一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌.pdf

本发明公开了一种厌氧降解纤维素产甲烷的复合菌，该复合菌由13株菌组成，这13株菌分属兼性厌氧和严格厌氧的发酵性细菌、产氢产乙酸细菌和产甲烷菌，该复合菌不仅能高效厌氧降解纤维素，而且可以利用纤维素的降解产物产甲烷，可以广泛应用于秸秆沼气发酵、堆肥处理等转化过程。

1.  一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌，其特征是：该复合菌由以下13个菌株组成：
Cytophaga fermentans发酵噬纤维菌，细胞呈可弯曲杆状，兼性厌氧，有氧条件下分解纤维素产生乙酸、丙酸、琥珀酸、H₂和CO₂等，同时可产生黄色素，菌株保藏编号ATCC 19072，DSM 9555；
Acetobacterium woodii伍氏醋酸杆菌，细胞椭圆或短杆，单生、成对偶尔成短链，严格厌氧，氧化氢、还原CO₂生成乙酸，也发酵果糖和其他底物产生乙酸，菌株保藏编号ATCC 29683，DSM 1030；
Desulfovibrio vulgaris普通脱硫弧菌，弧状，以硫酸盐作为电子受体，还可以代谢碳水化合物、蛋白胨及其代谢中间产物，产生挥发酸，菌株保藏编号ATCC 29579，DSM 644；
Cellulomonas flavigena产黄纤维单胞菌，细长杆状，能分解纤维素，还可以利用葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厌氧条件下产酸，菌株保藏编号ATCC 482，DSM 20109；
Butyrivibrio fibrisolvens溶纤维丁酸弧菌，弧状，严格厌氧，分解纤维素产生有机酸，同时可产生降解半纤维素的半纤维素酶，菌株保藏编号ATCC19171，DSM 3071；
Clostridium papyrosolvens溶纸梭菌，直杆，严格厌氧，水解纤维素产生乙酸、乙醇和H₂等，菌株保藏编号ATCC 35413，DSM 2782；
Clostridium cellobioparum产纤维二糖梭菌，弯曲或直杆状，水解纤维素产生纤维二糖等，菌株保藏编ATCC 15832，DSM 1351；
Clostridium termitidis弯曲或直杆状，水解纤维素产生乙酸、乙醇和H₂等，菌株保藏编号ATCC 51846，DSM 5398；
Syntrophomonas Wolfei沃尔夫伴生单胞菌，轻微螺杆状，不产芽孢，分解丁酸产生乙酸和H₂，与产甲烷菌互营，菌株保藏编号DSM 4212；
Methanosarcina barkeri巴氏甲烷八叠球菌不对称球形，能够不规则聚集成团，利用甲醇、三甲胺、乙酸和H₂/CO₂生长产甲烷，菌株保藏编号ATCC43241，DSM 1538；
Methanobrevibacter arboriphilicus嗜树木甲烷短杆菌，短杆菌，单生、成对或成串，只利用H₂/CO₂生长产甲烷，菌株保藏编号ATCC 33747，DSM 1125；
Methanosphaera stadtmaniae斯氏甲烷球形菌不规则球状，单生或成对，极端严格厌氧，利用H₂/CO₂和甲酸盐生长产甲烷，要求乙酸等作为有机生长因子，菌株保藏编号ATCC 43021，DSM 3091；
Methanococcus vannielii万氏甲烷球菌，规则或不规则球形，极端严格厌氧，利用H₂/CO₂和甲酸盐生长产甲烷，菌株保藏编号ATCC 35089，DSM 1224。

2.  根据权利要求1所述的降解纤维素产甲烷复合菌，其特征是：上述13株菌株在复合菌中的细胞数含量分别为，Cytophaga fermentans占5-10％，Clostridium papyrosolvens占25-35％，Desulfovibrio vulgaris占1-3％，Butyrivibrio fibrisolvens 2.5-5％，Acetobact erium woodii占5-10％，Cellulomonas flavigena占1-5％，Clostridium termitidis占1-5％，Clostridium cellobioparum占2.5-5％，Syntrophomonas Wolfei 5-10％，Methanosarcina barkeri占10-20％，Methanobrevibacter arboriphilicus占10-15％，Methanosphaera stadtmaniae 5-8％，Methanococcus vannielii占2.5-5％。

