使用离体皮肤神经制备物已确定了C-LTMR的经典特征，包括缓慢传导速度、应答轻微机械力的突起队伍(trainsofspikes)和对持续机械刺激的缓慢适应(Bessou等,1971；Li等,2011；Seal等,2009；Woodbury等,2001)。对GFP+神经元的细胞体应用机械力揭示了在测试神经元的95％中存在机械性激活的(MA)阳离子电流(图2F和2G)。尽管偶尔可能遇到快速适应的MA电流(15％)，但缓慢和超缓慢适应的MA电流在GFP+神经元中为主要的(分别为21.3和57.9％)(图2F)。所有这些电流是阳离子和非选择性的，具有范围从-2至+4mV的逆转电位。与MA电流的缓慢适应特性一致，缓慢速度变化刺激能触发AP(图2G)，指示机械感觉性GFP+神经元应答缓慢运动刺激。
结论为，所有上述表达数据与钙成像和电生理学记录组合，显示TAFA4+神经元展现出C-无髓鞘机械-伤害性感受器的生理学特性。
III.3.TAFA4无义小鼠形成严重的损伤诱导的机械和化学超敏性
为了洞察TAFA4在C-LTMR中的功能作用，发明人对TAFA4无义小鼠进行在急性、炎性和神经病疼痛条件下的大批体觉测试。TAFA4无义小鼠就体重、开场(图6A)和转杆(图6B)概况(profiles)而言似乎正常，证明TAFA4无义小鼠在运动活性或焦虑中无异常。发明人发现在热板中(图6C)、趋温性梯度测定中(图6D)或Hargreaves测(图6E)试以及冷板、两温度选择和动态冷和热板测试中WT和TAFA4无义小鼠之间无差异。然后，发明人测试了TAFA4无义小鼠在急性、炎性和神经病疼痛条件下感知机械刺激的能力。
在完全弗氏佐剂(CFA)模型中，使用自动化VonFrey装置测量机械敏感性(图3A)。两种基因型均显示在CFA注射后24小时对于处理爪的撤回阈值的显著降低。当在CFA后3天测试时，TAFA4无义小鼠相比于WT小鼠展现显著降低的撤回阈值。
在炎症后7天两种基因型实现完全恢复。为了进一步探索TAFA4在机械敏感性中的作用，发明人使用VonFrey细丝应答角叉胶(图3B-3E)。与CFA模型一致，TAFA4无义小鼠在处理后3天和7天时显示应答所有测试细丝的延长的疼痛超敏性。非常有意思的是，使用包括最细口径0.07和0.4g的所有细丝，TAFA4无义小鼠在早至角叉胶处理后1和3小时就显示出增强的机械超敏性，表明TAFA4在触觉触诱发痛中的重要作用(图3B-3E)。
最后，为了评价TAFA4在神经病疼痛中的作用，发明人使用了坐骨神经长期收缩(CCI)模型(图3F-3H)。TAFA4无义小鼠对于所有测试的细丝展现出延长的机械超敏性表型，从而证明了TAFA4在神经病疼痛中的作用。
III.4.人重组TAFA4在TAFA4无义小鼠中完全拯救了机械和福尔马林诱导的疼痛超敏性
在角叉胶后7天或CCI后30天鞘内施用2μg的人重组TAFA4均将在TAFA4无义小鼠中观察到的超敏性表型逆转至WT水平(图3B-3H，第7天+TAFA4和第30天+TAFA4)。
为了测试TAFA4无义小鼠中增强的机械超敏性是否是形式(modality)特异性的，发明人实施了福尔马林测试(图3I和3J)。足底(Intraplantar)注射10μl的2％福尔马林在两种基因型中触发了有力的第一疼痛应答。TAFA4无义小鼠 在第二阶段展现急剧升高的应答，表明在这些小鼠中增强的中枢敏化。重要的是，在福尔马林注射前15分钟鞘内施用TAFA4使得TAFA4无义小鼠中的福尔马林诱导的超敏性逆转至WT水平(图3K)。
总之，上述结果证明需要TAFA4来维持损伤诱导的机械和化学疼痛超敏性的正常阈值。
