4氧代2戊烯酸和消化道的健康.pdf

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1、10申请公布号CN104220054A43申请公布日20141217CN104220054A21申请号201380017851022申请日20130325CNCMI386520071115CNCMI39142008020512162366420120330EPA61K31/19200601A23L1/00200601C12R1/00200601A61P1/00200601A61P29/00200601A61P35/0020060171申请人雀巢产品技术援助有限公司地址瑞士沃韦72发明人FJ阿尔塞维拉B布尔其T比特勒S杜布克斯F福阿塔PA盖N帕日SAD莱兹74专利代理机构北京市中咨律师事务所11。

2、247代理人陈润杰黄革生54发明名称4氧代2戊烯酸和消化道的健康57摘要本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别而言，本发明涉及消化道的炎症性病症的领域，例如回肠炎、结肠炎、直肠炎症、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症和炎症性肠病。本发明的主题是用于治疗或预防消化道的炎症性病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092986PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0562682013032587PCT国际申请的公布数据WO2013/144083EN2013100383生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书12页附图6页19中华人民共和国。

3、国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图6页10申请公布号CN104220054ACN104220054A1/1页21用于治疗或预防消化道的炎症性病症、包含4氧代2戊烯酸的组合物，所述炎症性病症选自下组回肠炎、结肠炎、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症、直肠炎症、炎症性肠病及其组合；其中所述组合物不用作药剂。2根据权利要求1使用的组合物，其中所述4氧代2戊烯酸获自天然来源。3根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中4氧代2戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700。4根据权利要求3使用的组合物，其中所述短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC。

4、15700在约60180、优选在约80160进行热处理。5根据前述权利要求中一项使用的组合物，其包含至少1MG/KG组合物、优选至少10MG/KG组合物、例如50MG至50G/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。6根据前述权利要求中一项使用的组合物，其以对应于2G至20MG4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量施用。7根据前述权利要求中一项使用的组合物，其口服或肠内施用。8根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向人、宠物或家畜施用。9根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向应激对象、特别是成年人施用。10根据前述权利。

5、要求中一项使用的组合物，其向儿童或青少年施用。11根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中所述组合物选自下组食品组合物、食品添加剂、营养品、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。权利要求书CN104220054A1/12页34氧代2戊烯酸和消化道的健康0001描述0002本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别而言，本发明涉及消化道的炎症性病症领域，例如回肠炎、结肠炎、直肠炎症、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症和炎症性肠病。本发明的主题是用于治疗或预防消化道的炎症性病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物。0003消化道的炎症性病症可具有宽范围的后果，从短期疾病或不适直。

6、至重大终生残疾和死亡。长期重复胃肠炎症不仅影患者生活质量，而且增加肠道中纤维化和癌的风险。在全世界的发展中国家中炎症性肠病的发病率上升，且全世界约5百万人目前受影响。0004目前针对消化道的炎症性病症的治疗是基于使用五大类药物非特异性抗炎症性药物如5氨基水杨酸或糖皮质激素；抗代谢物如硫唑嘌呤或6巯嘌呤；单克隆抗体如英利昔单抗INFLIXIMAB；或抗生素。然而，在一些情况下这些药物可展现出副作用，故具有可用于治疗或预防消化道炎症性病症且没有现有技术中描述的组合物的缺点的另外组合物是可取的。特别而言，发现其活性成分从天然来源获得的有效组合物是高度可取的。0005因此，本发明的目的是改良技术状态，。

7、特别而言是提供可用于治疗或预防消化道炎症性病症的替代组合物。0006发明人惊讶地看到，可由独立权利要求的主题实现本发明的目的。从属权利要求进一步开发本发明的理念。0007因此，本发明提供用于治疗或预防消化道炎症性病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物，所述炎症性病症选自下组回肠炎、结肠炎、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症、直肠炎症、炎症性肠病及其组合。组合物可以不用作药剂。0008本发明还提供4氧代2戊烯酸在制备用于治疗或预防消化道炎症性病症的组合物中的用途，所述炎症性病症选自下组回肠炎、结肠炎、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症、直肠炎症、炎症性肠病及其组合。0009在本发明的范围内的“治疗”是指减少、。