一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌
技术领域
本发明涉及纤维素降解及能源化利用技术领域，特别涉及一种厌氧降解纤维素产甲烷的复合菌。
背景技术
天然纤维类物质是地球上最丰富的生物质，除少部分被利用外，绝大多数以废弃物的形式存在于自然环境中。为了充分开发利用这类丰富的可再生资源，早在1883年和1886年就有学者开始研究纤维素的生物降解，特别是由于近年来石油、煤等化石能源价格不断攀升，纤维素生物转化为新能源的问题更是得到国内外学者的广泛关注。
自然状态下，纤维素的彻底降解是在微生物体系中由多种微生物长时间相互作用的结果，这一过程仅靠一种微生物是无法实现的。因为纯培养物具有以下缺点：即产酶单一，纤维素的分解产物纤维二糖与葡萄糖能够抑制纤维素酶的活性以及阻遏纤维素酶的合成，挥发酸的积累会使培养液pH容易下降到很低而无法恢复到适合培养物生长的条件，从而使纤维类物质的转化效率低；而且在不经过预处理和/或灭菌的情况下，利用纯培养物和纯酶降解木质纤维素具有一定的难度。因此，在进行纤维素大分子降解的研究过程中要考虑到微生物之间的协同作用。
多菌株混合培养，不仅产酶具有多样性，同时可以解除产物的反馈抑制，调节培养液的pH，从而提高纤维素的转化率。与纯培养物相比，混合菌群中微生物间稳定的协同关系，对分解像纤维素这样的生物大分子的具有不可比拟的优势。多菌株混合培养，多种酶协同作用，可较快和较彻底地解除产物的反馈抑制，调节培养液的pH，提高纤维素的转化率。中国专利说明书CN 1335288A公开了一种有机物快速腐熟菌剂，该发明将具有高效稳定分解纤维素能力的混合菌系用于堆肥，其注重纤维素的分解率，对纤维素的去向并不十分关心。中国专利说明书CN 1896254A公开了一种混合菌群降解发酵木质纤维素类物质生产酒精的方法，该发明的技术方案是将纤维素降解的产物转化为酒精。
2008年，农业部沼气科学研究所罗辉的硕士论文《高效厌氧纤维素降解菌的筛选，复合菌系的构建及应用研究》中公开了具有降解纤维素产甲烷能力的两个天然复合菌系，这两个天然复合菌系均由好氧菌和厌氧菌组成，包含沼气发酵中的三大主要功能菌群，即纤维素降解菌群、产氢产乙酸菌群和甲烷菌群，是典型以纤维素降解为主，具有较为完整的沼气各功能微生物的天然复合菌系。这两个天然复合菌系虽然都具有较强的纤维素降解能力和产甲烷能力，但是这种自然发酵物菌剂中所含的菌种是在自然的被动发酵过程中无序的集合而成的多菌联合体，无法掌握其菌种组成，使用效果难以控制；而且这种天然复合菌系被动的遵循自然循环规律，其分解效果难以保持稳定性。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种能高效厌氧转化纤维素为甲烷且效果稳定，易于控制，分解效率高的复合菌。
为了解决上述问题，本发明的复合菌由以下13个菌株组成：
(1)Cytophaga fermentans发酵噬纤维菌，细胞呈可弯曲杆状，兼性厌氧，有氧条件下分解纤维素产生乙酸、丙酸、琥珀酸、H₂和CO₂等，同时可产生黄色素，菌株保藏编号ATCC 19072，DSM 9555；
(2)Acetobacterium woodii伍氏醋酸杆菌，细胞椭圆或短杆，单生、成对偶尔成短链，严格厌氧，氧化氢、还原CO₂生成乙酸，也发酵果糖和其他底物产生乙酸，菌株保藏编号ATCC 29683，DSM 1030；
(3)Desulfovibrio vulgaris普通脱硫弧菌，弧状，以硫酸盐作为电子受体，还可以代谢碳水化合物、蛋白胨及其代谢中间产物，产生挥发酸，菌株保藏编号ATCC 29579，DSM 644；
(4)Cellulomonas flavigena产黄纤维单胞菌，细长杆状，能分解纤维素，还可以利用葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厌氧条件下产酸，菌株保藏编号ATCC 482，DSM 20109；
(5)Butyrivibrio fibrisolvens溶纤维丁酸弧菌弧状，严格厌氧，分解纤维素产生有机酸，同时可产生降解半纤维素的半纤维素酶，ATCC 19171，DSM3071；
(6)Clostridium papyrosolvens直杆，严格厌氧，水解纤维素产生乙酸、乙醇和H₂等，菌株保藏编号ATCC 35413，DSM 2782；
(7)Clostridium cellobioparum产纤维二糖梭菌，弯曲或直杆状，水解纤维素产生纤维二糖等，菌株保藏编ATCC 15832，DSM 1351；
(8)Clostridium termitidis弯曲或直杆状，水解纤维素产生乙酸、乙醇和H₂等，菌株保藏编号ATCC 51846，DSM 5398；
(9)Syntrophomonas Wolfei沃尔夫伴生单胞菌，轻微螺杆状，不产芽孢，分解丁酸产生乙酸和H₂，与产甲烷菌互营，菌株保藏编号DSM 4212；
(10)Methanosarcina barkeri巴氏甲烷八叠球菌不对称球形，能够不规则聚集成团，利用甲醇、三甲胺、乙酸和H₂/CO₂生长产甲烷，菌株保藏编号ATCC43241，DSM 1538；
(11)Methanobrevibacter arboriphilicus嗜树木甲烷短杆菌，短杆菌，单生、成对或成串，只利用H₂/CO₂生长产甲烷，菌株保藏编号ATCC 33747，DSM1125；
(12)Methanosphaera stadtmaniae斯氏甲烷球形菌不规则球状，单生或成对，极端严格厌氧，利用H₂/CO₂和甲酸盐生长产甲烷，要求乙酸等作为有机生长因子，菌株保藏编号ATCC 43021，DSM 3091；
(13)Methanococcus vannielii万氏甲烷球菌，规则或不规则球形，极端严格厌氧，利用H₂/CO₂和甲酸盐生长产甲烷，菌株保藏编号ATCC 35089，DSM 1224。
以上菌株均可通过德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)或美国典型培养物中心(ATCC)获得。
