麻花艽ΒAMYRIN合成酶基因GSAS1及其应用.pdf

本发明公开了一种麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及含所述基因GsAS1的酵母和植物表达载体，同时还公开了所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及含所述基因GsAS1的植物表达载体在制备齐墩果酸中的应用。本发明为提高目标产物齐墩果酸含量提供了理论依据和实践基础。

1、  一种麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQID No.1所示。

2、  一种含有权利要求1所述基因GsAS1的酵母表达载体pPICZA-GS1，其特征在于：所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3、  一种含有权利要求1所述基因GsAS1的植物表达载体pROK-AS1，其特征在于：所述植物表达载体核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4、  权利要求1所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1在制备齐墩果酸中的应用。

5、  权利要求3所述植物表达载体pROK II在制备齐墩果酸中的应用。

麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及齐墩果酸相关基因——β-amyrin合成酶基因GsAS1及功能验证。
背景技术
植物次生代谢是指有些生物体利用某些初生代谢产物为“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质的过程，这些特殊的化学物质即为次生代谢产物，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等，它们是植物中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物，但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展却起着不可替代的作用。
植物次生代谢产物具有重要的经济价值。临床应用的药物，有很多都是取自植物的次生代谢产物。西方的临床药物中，大约25％是直接或间接地从植物中提取的次生代谢物。在我国，药用植物的应用历史更为悠久。此外，用作食品调味剂、日用芳香剂、杀虫剂等的植物次生代谢产物也倍受人们的青睐。
随着基因工程技术的不断完善，对植物细胞代谢网络进行修饰和改造来积累大量目的产物已成为可能。目前，次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。应用关键酶基因的代谢工程为提高植物组织、细胞培养及整体植株代谢产物的产量提供了技术平台。
植物次生代谢产物种类繁多，生物合成途径也千差万别，只有在了解目标植物特定次生代谢途径的基础上，才能有选择地进行有效的基因操作。因此，植物次生代谢图谱的研究是植物次生代谢基因工程必要的前提工作。
植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。现在，已知大约有10000种次生代谢物，包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物三大类。萜类化合物(terpenoids)是植物次生代谢产物中最大的一个家族，在自然界中广泛分布，由异戊二烯(isoprene，C5)单元组成的化合物及其衍生物，按碳原子的数目可以分为单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和多萜等。由于多数萜类化合物分子中具有不同的碳环数，因此又可分为链萜、单环萜、双环萜和三环萜等。其中三萜类化合物是由六个异戊二烯单元组成的物质。广泛存在于动植物体内，以游游离状态或成酯或苷的形式存在。多数是含氧衍生物，为树脂的主要成分之一。例如甘草中的干草苷称为甘草酸，因其味甜又称甘草甜素，在酸性条件下水解得到的苷元称为甘草次酸，可溶于乙醇和氯仿中，是一个五环三萜化合物。角鲨烯是存在于鲨鱼的鱼肝油、橄榄油、菜籽油中的一个链状三萜，它是由一对三个异戊二烯单元头尾连接后的片段互相对称连接而成，具有降低血脂和软化血管等作用，被誉为血管清道夫。
中草药是中国传统的药用植物，其有效成分绝大多数都来源于次生代谢产物，在植物中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量难度很大。通过次生代谢的基因工程，来提高中药材有效成分含量的研究刚刚起步。有效成分相关基因的克隆及其功能鉴定的有效方法还较少，且耗时，所获得的次级代谢途径中的相关基因较少。
高寒藏药麻花艽系龙胆科(Gentianaceae)、龙胆属(Gentiana)，主要分布于西藏、青海、甘肃海拔2500-4700米的高寒地区，多年生草本，全草及根入药，由于其分布散，生长期长，药材收集极为困难，因而已成为濒危物种。主治黄胆性肝炎，风湿关节痛、结核病潮热、哮喘、抽搐、休克、过敏反应。富含五环三萜类次生代谢物，β-amyrin(β-香树素)是其中的一类重要的三萜类化合物。
β-amyrin是植物中最常见的三萜类化合物之一。它的五碳环骨架，折叠为椅式构象，是由2，3-氧化角鲨烯经过一系列反应在β-amyrin合成酶催化下形成的(Kushiro et al.，1998)。而其合成酶是该途径中非常重要的限速酶，控制着这些药用成分前体合成的第一步反应，因此对该基因的克隆具有极其重要的意义。齐墩果酸是该反应中的最终产物，在龙胆科植物麻花艽中β-amyrin合成酶基因对于抗肝炎有效成分齐墩果酸的积累具有很高的促进作用。
到现在为止，已从许多双子叶植物中分离到了β-amyrin合成酶基因，如双子叶人参中的PNY1(Kushiro et al.，1998)，PNY2(Kushiro et al.，1998)；干草中的GgbAS1(Hayashiet al.，2001)；豌豆中的PSY(Morita et al.，2000)；还有截形苜蓿(Suzuki et al.，2002)和白桦(Zhang et al.，2003)等：单子叶植物燕麦中的AsbAS1(Haralampidis et al.，2001)。并有文章报道对其功能的验证。对于