8、抑制、减轻或改善。00104氧代2戊烯酸具有CAS号4743822和下列式00110012核因子红细胞源性2样2，也称为NRF2，是炎症的关键调控因子CLLSAW等人,EXPERTOPINIONONTHERAPEUTICTARGETS,15,2812952011。NRF2存在于细胞溶质中且结合于抑制剂KEAP1。当结合于KEAP1时，NRF2还被蛋白酶体快速降解，因此其基底浓度低。在被应激源例如一氧化氮、生长因子或重金属活化时，从KEAP1释放NRF2。NRF2浓度增加并且其易位到细胞核中。NRF2然后结合于存在于编码很多抗氧化剂酶的基因的启动子区中的抗氧化剂响应元件AREKENSLERTW等。

9、人,ANNUREVPHARMACOLTOXICOL2007；4789116。最近研究已表明NRF2ARE信号传导牵涉减弱炎症相关的发病机理如胃炎和结肠炎。有可能由NRF2靶向的基因的细胞保护功能可遏抑促炎症性基因的诱导JKIM等人,MUTATIONRESEARCHFUNDAMENTALANDMOLECULARMECHANISMS说明书CN104220054A2/12页4MUTAGENESIS,690,12232010。0013已描述许多化合物对NRF2的活化。已报道多元酚如姜黄素US2009/0042980、白藜芦醇CHENCY等人,BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN2005年6月。

10、17日；33149931000、莱服硫烷FELBARBRY等人,JOURNALMEDICALPLANTSRESEARCH,5,473484,2011和槲皮素TANIGAWAS等人,FREERADICBIOLMED2007年6月1日；42111690703激活NRF2。发明人惊讶地发现4氧代2戊烯酸还激活NRF2。姜黄素、白藜芦醇、莱服硫烷和槲皮素的非常低的水溶解度影响其生物利用度。相比之下，4氧代2戊烯酸具有良好的水溶解度。0014核转录因子BNFB的激活牵涉炎症性疾患，包括结肠炎和炎症性肠病的宿主。MPASPARAKIS,MUCOSALIMMUNOLOGY,1,S54S572008。NFB由。

11、REL蛋白的同二聚体和异二聚体组成。NFB的主要反式激活形式由P65和P50异二聚体组成。NFKB的激活涉及通过特异性IB激酶使抑制性蛋白IB磷酸化和随后蛋白质降解。游离NFB传入细胞核，其中它结合于在炎症中涉及的许多基因的启动子区中的B位点。0015已鉴定NFB抑制剂，如糖皮质激素ADCOCK等人,AMERICANJOURNALPHYSIOLOGYCELLPHYSIOLOGY,268,C331C3381995，但是当全身给予时糖皮质激素具有内分泌和代谢副作用。也已报道肝素抑制NFBWO200119376，但是其具有潜在副作用，导致肝素诱导的血小板减少。0016发明人调查了4氧代2戊烯酸是否抑。

12、制NFB激活。使用人结肠细胞和人单核细胞/巨噬细胞，他们发现4氧代2戊烯酸在促炎症性应激LPS和RHTNF下抑制NFB激活。0017发明人惊讶地发现4氧代2戊烯酸可由天然来源获得，例如获自一些经过热处理的细菌株。例如，当在90加热6小时时短双岐杆菌CNCMI3865和短双岐杆菌ATCC15700TM的细菌制品均产生4氧代2戊烯酸。发现在离心并过滤经过热处理的细菌制品后，4氧代2戊烯酸存在于可溶性部分中。0018短双岐杆菌CNCMI3865于2007年11月15日保藏于COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTE。

13、UR,25RUEDUDOCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0019短双岐杆菌ATCC15700TM可商业获得，例如以ATCC15700的商标获自美国典型培养物保藏中心AMERICANTYPECULTURECOLLECTIONATCC,MANASSAS,VIRGINIA,USA。0020因此，本发明部分涉及用于治疗或预防消化道炎症性病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物，所述炎症性病症选自下组回肠炎、结肠炎、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症、直肠炎症、炎症性肠病及其组合；其中组合物不用作药剂。药剂是在药房中制备或分发且在医学治疗中使用的药物或药品于2012年07月1。

14、7恢复。本发明可以是用于治疗或预防消化道炎症性病症的包含4氧代2戊烯酸的食品组合物。消化道包含口腔、喉咙、食管、反刍动物的前胃蜂巢胃RETICULUM、瘤胃、重瓣胃、所有物种的真胃TRUESTOMACH、小肠、大肠和在有它们的物种如人中的直肠和肛门。0021回肠炎和结肠炎分别是回肠和大肠的炎症。咽炎是喉咙或咽部的炎症。0022肠漏综合症，也称为肠渗透性增加，是一种在综合医生社区内公认且常见的诊断说明书CN104220054A3/12页5BBROM,SOUTHAFRICANFAMILYPRACTICE,52,3143162010。诊断该综合征的卫生保健从业者解释肠炎症加宽了肠内衬细胞之间的接合点。

