一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法.pdf

一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法，步骤为：A)将工程大肠杆菌按0.5-1.5％的接种量接种到400-500mL内含30-50μg·mL-1的卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养液中，35-37℃，200-250rpm条件下进行培养至OD600约为0.4-0.6时，再加入诱导剂IPTG至终浓度0.8-1mmol·L-1，继续培养3-24小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取上清液；B)发酵上清液，正己烷萃取，发酵液∶正己烷＝1∶2-4(V/V)，减压浓缩，制得游离脂肪酸。

1、  一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法，步骤为：
A)将工程大肠杆菌按体积比0.5-1.5％的接种量接种到400-500mL内含30-50μg·mL^-1的卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养液中，35-37℃，200-250rpm条件下进行培养至OD₆₀₀约为0.4-0.6时，再加入诱导剂IPTG至终浓度0.8-1mmol·L^-1，继续培养3-24小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取上清液；
B)发酵上清液，正己烷萃取，发酵液∶正己烷的体积比＝1∶2-4(V/V)，减压浓缩，制得游离脂肪酸。

2、  根据权利要求1所述的方法，其中，步骤A的工程大肠杆菌，是以植物或其它产脂细菌中基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到pET、pACYCDuet-1载体上，转化到大肠杆菌中，筛选获得阳性重组质粒，重组质粒在大肠杆菌中表达后，获得工程大肠杆菌。

