具有抗脂质过氧化作用的水溶性羧甲基几丁聚醣的制法 本发明涉及一种制备几丁聚醣类的方法，特别是涉及一种以虾蟹壳为原料制备羧甲基几丁聚醣的方法。
几丁聚醣类(chitosans)在自然界含量丰富，仅次于纤维素；虾壳及蟹壳是几丁聚醣类的主要来源；几丁聚醣类具有生物分解性、资源再利用性、具材料与生理机能性，而且不会造成环境污染，是一种极具开发价值的现代材料；目前全世界许多国家正积极进行几丁聚糖类的研究开发；我国国科会从85年开始就积极推动水产甲壳废弃物使其开发为高经济价值的几丁质、几丁聚醣以及几丁寡醣研究的整合型计划，并就其物化性质与应用问题加以研究，针对解决本土性问题的开发与探讨；可见几丁聚醣类的应用与开发，已受到国家高度的重视。
因此，本发明的目的在于提供一种具有抗脂质过氧化作用的水溶性羧甲基几丁聚醣(carboxymethylated chitosan，简称CM-几丁聚醣)的制法。
本发明涉及一种用于制备具有抗脂质过氧化作用的水溶性羧甲基几丁聚醣的方法，其包括下列步骤：
(1)先将虾壳或蟹壳几丁聚醣原料经碱液去除蛋白质，后以酸液去除钙质，制成几丁质原料；
(2)将所得几丁质原料，再与碱液于80℃-100℃加热进行去乙酰化处理；
(3)将去乙酰化几丁聚醣溶于低级醇液中，进行羧甲基化，经干燥即得羧甲基几丁聚醣。
按照本发明所述地用于制备具有抗脂质过氧化作用的水溶性羧甲基几丁聚醣的方法，其中步骤(1)或步骤(2)的碱液可为氢氧化钠或氢氧化钾；
其中步骤(1)的酸液可为盐酸、醋酸、硝酸、磷酸、草酸或丁酸；
其中步骤(3)的低级醇可为异丙醇或异丁醇。
本发明方法所制得的具有抗脂质过氧化作用的水溶性CM-几丁聚醣具有优越的抗氧化能力，可供化妆保养品、健康食品及医药品的使用，可以防止肝脏组织受到脂质过氧化的伤害。
附图简要说明：
图1-A至图1-B表示虾壳水溶性CM-几丁聚醣抗脂质过氧化作用；
图2-A至图2-B表示蟹壳水溶性CM-几丁聚醣抗脂质过氧化作用；
图3-A至图3-B表示水溶性维生素E(Trolox)抗脂质过氧化作用。
实施例1：水溶性CM-几丁聚醣的制法如下：
(1)几丁质原料：
虾壳及蟹壳的水溶性CM-几丁质聚醣的原料来自新达生物科技股份有限公司；先将虾壳或蟹壳经干燥后，以弱碱液[5％NaOH以1∶20(W∶V)]的比例混合浸泡处理，经常温及20小时后去除蛋白质成分，经多次水洗；再以弱酸液[5％HCl以1∶20(W∶V)]的比例混合浸泡处理，经常温及10小时后除去矿物质，在经水洗后干燥，获得几丁质原料。
(2)去乙酰几丁聚糖的制备：
把上述所得几丁质原料，再经过直径0.2mm网眼的磨粉机粉碎，再经40-60筛目(mesh)筛网过筛的几丁质与50％NaOH以1∶15(W∶V)的比例混合，置于100℃的恒温箱中，以250rpm速度的振荡器板荡6小时，进行去乙酰作用；经去乙酰化的几丁聚醣以流水冲洗，至以氯化亚钴试纸(Whatman，USA)测试为中性时，再以蒸馏水清洗三次后于50℃烘箱干燥。
(3)水溶性羧甲基几丁聚醣(watersoluble carboxymethylatedchitosan简称CM-几丁聚醣)的制备：