15、。增加的渗透性刺激对食物和正常肠道菌群组分的典型超敏性响应。细菌内毒素、细胞壁聚合物和饮食麸质可引起炎症性通道的“非特异性”激活LGALLAND,1995，于2011年10月26日查看，HTTP/WWWMDHEALORG/LEAKYGUTHTM。低烧、短暂肠道疼痛和无法吸收营养物的感觉是在另外未确诊患者中的一些所报道的症状。0023肠易激综合症是功能性肠病症，其特征在于在缺少任何可检测器质性病因下的慢性腹痛、不适、鼓胀和肠习性变化。研究已描述肠易激综合症患者中的粘膜炎症和与肠感染相关的疾病GBARBARA等人,GUT,51SUPPL1,I41I442002。0024炎症性肠病是一组以慢性和周期。

16、性炎症为特征的胃肠疾病。炎症性肠病的主要形式为克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，尽管炎症性肠病的其它形式包括胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎DIVERSIONCOLITIS、白塞氏病BEHCETDISEASE和未定型结肠炎。由于全世界范围内此类病症的规模和严重性，因此提供治疗或预防消化道炎症性病症如回肠炎、结肠炎、直肠炎症、咽炎、肠漏综合症、肠易激综合症和/或炎症性肠病的组合物是有利的。0025在本发明中，4氧代2戊烯酸是可获得的，例如获自天然来源。很多人关心在工业上由化工原料合成的材料的安全性，尤其在将摄入这些材料的情况下，并且优选获自天然来源的材料。0026令人惊讶的是，。

17、发明人发现，一些菌株提供4氧代2戊烯酸的天然来源。特别而言，发明人已发现4氧代2戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700TM短双岐杆菌的模式株。将细菌用作4氧代2戊烯酸的来源是尤其有利的，因为例如通过使用生物反应器可以生产大量4氧代2戊烯酸。因此，在本发明中4氧代2戊烯酸可以获得，例如获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700TM。0027该细菌可以在商业生产过程中在约60180、优选在约80160。例如在约110150进行热处理。发明人发现，在这些温度的热处理在可接受的时间内提供令人满意的4氧代2戊烯酸收率。不希望受理论束缚，应理解，热处理的。

18、温度越高4氧代2戊烯酸形成速率增加，而且使其降解速率增加。因此，这些温度在4氧代2戊烯酸的形成速率与其降解之间给出良好平衡。0028包含4氧代2戊烯酸的典型组合物可以包含至少1MG/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。一般而言，如果组合物包含至少10MG/KG组合物、例如在50MG至50G/KG组合物之间的量的4氧代2戊烯酸，则是优选的。0029待施用的最佳量的4氧代2戊烯酸可以由熟练技术人员容易地确定。0030在治疗性应用中，以足以至少部分治愈或阻止病症和/或其并发症的症状的量施用组合物。足以完成此的量被定义为“治疗性有效剂量”。对于此目的有效的量将取决于本领域技术人员已知的许多因素，如病症的严。

19、重性以及患者的重量和一般状况。在预防性应用中，向易受特定病症影响或另外处于特定病症风险的患者施用足以至少部分减少发展病症的风险的量的根据本发明的组合物。此类量被定义为“预防性有效剂量”。而且，精确量取决于许多患者特异性因素如患者的健康状况和重量。0031在本发明的框架中，4氧代2戊烯酸可以以治疗性有效剂量和/或以预防性有说明书CN104220054A4/12页6效剂量施用。本发明的组合物可以以对应于2G至20MG4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量施用。0032消化道的炎症性病症影响动物以及人。炎症性肠病为狗的。

20、慢性呕吐和腹泻的最常见原因。EDEPAPP,“INFLAMMATORYBOWELDISEASEINDOGS”，于2011年10月26日查看，HTTP/WWWPETPLACECOM。也已估计约1/3具有慢性腹泻史的狗患有结肠炎。THEMERCKVETERINARYMANUAL，第9版。马慢性腹泻可由涉及肠道的炎症性疾患引起。因为马具有大体积的结肠和盲肠，所以大规模体液损失可在短时间内发生。因此，成年马的腹泻可以是爆炸性事件，患病率和死亡率超过与其它动物和人的腹泻疾病相关的患病率和死亡率THEMERCKVETERINARYMANUAL，第9版。因此，提供向人或动物施用的用于治疗或预防消化道炎症性病。