本发明的复合菌由13株菌组成，按照代谢途径的不同，可以将这13株菌分为以下5类：
厌氧纤维素分解菌：Clostridium papyrosolvens，Clostridiumtermitidis，Clostridium cellobioparum，Butyrivibrio fibrisolvens；
兼性厌氧纤维素分解菌：Cytophaga fermentans，Cellulomonasflavigena；
其它发酵性细菌：Acetobacterium woodii；Desulfovibrio vulgaris；
互营菌：Syntrophomonas Wolfei；
产甲烷菌：Methanosarcina barkeri，Methanobrevibacterarboriphilicus，Methanosphaera stadtmaniae，Methanococcus vannielii。
在含有纤维素的培养基中，上述复合菌协同作用，在降解纤维素的同时生成甲烷。具体说就是厌氧纤维素分解菌和兼性厌氧纤维素分解菌分解培养基中的纤维素，得到葡萄糖和有机酸类物质，葡萄糖和有机酸等被产氢产酸细菌进一步降解为H₂、CO₂和乙酸等，培养基中的蛋白质及其他大分子底物被Desulfovibrio vulgaris和Acetobacterium woodii分解为氨基酸及其他有机酸，氨基酸作为复合菌生长的氮源进一步被分解，其他有机酸被产氢产酸细菌进一步降解为H₂、CO₂和乙酸等。上述不产甲烷的细菌可把各种复杂的有机物，如碳水化合物、蛋白质等厌氧分解生成H₂、CO₂、NH₃、乙醇、乙酸、丙酸、丁酸等，丙酸、丁酸还可被氢细菌和乙酸细菌分解转化成H₂、CO₂和乙酸，为甲烷细菌提供了合成细胞质和形成甲烷的碳前体，电子供体——氢供体和氮源，使甲烷细菌利用这些物质最终形成甲烷。
作为本发明的一种改进，13株菌株在复合菌中的细胞数含量为：Cytophagafermentans占5-10％，Clostridium papyrosolvens占25-35％，Desulfovibriovulgaris占1-3％，Butyrivibrio fibrisolvens 2.5-5％，Acetobacterium woodii占5-10％，Cellulomonas flavigena占1-5％，Clostridium termitidis占1-5％，Clostridium cellobioparum占2.5-5％，Syntrophomonas Wolfei 5-10％，Methanosarcina barkeri占10-20％，Methanobrevibacter arboriphilicus占10-15％，Methanosphaera stadtmaniae 5-8％，Methanococcus vannielii占2.5-5％。
本发明中菌株在复合菌中的细胞数含量的含义是指复合菌中各菌株细胞数占复合菌总细胞数的百分含量。
本发明的复合菌用于厌氧降解纤维素类物质产甲烷时，可快速高效水解纤素，加快发酵启动，提高甲烷含量。
本发明的复合菌对含纤维素的原料有较好的降解效果，以稻草原料为例，本发明的复合菌处理15天，对稻草的降解率为63.8％到75.9％，处理30天，对稻草的降解率为79.4％到89.2％。
本发明的复合菌在高效降解纤维素的同时，还可以产生甲烷。在以稻草为原料，处理30天的发酵试验中平均每天甲烷产率可达到0.41m³/天·kg·TS(TS为总固形物含量)，其中甲烷含量达64.8％。
本发明的复合菌由13株菌组成，其数量和菌株种类确定且已知，在应用于纤维素降解产甲烷时，针对不同的纤维素类物质，如稻草、小麦秸秆、玉米秸秆、城市固体垃圾等，可以通过简单的试验确定不同菌株的确切配比，其效果稳定且易于控制。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本发明中菌株在复合菌中的细胞数含量的含义是各菌株细胞数占复合菌总细胞数的百分含量。本发明中甲烷和CO₂的百分含量(％)是指甲烷和CO₂在混合气体中的体积百分含量。本发明中TS是指纤维素中所含固形物质。实施例中“甲烷产率(m³/天·kg·TS)”指每kg含纤维素的固形物经复合菌处理后，每天产生的含甲烷气体在一个大气压下，25℃时的体积(m³)，“甲烷含量(％)”是指甲烷气体的体积占含纤维素的固形物经复合菌处理后产生的含甲烷气体总体积的百分比，二氧化碳含量(％)是指二氧化碳气体的体积占含纤维素的固形物经复合菌处理后产生的含甲烷气体总体积的百分比，降解率是指含纤维素的固形物经复合菌处理后所减少的重量占其初始重量的百分比。实施例中菌株在复合菌中的细胞数含量的含义是指复合菌中各菌株细胞数占复合菌总细胞数的百分含量。
实施例1：
一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌，由以下13株菌组成，13株菌株在复合菌中的细胞数含量为：Cytophaga fermentans占10％，Clostridiumpapyrosolvens占25％，Desulfovibrio vulgaris占1％，Butyrivibriofibrisolvens 5％，Acetobacterium woodii占5％，Cellulomonas flavigena占1％，Clostridium termitidis占1％，Clostridium cellobioparum占2.5％，Syntrophomonas Wolfei 5％，Methanosarcina barkeri占19％，Methanobrevibacter arboriphilicus占15％，Methanosphaera stadtmaniae 8％，Methanococcus vannielii占2.5％。
具有上述组成的复合菌接入以稻草为碳源的纤维素液体培养基中，密封静置培养。培养15天和30天的稻草降解效果和所产生的气体浓度结果见下表：