把上述制备的去乙酰几丁聚醣(20克)悬浮于400ml的异丙醇(一边搅拌)中，加入50.4ml的10M NaOH，搅拌45分钟后，再加入24克的单氯醋酸(monochloroacetic acid)粉末，并于50℃反应6小时；反应后加入35ml的冷蒸馏水，并以冰醋酸(glacial acetic acid)调整PH至7.0，过滤后的固体产物先以500ml的70％甲醇水溶液洗涤，再以无水甲醇洗涤，于60℃烘箱干燥后，约可得30克水溶性CM-几丁聚醣产物(N.O-carboxymethylated)。
由上述方法获得产物经过仪器测定结果，知道其分子量的范围在22万-25万道尔顿之间，其去乙酰化程度为92％；此种产品(包括来自虾壳以及蟹壳)都具有强力的“抗脂质过氧化作用”(anti-lipidperoxidation)的能力。
实施例2：水溶性CM-几丁聚醣(虾、蟹)抗老鼠肝脏微粒体的脂质过氧化作用。
(1)实验：
本实验是以大鼠肝脏微粒体(microsome)做为脂质的来源，利用热处理(破坏微粒体酵素)及不加热处理方式加入不同物质(NADPH)来引发酵素所产生的脂质过氧化产物叫MDA(malodial-dehyde)，它加丙二酰硫脲试剂(thiobarbituric acid，TBA)反应后，形成粉红色具有萤光的MDA：TBA复合物，它在波长535nm(或532nm)下会吸光，由吸光度测得MDA含量即知脂质过氧化的程度；MDA的产量若因添加水溶性CM-几丁聚醣而减少，即表示水溶性CM-几丁聚醣具有抗脂质过氧化作用的能力，并以水溶性的维生素E(Trolox)做相对比较。
(2)结果一：虾壳水溶性CM-几丁聚醣的抗老鼠肝脏微粒体脂质过氧化作用的实施结果，如图1-A至图1-B所示。
由图1-A至图1-B显示，在大鼠的肝脏微粒体引发脂质过氧化作用过程中，加入不同浓度的虾壳水溶性CM-几丁聚醣后，显示虾壳水溶性CM-几丁聚醣具有高能力的抗脂质过氧化作用。
图1-A表示脂质过氧化作用产物MDA会因为虾壳水溶性CM-几丁聚糖浓度的增加而减少。
图1-B表示虾壳水溶性CM-几丁聚醣的IC50(抑制50％脂质过氧化作用时的浓度)为6.1(图中的数据为至少3点的平均值)。
(3)结果二：蟹壳水溶性CM-几丁聚醣抗老鼠肝脏微粒体脂质过氧化作用的实施结果，如图2-A至图2-B所示。
由图2-A至图2-B所示，在大鼠的肝脏微粒体引发脂质过氧化作用过程中，加入不同浓度的蟹壳水溶性CM-几丁聚醣后，显示蟹壳水溶性CM-几丁聚醣具有高能力的抗脂质过氧化作用。
图2-A表示脂质过氧化作用产物MDA会因为蟹壳水溶性CM-几丁聚醣浓度的增加而减少。
图2-B表示蟹壳水溶性CM-几丁聚醣的IC50(抑制50％脂质过氧化作用时的浓度)为7.9(图中的数据为至少3点的平均值)。
(4)结果三：水溶性维生素E(Trolox)抗老鼠肝脏微粒体脂质过氧化作用的实验结果。
由图3-A至图3-B显示，在大鼠的肝脏微粒体引起脂质过氧化作用过程中，加入不同浓度的水溶性维生素E具有高能力的抗脂质过氧化作用。
图3-A表示脂质过氧化作用产物MDA会因为水溶性维生素E浓度增加而减少。
图3-B表示水溶性维生素E的IC50(抑制50％脂质过氧化作用时的浓度)为4.96(图中的数据为至少3点的平均值)。
由以上三项实验结果，可知虾壳及蟹壳的水溶性CM-几丁聚醣的抗脂质过氧化能力很强，相当于水溶性维生素E的能力。
(a)水溶性维生素E的IC50＝4.96ug/ml
(b)虾壳水溶性CM-几丁聚醣的IC50＝6.1ug/ml
(c)蟹壳水溶性CM-几丁聚醣的IC50＝7.9ug/ml