21、症的组合物是有利的。在伴侣动物的情况下，此类治疗改良动物的整体生活质量和改良主人满意度。本发明提供向人、宠物或家畜施用的组合物。0033本发明中所述的4氧代2戊烯酸和组合物可以向应激对象特别是成年人施用。这是有利的，因为消化道炎症的症状通常受应激触发，并且应激可增加炎症性刺激对消化道的响应SMCOLLINS,AMERICANJOURNALPHYSIOLOGYGASTROINTESTINALANDLIVERPHYSIOLOGY,280,G315G3182001。随着人们年龄增加，在应激事件后的放松变得更困难。如果对象具有相对的成熟年龄，则认为他们是成年人。当对象性成熟且能够生育时，则通常认为他们。

22、是成年人。0034本发明中所述的4氧代2戊烯酸和组合物可以向儿童或青少年施用。术语“儿童”此处是指在出生和性成熟青春期开始之间的那些，而“青少年”是处于青春期与成年期之间。胃肠炎是儿童和青少年中最常见的消化障碍。每年在全世界有约10亿个事件发生，在发展中国家5岁以下的儿童中最常见。大多数患有克罗恩氏病的人们在35岁前，通常在15岁至25岁之间患上此病。溃疡性结肠炎可以在任何年龄开始，但是通常在15岁至30岁之间开始THEMERCKMANUALDIAGNOSISANDTHERAPY第19版。因此，可向儿童或青少年施用、用于治疗或预防消化道炎症性病症的组合物是有利的。0035儿童可以是年龄为至少5。

23、岁、至少7岁、至少10岁或至少12岁的人。0036青少年可以是年龄为至少13岁或至少14岁的人。0037成人可以是年龄为至少16岁、至少18岁或至少21岁的人。0038组合物的性质并不特别受限。其可以是用于口服或肠道施用的组合物。组合物可以是例如选自下组食品组合物、食品添加剂、营养品NUTRACEUTICAL、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。在本发明的范围内，术语营养品是指提供健康益处的食品，作为强化食品或饮食补充剂。0039组合物可以是食品组合物。根据本发明的食品组合物具有不同特征，例如乳、酸奶、奶酪、发酵乳、乳基发酵产品、冰淇淋、基于谷物的产品或发酵。

24、的基于谷物的产品、乳基粉末、冷冻的或耐贮藏的饮料、糖果、动物饲料特别对于家畜。0040食品组合物还可以进一步包含蛋白源、碳水化合物源、脂质源、矿物源和/或维生素源。蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物和/或维生素的存在可具有数种优势。这些化合物通常促成最终产品的味道和口感。它们还为身体提供当其受消化道病症影响时可急需的营养物。它们还允许将本发明的组合物配制成完整营养配方，以使无需另外的营养。说明书CN104220054A5/12页70041溶于水中的化合物具有以多种方式、包括作为溶液或以胶囊或片剂形式口服来方便施用的优势。包含4氧代2戊烯酸的组合物可以是水基的，例如组合物可以包含溶解于水中的4氧代2。

25、戊烯酸。0042本领域技术人员应理解，他们可自由地组合本文公开的本发明的所有特征。特别而言，可以组合对于本发明的不同实施方案所述的特征。本发明的另外的优势和特征根据下列附图和非限制性实例是明显的。0043图1示出短双岐杆菌ATCC15700TM的粗制品OD50，在90加热6小时的标准化荧光素酶活性。结果在Y轴上被表示成技术上一式三份的平均SD。X轴值为样品的最终稀释度。0044图2示出短双岐杆菌CNCMI3865的粗制品OD50，在90加热6小时的标准化荧光素酶活性。结果在Y轴上被表示成技术上一式三份的平均SD。X轴值为样品的最终稀释度。0045图3示出用0至200M剂量范围的4氧代2戊烯酸温。

26、育的AREC32细胞的NRF2诱导倍数棒和细胞活力百分比线。NRF2倍数诱导为在4氧代2戊烯酸存在下AREC32细胞的荧光素酶活性RLU与未暴露细胞的基底荧光素酶活性之间的比率。通过ATP定量测量的细胞活力表示为对照未治疗细胞的相对百分比。结果被表示为技术上一式三份的平均SD并且代表四个独立实验。0046图4示出用25至50V/V的剂量范围的短双岐杆菌CNCMI3865的“纯制品”温育的AREC32细胞的NRF2诱导倍数棒和细胞活力百分比线。其它细节如图3所示。0047图5示出用LPS刺激的HT29克隆34细胞的上清液中测量的SEAP实心棒和IL8条纹棒生成来估算的NFB活性。细胞活力用线示出。