III.5.TAFA4无义小鼠中的层IIi神经元展现增加的兴奋性
为了进一步探索由TAFA4丧失诱导的中枢敏化表型，发明人实施了在来自WT(n＝19)和TAFA4无义小鼠(n＝25)的背根附接的脊髓薄片中的层IIi神经元的全细胞记录。然而，注射具有递增幅度(0-50pA)的去极化电流脉冲在TAFA4无义神经元中比在WT中引发更多的动作电位(图4A1和4A2,ANCOVA,p<0.001)。该效应在去极化电流脉冲开始时甚至更为突出，因为在适应与WT神经元的那些可比的放电速率之前，TAFA4无义神经元在电流脉冲开始时显示增加的放电频率(图4A3)。此外，注射超极化电流脉冲(-50或-25pA)在TAFA4无义神经元中比在WT中引发更高的反弹AP(图4A1和4A4，分别为p＝0.049和p＝0.001)。总之，这些数据显示TAFA4无义小鼠中层IIi神经元的增加的兴奋性。
在TAFA4无义小鼠中观察到的差异显示对缓慢失活低阈值电流的不同调节。为了表征这些电流，发明人使用对称电压缓变方案(-40至-120并返回至-40mV)测量了以-40mV在层IIi神经元中引发的向外电流。虽然在WT神经元中在爬升电压缓变结束时能观察到具有缓慢脱敏的向外电流，但该电流在TAFA4无义神经元中几乎不存在(图4B1和4B2,p＝0.001)。由于鞘内施用的重组TAFA4减少了有损伤的TAFA4无义小鼠中的过大疼痛行为，发明人检查了对来自TAFA4无义小鼠的层IIi神经元上添加重组人TAFA4的作用。发明人发现外源应用TAFA4(20-30mn,20nM)诱导了向外电流的表达，类似于在对照条件下(即无TAFA4)在来自WT动物的神经元中观察到的(图4C1和4C2,n＝19,p<0.001)。该电流未受外部TEA(2.5mM,n＝3)影响，但被4AP(1mM)完全阻断，如此证明牵涉A型电流药理学即钾离子通道。这些作用是TAFA4特异性的，因为添加重组TAFA5(n＝5,图4D1和4D2)或TAFA2(n＝6,图4D2)不能从TAFA4无义神经元引发这种低阈值向外电流。
在TAFA4添加后，通过两条高斯曲线的混合最佳拟合层IIi神经元中向外 电流强度的分布，从而揭示两种不同群体的存在：三分之一的神经元展现显著的向外电流而剩余神经元微弱地或不受TAFA4浴应用影响(图4E1)。对TAFA4应答神经元的表型表征显示TAFA4在GAD阳性和GAD阴性神经元两者中引发类似的向外电流(图4E2)。
该实验数据显示TAFA4压制谷氨酸能(glutamergic)兴奋性(GAD-)和GABA能(GABAergic)抑制性中间神经元(GAD+)的子集，优选地通过激活低阈值向外电流。具体地，由于兴奋性传递似乎在脊髓胶状质(substanciagelatinosa)(对应于脊髓层II)中主导感觉处理，通过TAFA4对GABA能和谷氨酸能神经元的这类双重压制的净结果将由兴奋性传递中的降低主导，由此降低传递到层I投射神经元的伤害感受性信息的量。如此，根据本发明的TAFA4化合物通过降低脊髓中间神经元中的兴奋性传递减少伤害感受性信息。
在低阈值电流中，Ih和T型钙电流也可以塑造层IIi神经元的激活。为了表征WT和TAFA4无义小鼠中的Ih样电流，发明人量化了超极化引起的sag，其通过测量应答超极化电流脉冲的峰和稳定态电位之间的差异(图7B1)。发明人发现由方波电位脉冲(squarepotentialpulse)(见方法)引起的分离的T型电流在WT中经常比TAFA4无义小鼠中弱(图7C1)。统计学分析揭示了在TAFA4无义层IIi神经元中相比于WT在T型电流密度中的显著增加(图7C2；p＝0.001)。