3、  根据权利要求1所述的方法，其中，步骤B中的正己烷通过减压蒸馏后回收。

一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法
技术领域
本发明涉及一种制备游离燃料脂肪酸的方法，具体地是一种利用工程大肠杆菌制备游离燃料脂肪酸的方法。
背景技术
生物柴油作为一种清洁的可再生能源，具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性能好等液体能源产品所期望的优良性能，成为优质的化石柴油的替代品已受到世界上许多国家的关注和重视。目前，国内外主要以植物、动物及它们的废弃油脂为原料，经过化学或酶法转酯反应合成脂肪酸甲酯等燃料酯。早在100多年前，Rudolf Diesel就利用植物油作为燃料(Shay，1993)。近年来，利用菜籽油、大豆、棕榈油以及各种油料作物所提取的油脂为原料，油脂含量约为30-60％，油脂精炼过程繁琐，提取工艺复杂(需超声波或化学法破壁)，生产成本高，产量低(David Pimentel，2005；韩明汉等，2006)。据报道，若以植物油脂来生产生物柴油，即使美国总土地的24％用于种植油料植物，也只能满足50％的燃料需求，2006年美国石化柴油平均价格为$0.49/L，而以棕榈油制得的生物柴油约$0.66/L，比石化柴油价格高35％，限制了生物柴油替代传统石化油的发展(Y.Chisti，2007)。从总体来看，这一路线存在的最重要问题和挑战，即是原料脂肪酸甘油酯的成本问题，原料成本占总生产成本的70％～85％，如油料植物的种植，占用了大量的耕地面积，且由于产量有限无法满足工业需求，较高的原材料成本使得生物柴油的价格远远高于传统柴油，这严重地制约了生物柴油的产业化进程。因此，低成本生物柴油的生产需要解决的前提是油质原料来源问题。微生物油脂是多种脂肪酸的混合物，其脂肪酸组成和植物油相近。利用微生物油脂为原料制备生物柴油在未来生物柴油产业中将发挥重要作用，是当今可再生能源领域技术研究的热点之一。与动、植物油脂相比，利用微生物制备油脂具有许多优点：微生物细胞增殖快，生产周期短；微生物生长所需的原料丰富(如淀粉、糖类、木质纤维类物质等)，价格便宜；能连续大规模生产，生产成本低；不受季节、气候变化的限制。微藻类是目前研究较热的产油微生物，油脂含量为细胞干重的50-80％，被认为是替代植物油脂生产生物柴油的首选(Miline et al，1990；Spolaore et al.，2006；缪晓玲等，2006)。在美国，总土地的1-3％用于生产藻类，就可以满足50％的燃料需求(Y.Chisti，2007)。但由于天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂产量有限，占用耕地面积大，生产成本偏高，且天然脂肪酸多为胞内分泌，必需从组织、细胞中分离后，才能用于生物柴油生产，这一过程关系到生物柴油的质量、成本。
随着现代分子生物学和生物化工技术的发展，对产油微生物茵种筛选、改良、代谢调控和发酵工程的研究日趋深入。通过基因工程手段，调节脂肪酸合成的相关酶的活性，增加脂肪酸合成，定向调控分泌形式，是利用微生物合成生物柴油的前沿技术问题，将降低微生物油脂生产成本，为未来生物柴油产业提供廉价原料。与天然菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚，易于工程调控，可高密度发酵，生长速度快等诸多优点，已经成为微生物催化合成化学品和燃料的理想受体菌。利用工程大肠杆菌生产燃料脂肪酸是不与作物争地、不靠天生产的生物柴油生产新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法。本发明首次采用工程大肠杆菌制备燃料游离脂肪酸，提供了一条生物柴油生产新途径。
为实现上述目的，本发明提供的工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法，步骤为：
A)将工程大肠杆菌按0.5-1.5％(v/v)的接种量接种到400-500mL内含30-50μg·mL^-1的卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养液中，35-37℃，200-250rpm条件下进行培养至OD₆₀₀约为0.4-0.6时，再加入诱导剂IPTG至终浓度0.8-1mmol·L^-1，继续培养3-24小时，诱导表达目的蛋白；培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取上清液；
B)发酵上清液，正己烷萃取，发酵液∶正己烷＝1∶2-4，减压浓缩，制得游离脂肪酸。
所述的方法，其中，步骤A的工程大肠杆菌，是以植物或其它产脂细菌中基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到pET载体上，转化到大肠杆菌中，筛选获得阳性重组质粒，重组质粒在大肠杆菌中表达后，获得工程大肠杆菌。
所述的方法，其中，步骤B中的正己烷通过减压后回收。
与公知技术相比，本发明具有以下优点：
1)微生物油脂发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等的影响，不占用额外耕地资源，易于连续工业化生产。
2)微生物能高效利用半纤维素和纤维素水解得到所有碳水化合物，对解决生物质经济中“全糖转化利用”很有价值。
3)脂肪酸以游离形式分泌到胞外，便于分离。
4)发酵液得到了高浓度的游离脂肪酸，克服了生物柴油生产中原料脂肪酸甘油酯的高成本、脂肪酸低产量及胞内脂肪酸不易分离的问题。
具体实施方式
本发明提供的工程大肠杆菌制备游离脂肪酸的方法，克服了生物柴油生产中原料脂肪酸甘油酯的高成本、脂肪酸低产量及胞内脂肪酸不易分离的问题。本发明通过以下技术方案解决这一技术问题：以植物或其它产脂细菌中基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到pET载体上，转化到大肠杆菌中，筛选获得阳性重组质粒，质粒经纯化、电泳检测鉴定目的基因。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后，继续培养，在发酵液中即可获得游离脂肪酸，提取发酵液中的游离脂肪酸，即可用于生物柴油生产。
本发明提供的方法，在大肠杆菌中表达了调控脂肪酸合成及脂肪酸胞外分泌的关键酶基因，可高密度发酵，生长速度快，为生物柴油生产提供大量低成本、高品质的游离脂肪酸。
实施步骤
以不同来源的产脂细菌或植物基因组DNA为模版，PCR分别扩增获得乙酰辅酶A羧化酶基因(Acetyl-CoA carboxylase)、硫脂酶基因[acyl-acylcarrier protein(ACP)thioesterase]，用胶回收试剂盒回收目的片段，用相应的限制性内切酶分别酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)，并于16℃过夜连接，即为构建好的原核表达载体；将构建好的重组质粒42℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，即可获得工程大肠杆菌；将工程菌按1％的接种量接种到50mL LB培养液中，快速振荡培养，在菌液中加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol·L^-1，继续在37℃快速振荡培养3-5h，诱导表达目的蛋白；提取发酵液中的游离脂肪酸，测定胞外脂肪酸浓度及产率，即为制备好的游离燃料脂肪酸。
工程大肠杆菌制备游离燃料脂肪酸的具体实验步骤如下：
(一)脂肪酸调控相关酶基因的克隆及重组载体构建
1.1乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆
提取细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增分别克隆下列基因：
accA：acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit)NCBI：2878570；
accBC(含accB和accC基因)：accB：biotin carboxyl carrier protein ofacetyl-CoA，NCBI：2878571；accC：acetyl-CoA carboxylase，NCBI：2880668；accD：acetyl-CoA carboxylase，beta subunit，NCBI：2878573；
再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
1.2硫脂酶基因的克隆
提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)总RNA，以其为模板反转录成cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增克隆硫脂酶基因(acyl-acylcarrier protein(ACP)thioesterase)，NCBI：BT024746。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
1.3pA-accADBC重组载体的构建
1.3.1pET-accA载体的构建
将克隆的accA基因与pET-30a载体(购于Novagen公司)用相同的酶进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accA。
1.3.2pA-accBC载体的构建
将克隆的accBC基因与pACYCDuet-1(购于Novagen公司)载体用相同的酶进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pA-accBC。
1.3.3pET-accD载体的构建
将克隆的accD基因与pET-30a载体用相同的酶进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accD。
1.3.4pA-accADBC重组载体的构建
以pET-accD质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的accD基因即：T7accD；用相同的限制性酶酶切pET-accA与T7accD，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pET-accAD；再用相同的限制性酶酶切pET-accAD与pA-accBC，载体pA-accBC与外源片段accAD按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pA-accADBC。
1.4pET-TE重组载体的构建
将克隆的硫脂酶基因(TE)与pET-30a载体用相同的酶进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pET-TE。
(二)含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因工程大肠杆菌的构建
将构建好的重组载体42℃热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；再将pA-accADBC重组质粒42℃热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因、硫脂酶基因的工程大肠杆菌；-80℃保存该菌株。
(三)工程大肠杆菌诱导表达
将工程大肠杆菌按1％的接种量接种到50mL LB液体培养液中(内含30-50μg·mL^-1的卡那霉素或氨苄青霉素)，37℃快速剧烈振荡培养(约3h)，当OD₆₀₀约为0.4-0.6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol·L^-1，继续在37℃快速振荡培养3-5h，诱导表达目的蛋白；取出诱导后的培养液，8000rpm离心10min，取沉淀并称重，将沉淀用0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸3-5min，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到表达的相应融合蛋白条带。
(四)游离脂肪酸的合成
将工程大肠杆菌按1％的接种量接种到500mL LB液体培养液中(内含30-50μg·mL^-1的卡那霉素或青霉素)，37℃，250rpm条件下进行培养，当OD₆₀₀约为0.4-0.6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol·L^-1，继续在37℃，250rpm条件下，培养3-24h。培养液在8000rpm条件下，离心10min，取含游离脂肪酸的上清液保存。
(五)游离脂肪酸的提取
发酵上清液中的游离脂肪酸，经正己烷萃取三次(发酵液/己烷的体积比1∶2-4)，回收正己烷并减压浓缩，制得游离脂肪酸。