27、。将细胞暴露于一定剂量范围的4氧代2戊烯酸。结果被表示为以技术上一式三份执行的两个独立实验的平均SD。0048图6示出在一定剂量范围的4氧代2戊烯酸存在下LPS刺激24H的05G/MLTHP1蓝色细胞的NFB活性棒和细胞活力线。结果被表示为以技术上一式三份执行的两个独立实验的平均SD。0049图7示出溶解于水中的4氧代2戊烯酸标准品的典型色谱图。较高的SRM与M/Z11369的跃迁反应相关联，而较低的SRM对应于M/Z11341的跃迁反应。保留时间以分钟X轴表示。信号强度Y轴以CPS表示。0050图8示出使用HPLCESIMS/MS、对在90以圆形表示、120以三角形表示和140以正方形表示加。

28、热2、15、30和60分钟的短双岐杆菌CNCMI3865OD40的粗制品的4氧代2戊烯酸定量。0051实施例1通过4氧代2戊烯酸和细菌部分的NRF2激活0052NRF2报告基因测定0053使用NRF2报告基因测定测量NRF2的激活。该测定基于来自CRX生物科学DUNDEE,SCOTLAND的AREC32细胞系，一种在ARE控制下含有荧光素酶基因构建体的稳定转染MCF7乳腺癌的细胞系。荧光素酶是消化荧光素并且产生荧光的酶。抗氧化分子如叔丁基氢醌TBHQ经由结合于ARE的NRF2激活而诱导荧光素酶转录。荧光素酶活性使用说明书CN104220054A6/12页8荧光素酶试剂盒形式PROMEGAMAD。

29、ISON,WI来确定。荧光素酶活性与NRF2激活成比例。0054通过细菌部分的NRF2激活0055使用三种细菌株来调查通过微生物的NRF2激活短双岐杆菌CNCMI3865NCC2950、短双岐杆菌CNCMI3914NCC466和短双岐杆菌ATCC15700TMNCC2791。短双岐杆菌CNCMI3914于2008年2月5日保藏于COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUDOCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0056对于各株，将10ML含有005半胱氨酸。

30、的MRS琼脂用20L甘油储液接种并在37在厌氧条件中温育过夜以形成预培养物。然后通过用预培养物接种10ML含有005半胱氨酸的MRS制备另外的培养物最终OD600调节为01。将培养物在37在厌氧条件中温育16小时以形成P2培养物。将200ML含有005半胱氨酸的MRS用P2培养物接种最终OD600调节为01且将瓶在37在厌氧条件中温育16小时。0057测量OD600，将培养物以3300G离心10MIN且将细菌沉淀物用冷1XPBS磷酸盐缓冲液盐水洗涤两次且用1XPBS标准化至OD50。0058对于各细菌株，用两种方法获得细菌部分；“粗制品”和“纯制品”。0059如下获得细菌“粗制品”。将5MLO。

31、D50细菌制品在90于加热块来自TECHNE,STAFFORDSHIRE,UNITEDKINGDOM的DRIBLOCKDB3加热块中加热6小时。将经过加热的细菌制品在4以3300G离心10MIN，将上清液使用022M注射器滤器过滤且在4贮藏直至进一步分析。0060如下获得细菌“纯制品”。将5MLOD50细菌制品在4以3300G离心10MIN且将细菌沉淀物用5ML水重悬浮。在冷藏室中使用迷你珠敲打MBB装置破坏细菌细胞6个循环，以最大速度各90秒，每个循环之间停顿10MIN。将经破坏的细胞在4以3300G离心1H，将沉淀物用5ML1XPBS重悬浮并且于加热块中在90加热6小时。将经过加热的制品在。

32、4以3300G离心10MIN。将上清液使用022M注射器滤器过滤并在4储存直至进一步分析。0061通过使用斑点法铺板来确定“OD50悬液”的活菌计数，并使用具有下列设置的卤素水分分析仪METLERTOLEDO,GREIFENSEE,SWITZERLAND确定干重干燥温度为160且激活步阶干燥。0062为了确定NRF2激活，将样品在AREC32细胞于96孔板中接种中使用10个独立稀释1/2、1/4、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/40和1/50测试且于5CO2/空气孵育箱中在37温育24小时。使用荧光素酶和来自PROMEGA的CELLTITERGLO试剂盒确定荧光素。