总之，上述结果指示TAFA4直接或间接调控层IIi神经元中低阈值向外电流的强度。
IV.鞘内TAFA4在有神经病疼痛的动物中的止痛效果
IV.1.神经病疼痛模型SN1
使用SNI模型(SparedNerveInjury，由Decosterd和Woolf开发,2000；疼痛,Vol.87,p149–158)。SNI模型包含胫骨分支和坐骨神经的腓总神经的横切面：腓肠神经保持完整。然后后者形成神经病疼痛的迹象，具有实质性的机械性触诱发痛。SNI模型具有许多优点：
.神经病疼痛是持续的。这允许在重复TAFA4的注射时把握住惯化现象。
.生成的疼痛是有力的。
.模型是完全可复制的。
IV.2.剂量-效果研究
为了测定最佳浓度，在《快速》炎性疼痛模型上进行第一测试(1％角叉胶)。
方法：
使用18只8周龄的雄性TAFA4–KO小鼠。
将重组人TAFA4(#5099–TA,R&D,批次#PXC0213101)以3种不同浓度(12.5μg/mL,50μg/mL和200μg/mL)重悬于0.9％NaCl中。
使用上/下调方法的VonFrey细丝测量来测定基线。
在后爪中足底注射20μl的角叉胶(1％)。
在注射后4h测量应答阈值以检查炎性疼痛的发生。
24h后，进行新的测量。
然后，实施盲式鞘内注射3种不同浓度的10μlTAFA4溶液(n＝6至12.5μg/mL；n＝5至50μg/mL；n＝6至200μg/mL)。
在注射后30分钟进行对应答阈值的测量。
结果：
结果显示于图8。在注射角叉胶后4小时观察到机械触诱发痛的发生，且在24h后维持。注射10μl的每种TAFA4溶液诱导了对Vond’rFrey细丝的阈值应答中的强烈增加。3种测试的浓度在由角叉胶诱发的疼痛中诱导了统计学显著的降低(*p<0.05)。
将这些浓度(12.5；50和200μg/mL)用于随后测试通过在SNI神经病疼痛模型上鞘内注射的TAFA4的止痛效果。
IV.3.SNI动物中的鞘内注射
方法：
实验在8周龄WTC57Bl6小鼠上进行。使用42只小鼠。将重组人TAFA4(#5099–TA,R&D,批次#PXC0213101)以3种不同浓度(12.5μg/mL,50μg/mL和200μg/mL)重悬于0.9％NaCl中。将200μg/mLBSA溶液用作阴性对照。在通过上/下调方法使用VonFrey细丝测量了小鼠的基底阈值后，将SNI模块设定到位。将小鼠麻醉，执行胫骨神经和腓骨神经的绑扎，然后切断这两个神经。保持完整的腓肠神经相当快地形成神经病。手术后3天，确定神经病的发生。由此观察到身体同侧爪的应答阈值到VonFrey细丝的降低。
手术后7天，再次测量应答阈值。然后盲式鞘内注射10μl的3种TAFA4 溶液的每种(n＝10为12.5μg/mL；n＝10为50μg/mL；n＝9为200μg/mL)和BSA溶液(n＝10)。
在注射后30分钟、2小时、4小时、6小时和24h测量应答阈值。
结果：
结果呈现于图9。在鞘内注射后，注射后快达30分钟时就观察到对于3种TAFA4溶液应答阈值的显著增加。在另一方面，BSA的注射对于小鼠的应答阈值无影响。2h后，对于3种浓度止痛效果维持在其最大值处。4h后，接受2μgTAFA4注射的小鼠仍展现出高应答阈值(**:p<0.01；*:p<0.05)。在TAFA4或BSA溶液的鞘内注射后，我们还监测了对侧爪的应答，且未观察到统计学差异(见图10)。
这些结果显示3种测试的TAFA4浓度的鞘内注射导致对神经病疼痛的实质性可比的止痛效果。最强浓度(200μg/ml，即2μgTAFA4)的效果持续更久。此外，TAFA4不抑制感觉神经元的神经脉冲活性，如由缺少对侧爪应答中的变化指示的。
V.皮下TAFA4在有神经病疼痛的动物中的止痛效果
