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本发明涉及利用山苍粳的炎症性疾病用组合物，详细地涉及包含从山苍粳的果实或种子获得的油作为有效成分的炎症性疾病的预防及治疗用组合物及其制备方法。这种本发明使用山苍粳的果实(种子除外)或种子，利用正己烷(n-hexane)来获得用作炎症性疾病的预防及治疗用组合物的有效成分的油，且区分为山苍粳的果实(种子除外)和种子，针对上述果实(种子除外)或种子，投入重量为9～11倍数的作为溶剂的正己烷(n-hexane)，在常温条件下搅拌24小时后进行提取，并去除己烷(hexane)层来获得山苍粳的油。

1.  一种炎症性疾病预防及治疗用组合物，其特征在于，包含从山苍粳提取的油作为有效成分。

2.  根据权利要求1所述的炎症性疾病预防及治疗用组合物，其特征在于，上述山苍粳的油从山苍粳的作为除种子之外的部分的果实或种子或包含种子的果实中的一种获得。

3.  根据权利要求2所述的炎症性疾病预防及治疗用组合物，其特征在于，
上述山苍粳的油为从山苍粳的作为除种子之外的部分的果实获得的果实油和从山苍粳的种子获得的种子油，
单独或混合使用上述果实油和种子油。

4.  根据权利要求1至3中任一项所述的炎症性疾病预防及治疗用组合物，其特征在于，上述山苍粳的油通过将正己烷用作溶剂的提取法、超临界提取法、蒸馏法、压榨法中的一种方法获得。

5.  一种炎症性疾病预防及改善用山苍粳的油的制备方法，其特征在于，针对山苍粳的果实，投入重量为9～11倍数的作为溶剂的正己烷，在常温条件下搅拌24小时后进行提取，并去除己烷层来获得山苍粳的油。

6.  根据权利要求5所述的炎症性疾病预防及改善用山苍粳的油的制备方法，其特征在于，上述山苍粳的果实分离为作为除种子之外的部分的果实和种子后，分别利用分离的作为除种子之外的部分的果实和种子制备油。