33、酶活性和细胞活力ATP测量。0063对于每次运行，用所有板中仅细胞的荧光素酶活性的平均值将所有孔的以相对光单位RLU测量的荧光素酶活性标准化。在测试的所有样品中，发现标准化程序不影响数据，这种观察允许不同运行中测量的样品的比较。0064对于每个样品，如下计算NRF2激活00651NRF2倍数诱导0066说明书CN104220054A7/12页90067NRF2倍数诱导对于筛选目的是非常有用的。然而，NRF2倍数诱导仅仅是定性测量，因为该计算不考虑样品稀释。00682每个样品的荧光素酶含量00690070“每个样品的荧光素酶含量”还反映NRF2激活，但可区分两个以类似NRF2倍数诱导激活NRF2。

34、的样品，因为该计算考虑样品稀释。0071每个样品的荧光素酶含量通过反映NRF2激活分子的量而允许NRF2激活的半定量。0072表A标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌ATCC15700TM的粗制品OD50，在90加热6小时的“每个样品的荧光素酶含量”的计算00730074每个样品的荧光素酶含量937E5X2187E60075科学符号94E5等于94X1050076表B标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌CNCMI3865的粗制品OD50，在90加热6小时的“每个样品的荧光素酶含量”的计算0077说明书CN104220054A8/12页100078每个样品的荧光素酶含量104E06X25260E070079。

35、如表A和B中图示，两个粗制品短双岐杆菌ATCC15700TM和短双岐杆菌CNCMI3865具有类似的最大NRF2诱导，但是具有不同荧光素酶含量/样品值。每个样品的荧光素酶含量值的差异反映它们相应的NRF2激活模式参见图1和2。0080相比之下，短双岐杆菌CNCMI3914并未显著地激活NRF2，参见比较表C。0081表C来自三种不同短双岐杆菌株粗制品的比较结果00820083表D来自三种不同短双岐杆菌株纯制品的比较结果00840085通过4氧代2戊烯酸的NRF2激活0086将4氧代2戊烯酸ALFAAESAR参考号L02185在NRF2报告基因测定中测说明书CN104220054A109/12页。

36、11试。将不同剂量的4氧代2戊烯酸应用于AREC32细胞上24小时，然后如上所述定量荧光素酶活性。还使用细胞TITERGLO试剂盒ATP定量测量细胞活力。0087如图3中所示，发现4氧代2戊烯酸分子以剂量依赖性方式强烈激活NRF2。AREC32细胞的活力不受低于70M剂量的4氧代2戊烯酸影响。NRF2激活的最佳剂量为约4050M。为了比较，图4示出，短双岐杆菌CNCMI3865的细菌部分以类似方式激活NRF2。0088实施例2通过4氧代2戊烯酸抑制NFB激活抗炎症效应0089发明人评价了4氧代2戊烯酸在促炎症性应激LPS和RHTNF下抑制NFB激活的能力。使用两个体外系统人结肠细胞HT29克隆。

37、34和人单核细胞/巨噬细胞THP1蓝细胞。0090HT29克隆340091人结肠腺癌HT29克隆34细胞系第4250代为用NFB/SEAP报告基因质粒稳定转染的粘附细胞。将它们在37于5CO2/空气孵育箱中、在含有1稳定的L谷氨酰胺且补充有10热灭活的在56，1小时胎牛血清FCSBIOCONCEPT,ALLSCHWIL,SWITZERLAND、1青霉素/链霉素SIGMA和500G/ML遗传霉素PAA,PASCHING,AUSTRIA的DMEM高葡萄糖45G/LINVITROGEN中培养。每两天更换培养基直至细胞单层达到90汇合。使用1X胰蛋白酶/EDTASIGMA对细胞继代培养。0092在平底。

38、白边96孔板GREINERBIOONE,KREMSMUENSTER,AUSTRIA中将10000个细胞/孔于200L培养基中接种。34天培养后即细胞达到7080汇合，去除培养基，将180L含有或不含剂量范围的4氧代2戊烯酸3至400M的实验培养基补充有50MMHEPES和5人乳HM的DMEM高葡萄糖，作为CD14和LPS结合蛋白LBP的来源，仅用于LPS刺激加至细胞中，并将板在37于5CO2/空气孵育箱中预温育4小时。加入20L含有或不含LPS055B5或RHTNF最终分别为100和10NG/ML的实验培养基，并将板在37于5CO2/空气孵育箱中温育24小时。0093然后，收集细胞培养物上清液。