该例子例示了在皮下注射后TAFA4对神经病疼痛模型的止痛效果。
V.1.剂量-效果研究
为了掌握可以皮下测试的剂量，在有限数目的TAFA4–KO小鼠上进行对炎性疼痛模型(1％角叉胶)的第一《快速》测试。
方法：
使用9只8周龄的雄性TAFA4–KO小鼠。将重组人TAFA4(#5099–TA,R&D,批次#PXC0213101)以2种不同浓度(10μg/mL和30μg/mL)重悬于0.9％NaCl中，用于10μl注射每克。通过上/下调方法施工VonFrey细丝测量来测定基线。在后爪中足底(intraplantar)注射20μl的角叉胶(1％)。对于实验者，在注射后24h测量应答阈值，接着盲式皮下注射2种不同浓度的TAFA4溶液(n＝3为100μg/kg；n＝3为300μg/kg)或30mg/kg的普瑞巴林溶液(n＝3)。
在化合物注射后30分钟和其后2h和4h时测量应答阈值。
结果：
结果显示于图11。在注射角叉胶后，小鼠形成机械性触诱发痛。普瑞巴林的注射导致应答阈值的增加。类似地，TAFA4的注射在100μg/kg也诱导应 答阈值的统计学显著的增加，且在300μg/kg甚至更强。
通过在角叉胶模型中皮下注射，TAFA4由此产生止痛效果。
V.2.SNI动物中的皮下注射
方法：
实验在8周龄雄性WTC57Bl6小鼠上进行。使用48只小鼠。将重组人TAFA4(#5099–TA,R&D,批次#PXC0213101)以3种不同浓度(3μg/mL,10μg/mL和30μg/mL)重悬于0.9％NaCl中。将30μg/mLBSA溶液用作阴性对照。在通过上/下调方法使用VonFrey细丝测量了小鼠的基底阈值后，将SNI模块设定到位。将小鼠麻醉，执行胫骨神经和腓骨神经的绑扎，然后切断这两个神经。保持完整的腓肠神经相当快地形成神经病。手术后3天，确定神经病的发生。由此观察到身体同侧爪的应答阈值到VonFrey细丝的降低。
手术后7天，再次测量应答阈值。然后对于实验者，盲式皮下注射100μl/10g的每种TAFA4溶液(n＝11为30μg/kg；n＝12为100μg/kg；n＝11为300μg/kg)和BSA溶液(n＝12)。
在注射后1小时、2小时、4小时、6小时和24h测量应答阈值。
结果(图12)：
注射后快达1小时时，皮下注射TAFA4即诱导应答阈值的强烈增加。对于3种测试浓度该效果维持至少4h。如对于鞘内注射的，该效果似乎用更高浓度持续得更长。
因此，皮下注射TAFA4诱导对通过SNI神经病疼痛模型诱发的机械性触诱发痛的止痛效果。将300μg/kg的浓度用于继续该研究。
VI.TAFA4诱导持续的止痛效果而无副作用
这些实验的目的是通过在SNI模型中的皮下注射进一步确认TAFA4的止痛效果，并通过实现几个注射点检查该效果得到维持且是安全的。
方法：
实验在8周龄雄性WTC57Bl6小鼠上进行。使用24只小鼠。将重组人TAFA4(#5099–TA,R&D,批次#PXC0213101和#PXC0214011)重悬于30μg/mL的0.9％NaCl中。将30μg/mLBSA溶液用作阴性对照。在通过上/下调方法使用VonFrey细丝测量了小鼠的基底阈值后，将SNI模型设定到位。将 小鼠麻醉，执行胫骨神经和腓骨神经的绑扎，然后切断这两个神经。保持完整的腓肠神经相当快地形成神经病。
手术后7天，观察到身体同侧爪的应答阈值到VonFrey细丝的降低。然后盲式皮下注射10μl/g的TAFA4(300μg/kg)和BSA溶液(对于BSA和TAFA4组的每一个，n＝12)。在注射后1小时、2小时、4小时和6小时测量应答阈值。相同的实验规程在手术后7天、14天和21天进行。