包含山苍粳的油作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及利用山苍粳(LITSEAJAPONICA)的炎症性疾病用组合物，详细地涉及包含从山苍粳的果实或种子获得的油作为有效成分的炎症性疾病的预防及治疗用组合物及其制备方法。
背景技术
在本发明中使用的山苍粳(Litseajaponica)作为常绿叶小乔木，主要垂直分布于标高为700m以内的海边及山边。
据报告，在以往研究这种植物的化学结构的过程中，发现了各种精油(essentialoils)、脂肪酸(fattyacids)、内酯(lactones)、生物碱(alkaloids)及萜类化合物(terpenoids)。
分离了作为内酯的种类众所周知的hamabiwalactoneA、hamabiwalatoneB、akolactoneB、litsealactoneA及litsealactoneB。
并且，据报告，根据作为从叶子分离的黄酮类化合物(flavonoids)成分的表儿茶素(epicatechin)、阿福豆甙(afzelin)、槲皮苷(quercitrin)及山奈酚香豆酰基葡萄吡喃糖甙(tiliroside)的抗补体活性(anti-complementactivity)的调查结果，山奈酚香豆酰基葡萄吡喃糖甙对补体系统(complementsystem)具有最强有力的抑制作用。
分馏山苍粳叶80％EtOH提取物后，使用分馏物来测定抗氧化(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、黄嘌呤氧化酶(XanthineOxidase)、超氧自由基(Superoxideradical)->在分馏物EtOAC层中1，1-二苯基-2-三硝基苯肼和超 氧自由基的抑制活性优秀)及LDH、NO、PGE2(含盐)(尹元钟)等，2010，J，KoreanSoc.Appl.Biol.Chem.53(1)：p27～32)，利用硅胶柱来分离叶子的黄酮种(表儿茶素、阿福豆甙、槲皮苷、山奈酚香豆酰基葡萄吡喃糖甙、杨梅苷(Myricitrin)、山柰酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、杨梅素(Myricetin))后，测定了抗补体系统(Anti-complementsystem)活性(SunYoungLee等，2005，植物疗法研究(PHYTOTHERAPYRESEARCH)，19：p.273-276)，并利用甲醇提取食用及药用植物中的山苍粳叶子后，在测定过氧化脂质生成抑制(朴钟哲)等，1997，J.KoreanSoc.FoodSci.Nutr.26(6)：p.1159-1163)的研究中，在山苍粳的情况下，据报告，活性度在浓度为10-1mg/mL的条件下呈现约18％的抑制效果。
并且，在山苍粳(Litseajaponica)的HL-60白血病细胞细胞凋亡(Apoptosis)诱导效果相关研究(2009，ElviraKim等，YkhakHoeji，53(1)：p.6-11)中，利用山苍粳叶子，并利用80％乙醇来进行提取，根据HL-60(细胞毒性)-MTT的测定结果，正常细胞不具有毒性，并呈现HL-60(白血病细胞)细胞增殖抑制效果，通过脱氧核糖核酸片段(DNAfragmentation)分析、蛋白质印迹(Westernblot)分析减少Bcl-2的表达，并使胱天蛋白酶(caspase)活性化，从而诱导细胞凋亡(apoptosis)来实现抑制增殖的效果等，像这样，对山苍粳进行了部分研究。
专利文献的现有技术提供有(KR)韩国公开特许10-2009-0091477(公开日：2009年08月28日)号的包含山苍粳提取物作为有效成分的癌疾病的预防及治疗用组合物相关技术和(KR)韩国登录特许10-1243243(登录日：2012年03月07日)号的包含山苍粳提取物或其分馏物作为有效成分的糖尿病并发症预防及治疗用组合物相关技术。
发明内容
技术问题
本发明提供炎症性疾病预防及治疗用组合物及其制备方法，上述炎症性疾病预防及治疗用组合物包含具有炎症性疾病的预防及治疗效果的山苍粳的油作为有效成分。
即，本申请人为了开发对炎症性疾病的预防及治疗具有功效的原材料，在从天然物筛选的过程中，确认到山苍粳(果实或种子)的油抑制作为炎症性因子的IL-1β、NO及TNF-α生成的效果优秀，从而提供包含山苍粳的油作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用组合物及其制备方法。
解决问题的手段
想要达成如上所述的目的的本发明提供包含山苍粳的油作为有效成分的炎症性疾病预防及治疗用组合物，上述炎症性疾病预防及治疗用组合物的特征在于，利用正己烷(n-hexane)来从山苍粳的果实(种子除外)或种子获得。
可单独或混合使用上述山苍粳果实(种子除外)的油和山苍粳种子的油。
上述山苍粳的油有多种提取方法，在本发明中，区分为山苍粳的果实(种子除外)和种子，针对上述果实(种子除外)或种子，投入重量为9～11倍数的作为溶剂的正己烷(n-hexane)，在常温条件下搅拌24小时来进行提取，并去除己烷层来获得山苍粳的油。
发明的效果
本发明的山苍粳的油包含β-荜澄茄油烯(Beta-cubebene)(22.96％)、β-芹子烯(Beta-selinene)(11.23％)、γ-榄香烯(Gamma-Elemene)(10.21％)、β-石竹烯(Beta-Caryophyllene)(7.37％)，根据实验结果，呈现IL-1β生成抑制能力、NO生成抑制能力和TNF-α生成抑制能力，因而可有用地使用为炎症性疾病预防及治疗用组合物的有效成分。
附图说明
图1为表示本发明实施例的山苍粳果实的油和种子的油的IL-1β生成抑制能力的图表。
图2为表示本发明实施例的山苍粳果实的油和种子的油的NO生成抑制能力的图表。
图3为表示本发明实施例的山苍粳果实的油和种子的油的TNF-α生成抑制 能力的图表。
图4为本发明实施例的山苍粳果实的油的色谱图。
具体实施方式
本发明提供包含山苍粳的油作为有效成分的炎症性疾病预防或治疗中使用的炎症性疾病预防及治疗用组合物及制备方法。
作为本发明组合物的有效成分的山苍粳油分离为果实(除种子之外的部分)或种子(果实里面的种子)，由此获得油，并通过以下方法制备。
但是，还可丛未分离山苍粳的果实和种子的，即包含种子的果实(混合果实和种子的状态)获得油。
在本发明的实施例中，只是为了摸索医药品、食品等的多种组合物的应用而分离果实和种子并由此获得油，可从包含种子的果实获得油，这也在本发明的发明要求保护范围内。
作为从山苍粳的果实(除种子之外的部分)或种子(果实里面的种子)或包含种子的果实提取油的方法，除了作为本发明实施例的利用正己烷(n-hexane)的提取法之外，还有超临界提取法、蒸馏法、压榨法等提取方法，利用这些方法可获得油。但是，在利用蒸馏法和压榨法的情况下，存在提取的油量少于作为实施例的利用正己烷(n-hexane)的提取法的缺点。
在山苍粳果实(种子除外)的油、干燥的山苍粳果实(种子除外)中，投入重量为9～11倍数(优选为10倍数)的作为溶剂的正己烷(n-hexane)之后，在常温(15～25℃)条件下搅拌24小时来进行提取，之后，去除己烷(hexane)层来获取山苍粳果实油。
在山苍粳种子的油、干燥的山苍粳(Litseajaponica)种子中，投入重量为9～11倍数(优选为10倍数)的作为溶剂的正己烷(n-hexane)，并在常温(15～ 25℃)条件下搅拌24小时来进行提取后，去除己烷(hexane)层来获得(获取)山苍粳种子油。
可分别单独使用上述山苍粳果实油和种子油，还能够以规定比率混合使用。
本发明的山苍粳果实(种子除外)和种子的油在抑制众所周知为炎症性因子的TNF-α、IL-1β、NO的生成的功效低的浓度中非常优秀。因此，本发明的山苍粳果实(种子除外)和种子的油还可使用于对炎症性疾病的预防或治疗有用的医药品及保健食品的组合物(原料)。
本发明的组合物可与山苍粳果实(种子除外)和种子的油一同包含一种以上的具有炎症性疾病的预防或治疗效果的公知的有效成分。
本发明的组合物除了上述记载的有效成分之外，还可通过包含一种以上的药学上可接受的载体来制备，以便进行给药。
药学上可接受的载体可混合使用食盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲食盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及这些成分中的一种成分以上。
本发明的组合物还可单独或与手术、激素治疗法、药物治疗法及使用生物学反应调节剂的多种方法并用，以便预防或治疗炎症性疾病。
本发明的组合物还能够以改善炎症性疾病为目的添加至保健食品而使用。
在使用本发明的山苍粳果实(种子除外)或种子的油作为食品添加物的情况下，可直接添加上述山苍粳果实(种子除外)或种子的油，或使用其分馏物，或与其他食品或食品成分一同使用，且可根据通常的方法适当地使用。
可添加上述物质的食品的例有包含肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、快餐类、饼干类、比萨、拉面、其他面类、泡泡糖类、冰淇淋类的乳品、各种汤、饮料、茶、清凉剂、酒精饮料及维生素复合剂等，食品的种类没有特别限制，包含所有通常意义上的保健食品。
以下，提出优选实施例，以便理解本发明。但是，以下实施例仅用于容易理解本发明，本发明的内容不限定于实施例。
实施例1：山苍粳果实(种子除外)油的制备
在500g的冷冻干燥的山苍粳(Litseajaponica)果实(除种子之外的部分)中添加5000ml的正己烷(n-hexane)，并在常温(20℃)条件下搅拌24小时来进行提取之后，去除己烷来获取了95g的山苍粳果实(种子除外)的油。
实施例2：山苍粳果实的种子部分的油的制备
在500g的冷冻干燥的山苍粳(Litseajaponica)种子中添加5000ml的正己烷(n-hexane)，并在常温(20℃)条件下搅拌24小时来进行提取之后，去除己烷来获取了46g的山苍粳种子的油。
实验例1：山苍粳果实(种子除外)油的成分分析
进行了根据上述实施例1得到的山苍粳果实(种子除外)油的成分分析实验。
实验方法：设备使用了岛津(Shimadzu)公司的QP2010Plus，柱(Column)使用了RTX-5(30m×0.25mm，0.25μm)，有关其他条件，在注射(Injection)温度为250℃、检测器(Detector)温度为250℃、质量范围(Massrange)为(m/z)30-400、注射量(Injectionvolume)为1μL的条件下进行了分析。
实验结果：分析根据上述实施例1得到的山苍粳果实(种子除外)油，来得到了如图4和下列表1所示的结果，这种油包含β-荜澄茄油烯(Beta-cubebene)(22.96％)、β-芹子烯(Beta-selinene)(11.23％)、γ-榄香烯(Gamma-Elemene) (10.21％)、β-石竹烯(Beta-Caryophyllene)(7.37％)。
下列表1为根据实施例1得到的山苍粳果实油的分析表。
表1