39、用于测量NFB活性确定分泌的碱性磷酸酶和IL8产生，分别使用PHOSPHALIGHTAPPLIEDBIOSYSTEMS和IL8SINGLEPLEXMESOSCALE,GAITHERSBURG,MARYLAND试剂盒。0094细胞活力通过使用细胞TITERGLO试剂盒PROMEGA测量ATP来确定。简言之，在室温在水平振摇250RPM下将剩余的附着HT29克隆34细胞与120LCELLTITERGLO试剂于1XPBS中预稀释两次温育10MIN，使用增益值设定为3500的POLARSTAR微板读数器BMG,OFFENBURG,GERMANY测量发光1000MS。0095在缺少LPS下，以所测试剂量。

40、的4氧代2戊烯酸温育的HT29克隆34细胞的细胞培养物上清液中，观察到无NFB活性基于SEAP或IL8检测。0096HT29克隆34细胞的细胞活力的测量结果显示，在高于50M的4氧代2戊烯酸剂量下细胞活力下降图5。0097当炎症响应由LPS触发，4氧代2戊烯酸以剂量依赖性方式抑制NFB活性图5。4氧代2戊烯酸对SEAP和IL8分泌两者产生影响，最好的抑制为使用50M4氧代2戊烯酸。尽管不太明显，在用RHTNF刺激的细胞下观察到类似的结果。0098THP1蓝说明书CN104220054A1110/12页120099在37于5CO2/空气孵育箱中将人单核细胞/巨噬细胞THP1蓝细胞第1620代IN。

41、VIVOGEN,TOULOUSE,FRANCE在含有1MM丙酮酸钠、2MML谷氨酰胺、45G/L葡萄糖和10MMHEPES且补充有10热灭活的FCSBIOCONCEPT、1青霉素/链霉素SIGMA和500G/ML博来霉素INVIVOGEN的改性RPMI培养基ATCC,MANASSAS,VA中培养。0100在96孔平底透明板中将200000个细胞/孔接种于100L培养基中。在37于5CO2/空气孵育箱中温育24小时后，将80L含有或不含剂量范围的4氧代2戊烯酸5至200M的培养基加至细胞并在37预温育5小时。加入20L含有或不含LPS055B5SIGMA最终为100NG/ML的培养基并将板在37。

42、于5CO2/空气孵育箱中温育16小时。0101将细胞培养物上清液小心转移至96孔板用于NFB活性测量，其与分泌的碱性磷酸酶的水平成比例。简言之，将100L上清液与150LQUANTIBLUEINVIVOGEN在37温育3H的96孔板中混合，然后用SUNRISE微板读数器TECAN,MANNEDORF,SWITZERLAND在620NM进行OD测量。细胞活力使用如上所述的CELLTITERGLO试剂盒来确定。0102当用LPS刺激时，响应于约40至75M剂量的4氧代2戊烯酸，获得强NFB抑制。4氧代2戊烯酸在高于75M的剂量下对细胞有毒性图6。0103用HT29克隆34细胞和THP1蓝细胞产生的。

43、数据指示，4氧代2戊烯酸在促炎症性应激下抑制NFB激活。0104实施例3HPLCMS/MS对4氧代2戊烯酸的定量0105为了定量4氧代2戊烯酸，开发了涉及将高性能液相色谱与电喷雾离子化串联质谱法HPLCESIMS/MS耦合的高通量分析法。01064氧代2戊烯酸标准品购自ALFAAESARWARDHILL,USA。发现4氧代2戊烯酸可溶于水中以达到至少20MG/ML。将4氧代2戊烯酸标准品化合物溶解于水中以达到10MG/ML的最终储备溶液，并进一步稀释于水中以建立校准曲线。0107在与3200QTRAP质谱仪APPLIEDBIOSYSTEMS耦合的湍流色谱TFC系统THERMOFISHER,WA。