结果(图13)：
在术后7天、14天和21天皮下注射300μg/kg的TAFA4之后观察到对机械性刺激的应答阈值的强烈增加。可以达到初始值(手术前)的约40–50％。在3种情况中，效果保持类似(没有显著差异)，如由对曲线下面积的分析指示的。
因此，这些结果确认了本发明的TAFA4蛋白或激动剂的有力止痛效果。
切除经皮下处理的动物的多个器官(肝、脾、肾、心脏和肺)并冷冻用于后续研究。在整个实验中监测经处理动物的重量。在重量曲线(图14)中没有观察到差异。此外，在放置于4％低聚甲醛(PFA)于4℃过夜之前，以精度量表对多种切除的器官称重，然后在蔗糖30％中温育，之后低温保存于–80℃OCT中。在经处理和对照动物之间在所有测试的器官(肝、脾、肾、心脏和肺)上没有观察到差异。
我们的结果因此显示TAFA4蛋白在SNI神经病疼痛模型中的效果。由该模型诱导的机械性触诱发痛(应答阈值的降低)可通过鞘内或皮下注射TAFA4来抑制。重要的是注意到使用的剂量较低(鞘内2μg和皮下6–8μg)。另外，在注射TAFA4后对侧爪的应答阈值保持未变，如此显示TAFA4不充当阻断神经脉冲的药剂。
VII结论
-本发明首次显示，TAFA4蛋白牵涉对疼痛的控制，并显示其治疗多种疼痛模型中的疼痛的功效。
-本发明还显示TAFA4在小直径感觉神经元C-LTMR中特异性表达。
-本发明进一步显示TAFA4失去功能导致增加的损伤诱导的机械和化学超敏性和增强的层IIi神经元的兴奋性。
-本发明还显示TAFA4+传入专有地使末梢中毛囊受神经支配并中心投射至层II的最内层。
-本发明显示Tafa4调控神经元兴奋性和躯体感觉阈值。
-本发明进一步显示TAFA4蛋白能特异性地靶向机械和化学诱导的伤害感受性信号。
-本发明还显示TAFA4化合物和组合物能激活新止痛途径，其通过调控脊髓中间神经元(优选层IIi中间神经元)的C-LTMR-伤害性感受器介导的兴奋性，例如经由调控所述中间神经元上存在的受体(如钾离子通道、钙离子通道或低密度脂蛋白受体，例如LRP1)的活性。
-发明人还提出TAFA4可以调节初级传入中的突触前通道，其相应地增加突出传递。突触后地，“TAFA4能(TAFA4ergic)”C-LTMR传入面临连接层I中存在的投射神经元的层Iii兴奋性谷氨酸能和抑制性GABA能/甘氨酸能(Glycinergic)中间神经元的网络。
-发明人进一步显示在施用人重组TAFA4后，TAFA4无义小鼠中机械和福尔马林诱导的疼痛超敏性被逆转至WT水平。
-发明人在本申请中显示的所有实验数据还揭示，C-LTMRs来源的TAFA4调控福尔马林引发的疼痛的第二阶段。具体地，其中提供的数据显示TAFA4无义小鼠展现过大的/增强的福尔马林引发的疼痛。发明人提出福尔马林引发的疼痛反应(nocifensive)行为可由C-LTMR感觉神经元特异性触发。
-表达Tafa4的神经元的遗传标记允许对C-LTMR生理学特性的详细体外研究。膜片钳分析揭示神经元的显著同质性群体，其具有小电容、独特的短持续时间AP、存在TTX阻抗性Nav1.8电流、和几种低阈值电流的突出的共表达以及缓慢和超缓慢适应的兴奋性机械门控电流。
-通过比较野生型(wt)或TAFA4无义小鼠中的疼痛表型，发明人建立了扰乱TAFA4功能引起对神经元兴奋性的调控，其促进疼痛信号传导的概念的证据。具体地，发明人清楚地显示失去TAFA4功能增强多种疼痛模型中的机械和化学超敏性。结论是，使用TAFA4作为活性成分经由对神经元兴奋性的调控用于治疗病理疼痛信号传导。
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