实施例2：
一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌，由以下13株菌组成，13株菌株在复合菌中的细胞数含量为：Cytophaga fermentans占7.5％，Clostridiumpapyrosolvens占35％，Desulfovibrio vulgaris占3％，Butyrivibriofibrisolvens 4％，Acetobacterium woodii占5％，Cellulomonas flavigena占5％，Clostridium termitidis占3％，Clostridium cellobioparum占5％，Syntrophomonas Wolfei 5％，Methanosarcina barkeri占10％，Methanobrevibacter arboriphilicus占10％，Methanosphaera stadtmaniae 5％，Methanococcus vannielii占2.5％。
具有上述组成的复合菌接入以稻草为碳源的纤维素液体培养基中，密封静置培养。培养15天和30天的稻草降解效果和所产生的气体浓度结果见下表：

实施例3：
一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌，由以下13株菌组成，13株菌株在复合菌中的细胞数含量为：Cytophaga fermentans占6％，Clostridiumpapyrosolvens占25％，Desulfovibrio vulgaris占2％，Butyrivibriofibrisolvens 4％，Acetobacterium woodii占10％，Cellulomonas flavigena占5％，Clostridium termitidis占3％，Clostridium cellobioparum占3％，Syntrophomonas Wolfei 10％，Methanosarcina barkeri占13％，Methanobrevibacter arboriphilicus占10％，Methanosphaera stadtmaniae4％，Methanococcus vannielii占5％。
具有上述组成的复合菌接入以稻草为碳源的纤维素液体培养基中，密封静置培养。培养15天和30天的稻草降解效果和所产生的气体浓度结果见下表：

实施例4：
一种厌氧降解纤维素产甲烷复合菌，由以下13株菌组成，13株菌株在复合菌中的细胞数含量为：Cytophaga fermentans占5％，Clostridiumpapyrosolvens占30％，Desulfovibrio vulgaris占1％，Butyrivibriofibrisolvens 2.5％，Acetobacterium woodii占6％，Cellulomonas flavigena占2％，Clostridium termitidis占1％，Clostridium cellobioparum占3％，Syntrophomonas Wolfei 8％，Methanosarcina barkeri占20％，Methanobrevibacter arboriphilicus占13％，Methanosphaera stadtmaniae5％，Methanococcus vannielii占3.5％。
具有上述组成的复合菌接入以稻草为碳源的纤维素液体培养基中，密封静置培养。培养15天和30天的稻草降解效果和所产生的气体浓度结果见下表：