44、LTHAM,MA上进行HPLCESIMS/MS分析。使用的分析柱为购自THERMOFISHERWALTHAM,MA的HYPERSILGOLDAQ3X50MM,5M，其在室温和恒定流速600L/MIN下运行。流动相由溶剂A含有005乙酸的水和B含有005乙酸的甲醇构成。梯度程序为0MIN0B，以0B保持40秒0067MIN，在180秒内升至50B067367MIN，在10秒内从50B升至90B367383MIN，以90B保持120秒583MIN，之后回到0B且保持另外的300秒5831083MIN。注射体积为5L。0108以电喷雾负电离模式实现MS数据采集。使用T型接头，以流速10L/MIN注入。

45、与由溶剂A和B的HPLC流80/20,VV；06ML/MIN混合的4氧代2戊烯酸标准品5G/ML于水中的溶液来执行MS调节。氮气用于喷雾器和气帘气体，压力分别为70、30和20PSI。激活接口加热器且用设定在45KV的毛细管电压将块源温度保持在700。氮气还用作在中压选择下的碰撞气体。使用选择的反应监测SRM采集模式实现MS/MS检测。使用恒定停留时间50MS总扫描时间110MS，通过扫描M/Z11369碰撞能量11EV和M/Z11341碰撞能量26EV选择两个最强片段离子。去簇电压设定为29V。使用最强SRM信号执行定量分析，而基于由标准溶液计算的适当面积比，第二跃迁用于分析物确认。使用AN。

46、ALYST151软件APPLIEDBIOSYSTEMS执行数据处理。说明书CN104220054A1211/12页130109通过HPLCMS/MS检测PBS和水中的4氧代2戊烯酸0110将4氧代2戊烯酸溶解于1XPBS或水中，如前述章节中所述，执行HPLCMS/MS的检测。与跃迁反应M/Z11369相关的SRM揭示，其与保留时间125MIN处的跃迁M/Z11341相关联的SRM相比，信号更强。观察到两种转变的保留时间类似，确认分析的正确性图6。在1XPBS数据未示出和水图7中成功地检测到分子4氧代2戊烯酸。0111建立4氧代2戊烯酸标准曲线0112为了准确定量细菌部分中4氧代2戊烯酸的量，在。

47、简单基质如1XPBS或HPLC级水中建立4氧代2戊烯酸的标准曲线。将商购4氧代2戊烯酸以不同剂量悬浮于1XPBS和水中。然后将HPLCESIMS/MS方法用于定量所估计剂量的4氧代2戊烯酸。在1XPBS和HPLC级水中，均观察到4氧代2戊烯酸的量从01至25G/ML和所得强度以CPS表示之间存在良好线性。0113定量细菌部分中的4氧代2戊烯酸0114在来自实施例1的经过热处理的细菌制品中定量4氧代2戊烯酸。在HPLCESIMS/MS分析之前将所有样品在HPLC级水3次稀释/样品中稀释。结果概述于表E中。0115表E来自实施例1的经过加热的粗和纯细菌制品OD50在90加热6小时中4氧代2戊烯酸的。

48、浓度G/ML。ND表示“不可检测的”，低于方法的检测限。01160117实施例4加热温度和时间对4氧代2戊烯酸从短双岐杆菌CNCMI3865的产生的影响0118为了表征在热处理后4氧代2戊烯酸从短双岐杆菌CNCMI3865的产生，使用不同温度执行动力学实验。在厌氧和PH控制条件下，用于该实验的生物质的“主原料MASTERSTOCK”在生物反应器中在37用MRS培养基产生。在生长培养16H后，去除培养基且将细胞用1XPBS洗涤两次，于含有10甘油的1XPBS中浓缩至OD13415E10CFU/ML，然后在80以50ML等分试样储存。0119然后如下由生物质主原料制备短双岐杆菌CNCMI3865的。

49、“工作生物质”将生物质用1XPBS洗涤两次且于1XPBS中调节至OD40。0120使用温度加热装置THA来调查不同加热时间和温度的作用。该系统为在生产环境中发现的典型装置的小规模形式。使用蒸汽加热含有生物质套筒的保持管。将90、120和140的样品温度应用多达60分钟的时间。然后将5ML各经热处理的生物质以说明书CN104220054A1312/12页145000G离心10MIN且过滤上清液02M，通过HPLCESIMS/MS定量4氧代2戊烯酸含量。产生的4氧代2戊烯酸的量示于图8中。说明书CN104220054A141/6页15图1图2说明书附图CN104220054A152/6页16图3说明书附图CN104220054A163/6页17图4说明书附图CN104220054A174/6页18图5说明书附图CN104220054A185/6页19图6说明书附图CN104220054A196/6页20图7图8说明书附图CN104220054A20。