实验例2：本发明的山苍粳果实或种子油的抗炎症效果
测定(1)：IL-1β生成抑制效果
为了确认根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实(种子除外)油和种子油的抗炎症效果，进行了测定IL-1β生成抑制效果的实验。
实验方法：为了评价IL-1β生成抑制能力，在刺激作为小鼠巨噬细胞株的Raw264.7cell(1×10⁶cell/mL)之前，分别对山苍粳果实油和种子油试样预处理1小时后，利用脂多糖(LPS)(1μg/mL)刺激，接着，经过24小时后，在细胞培养上清液中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法来进行了定量，酶联免疫吸附测定通过在美国欣博盛生物科技有限公司(eBioscience，USA)购买MouseELISAset(IL-1β)来进行。
实验结果：在图2和表2中表示了根据本发明的实施例1和实施例2得到的山苍粳果实油和种子油的IL-6生成能力的测定结果。其结果表示，山苍粳果 实油试样中，IL-1β生成能力抑制优秀于种子的油试样，浓度依赖性地抑制IL-6生成能力。在浓度为25ug/mL的条件下，果实精油试样呈现96％抑制能力，种子精油试样呈现82％抑制能力，即呈现了优秀的功效。
下列表2为基于根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实油和种子油的IL-1β生成能力测定的抗炎症效果表。
表2

