一种冻存蓝细菌的方法.pdf

本发明公开了一种冻存蓝细菌的方法，首先在固体培养基上培养出蓝细菌，然后将无菌试纸片平放在蓝细菌上面，粘起蓝细菌，接着将粘有蓝细菌的试纸片密封好，冻存于液氮中。该方法舍弃了冷冻保护剂，不需要进行慢速冷冻，使用普通试纸进行蓝细菌的直接液氮冷冻保存，整个流程操作简单，减少了冻存步骤，避免了细菌的污染，提高了冻存效率，而且冻存后细菌的复苏时间短，节约了成本。

1.  一种冻存蓝细菌的方法，首先在固体培养基上培养出蓝细菌，然后将无菌试纸片平放在蓝细菌上面，粘起蓝细菌，接着将粘有蓝细菌的试纸片密封好，冻存于液氮中。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无菌试纸片是将普通试纸剪成一定大小的试纸片，然后将其高压灭菌得到。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述试纸片的大小为1～4cm²。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为Bg11固体培养基。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，在固体培养基上培养蓝细菌的温度为22～26℃，光照培养。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，对粘有蓝细菌的试纸片进行密封的方法是：先将试纸片置于无菌密封袋中封严，再放于冻存管内密封。

7.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，冻存后的蓝细菌复苏方法是：将冻存的试纸片取出，平放于无抗生素的固体培养基上，进行1-2天培养。

一种冻存蓝细菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物冻存技术，具体涉及一种蓝细菌的冻存方法。
背景技术
微生物是重要的生物资源，在工业、农业、医学和科学研究领域都有着非常广泛的应用。为了使有用的微生物菌株以活的生命状态保存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变，就需要进行微生物的保存工作。
目前微生物保存的方法很多，根据不同的微生物菌株或不同的实验要求，可以选用不同的方法。这些保存方法的原理大同小异，就是首先挑选优良性状的菌株，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、缺氧、干燥、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率。
最常用的微生物保存方法是超低温冷冻保存法，此法是将微生物培养液与冷冻保护剂按比例混合后，先以较慢的冷冻速度(1℃/分钟)冷冻，直至-50℃，然后再储存在液氮中(-150℃～-196℃)。
超低温冷冻保护剂通常使用甘油(10％)、二甲基亚砜(5％)和甲醇(10％)，这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。就蓝细菌而言，通常都使用甲醇做为冷冻保护剂。使用甲醇作为冷冻保护剂冻存蓝细菌的技术中存在以下问题：
1.操作复杂。首先需要将蓝细菌培养至OD₇₃₀≈1.0，然后再将培养液与保护剂按比例混合，经过缓慢降温后再置于液氮中冷冻；
2.复苏时间长。使用传统方法冻存的蓝细菌，一般要经过一周左右的时间，才能在平板上看到长出的菌落；
3.成活率低。复苏后的蓝细菌成活率大约在10～20％之间；
4.极易污染。冻存于液氮中的蓝细菌非常容易被各种杂菌所污染，一旦污染就要经过6-7代甚至更多的传代培养，直至将污染物去除，工作量非常大。如果污染严重的只能将整管冻存菌丢弃，损失巨大。
发明内容
本发明的目的是针对现有保存蓝细菌方法的问题，提供一种新的针对蓝细菌的冻存方法， 通过本发明的方法，可以达到操作简单、不易污染等效果，显著提高蓝细菌的存活率。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种冻存蓝细菌的方法，首先在固体培养基上培养出蓝细菌，然后将无菌试纸片平放在蓝细菌上面，粘起蓝细菌，接着将粘有蓝细菌的试纸片密封好，冻存于液氮中。
在本发明的方法中，将蓝细菌培养于固体培养基上，待长出菌落后即可冻存。所述无菌试纸片可以是将普通试纸剪成一定大小(例如1～4cm²)的试纸片，然后将其高压灭菌得到。
优选的，在固体培养基上培养蓝细菌的温度为22～26℃，光照培养。
优选的，对粘有蓝细菌的试纸片进行密封的方法是将其先置于无菌密封袋中封严，再放于冻存管内密封。
利用本发明方法冻存的蓝细菌在进行复苏时，只要将冻存的试纸片取出，平放于无抗生素的固体培养基上，经过1-2天培养即可用于实验操作。
本领域的技术人员认为，一方面，为避免细胞受冷冻损伤，在进行细菌冻存时需要加入冷冻保护剂，冷冻保护剂不仅能够同细菌悬液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加，从而减少冰晶的形成，而且冷冻保护剂还可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤；另一方面，若急剧冷冻细菌，在细胞内会形成冰晶，降低存活率，所以通常需要先将细菌以每分钟下降1℃的速度慢速冻结至-30℃或-50℃，然后再放入液氮中。本发明克服了上述技术偏见，不仅舍弃了冷冻保护剂，而且不需要进行慢速冷冻，通过使用普通试纸进行蓝细菌的直接液氮冷冻保存，整个流程操作简单，减少了冻存步骤，避免了细菌的污染；提高了冻存效率，试纸上的菌落几乎都可以成活；复苏时间短，只要2天的时间就可以完全复苏，进行划线培养；节约了成本。
附图说明
图1是按本发明方法冻存的蓝细菌复苏培养后的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
首先配制培养蓝细菌的Bg11固体培养基：取1.5g硝酸钠、0.04g磷酸氢二钾、0.075g硫 酸镁·7H₂O、0.036g氯化钙·7H₂O、0.02g碳酸钠、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁、1毫升微量元素溶液A5，加蒸馏水至1升，得Bg11液体培养基；然后在Bg11液体培养基中加入琼脂，使其终浓度为1.2％(质量百分含量)，高压灭菌，得到Bg11固体培养基。
根据下述步骤进行蓝细菌的冻存和复苏试验：
1.将蓝细菌培养于Bg11固体培养基上，放置于26℃，光照培养，待5-7天长出单菌落或菌落群；
2.将无菌滤纸平铺于蓝细菌上，可覆盖多个单菌落或菌群；
3.将粘有蓝细菌的试纸夹起，小心置于无菌密封袋中，封严袋口；
4.将密封袋置于冻存管内，旋紧盖子；
5.直接将冻存管置于液氮内冷冻保存菌种；
6.冻存一段时间后(约4个月)取出冻存管；
7.将冻存管内粘有蓝细菌的滤纸取出，置于Bg11固体培养基上，避光过夜；
8.将Bg11固体培养基置于光下培养，可见蓝细菌已全部复苏，如图1所示，存活率100％。
上述冻存蓝细菌的方法较现有的冻存方法存活率(约10-20％)明显提高，而且不需要加入任何保护剂，菌株也不会被液氮污染，大大提高了冻存效率。