实验例3：本发明的山苍粳果实或种子油的抗炎症效果
测定(2)：NO生成抑制能力评价
为了确认根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实(种子除外)油和种子油的抗炎症效果，进行了评价NO生成抑制能力的实验。
实验方法：为了测定NO生成抑制能力，在刺激作为小鼠巨噬细胞株的Raw264.7cell(1×10⁶cell/mL)之前，分别对山苍粳果实油和种子油预处理1小时后，利用脂多糖(1μg/mL)刺激，接着，经过24小时后，有关存在于细胞培养上清液的一氧化氮(Nitricoixde)的浓度，在540nm条件下，使用NO检测试剂盒(detectionkit)(韩国内含生物技术(Intronbiotechnology，Korea))来测定了吸光度。
实验结果：在图2和表3中表示了根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实油和山苍粳种子油的NO生成抑制能力的评价结果。其结果表明，山苍粳果实油和种子油均浓度依赖性地抑制NO生成能力。
在浓度为25ug/mL的条件下，山苍粳果实精油试样呈现91％抑制能力，山苍粳种子精油试样呈74％抑制能力，即呈现了优秀的效果。
下列表3为根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实油和种子油的NO生成抑制能力测定表。
表3


实验例4：本发明的山苍粳果实或种子油的抗炎症效果
测定(3)：TNF-α生成抑制能力评价
为了确认根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实(种子除外)油和种子油的抗炎症效果，进行了评价TNF-α生成抑制能力的实验。
实验方法：为了评价TNF-α分泌抑制能力，在刺激作为小鼠巨噬细胞株的Raw264.7cell(1×10⁶cell/mL)之前，分别对山苍粳果实油和种子油试样预处理1小时后，利用脂多糖(1μg/mL)刺激，接着，经过24小时后，在细胞培养上清液中通过酶联免疫吸附测定法来进行了定量，酶联免疫吸附测定通过在美国欣博盛生物科技有限公司购买MouseELISAset(TNF-α)来进行。
实验结果：在图3和表4中表示了根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实油和种子油的TNF-α生成抑制能力的评价结果。其结果表明，山苍粳果实油试样和种子油试样均浓度依赖性地抑制TNF-α生成能力。在浓度为25ug/mL的条件下，山苍粳果实油试样呈现37％抑制能力，山苍粳种子油试样呈现29％抑制能力，即呈现了优秀的功效。
下列表4为根据上述实施例1和实施例2得到的山苍粳果实油和种子油的TNF-α生成抑制能力测定表。
表4

产业上的可利用性
本发明的丛山苍粳的果实(种子除外)和种子提取的油的炎症性疾病的预防及治疗效果优秀。
因此，本发明的山苍粳果实油和种子油可有用地使用于炎症性疾病的预防及治疗。