尽管目前已经在许多物种中克隆到β-amyrin合成酶基因，但是对于龙胆科植物麻花艽来说该基因都克隆、功能验证并在植物转化中应用还未见报道，并且对于该基因与齐墩果酸关系的研究也是未见报道。本发明在麻花艽中克隆得到的基因GsAS1与其他物种中的类似基因相比同源性在50-75％之间，但是对于其保守区都分析发现：麻花艽中β-amyrin合成酶基因GsAS1的氨基酸序列含有4个QW和1个DCTAE基元，在已知其它物种中的β-amyrin合成酶基因都含有该基元，而该结构上的特征对于其功能的发挥具有一定的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种麻花艽中齐墩果酸相关基因——β-amyrin合成酶基因及其在制备齐墩果酸中的应用。
本发明的技术方案是：从麻花艽中分离得到β-amyrin合成酶基因GsAS1，在真核系统中验证功能，然后将该基因转到原植株麻花艽中得到高齐墩果酸含量的转基因植株。
本发明提供的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种含上述的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1的酵母表达载体pPICZA，其特征在于：所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种含上述的麻花艽β-amyrin合成酶基GsAS1的植物表达载体pROK II，其特征在于：所述植物表达载体核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
该植物表达载体PROK II都构建主要通过以下四步完成：1)带有SacI和XbalI酶切位点的引物扩增目的基因GsAS1；2)将目的基因GsAS1克隆入pMD18-T载体；3)将含有GsAS1基因的pMD18-T载体和PROK II载体分别用SacI和XbalI进行双酶切；4)将回收的GsAS1基因和PROKII载体连接。
本发明所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1在制备齐墩果酸中的应用。
实验证实：将GsAS1基因转化进原植株麻花艽中，通过该基因的过表达使齐墩果酸含量得到大的提高，其中齐墩果酸的含量通过HPLC方法测定。
本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了麻花艽的β-amyrin合成酶基因GsAS1并在毕赤酵母中进行功能验证，通过基因枪转化的方法将该基因转入原植株麻花艽中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的齐墩果酸含量可提高1倍以上。所以对于该基因GsAS1的研究具有重要都意义和应用前景。
附图说明
图1为麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1的cDNA电泳图，其中：1为GsAS1基因的cDNA，M为Marker。
图2为转β-amyrin合成酶基因GsAS1后麻花艽阳性愈伤组织筛选图。
图3为转基因麻花艽DNA鉴定图，其中：泳道1为Marker，泳道2、4、6、8、10、12均为麻花艽转基因植株的cDNA。
具体实施方式
实施例1、GsAS1的克隆
1.1 麻花艽总RNA的提取
(1)麻花艽材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。
(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1ml TRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀。
(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min。
(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min。
(5)2-8℃ 12000r/min离心10min，弃上清。
(6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清。
(7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。
1.2 逆转录合成第一链cDNA
(1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分：
用DNaseI纯化的上述总RNA(0.1μg/μl)     2.0μl
Olige(dT)anchored primer(2μM)         2.0μl
(2)0℃水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。
(3)在10μl反应体系中加入下列成分：2.0μl5×MMLV RT buffer；1.0μl 250μmol/L dNTP mix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆转录酶；2μl上述RNA变性液。42℃进行逆转录反应1hr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。
1.3 PCR
以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。
(1)PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成
引物PO：5′-ATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3′
引物P1：5′-CGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3′
(2)PCR反应体系
10×PCR buffer                       2μl
MgCl₂(25mmol/L)                      1.5μl
dNTP(each 250μmol/L)                 0.2μl
PO(10μmol/L)                         1μl
P1(4μmol/L)                          1μl
逆转录第一链产物                     4μl
Ex Taq                               0.2μl
无菌水                               10.1μl
(3)PCR反应程序
94℃ 5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳如图1所示。
1.4 5′-RACE
按照TaKaRa 5′-FullRACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5′-RACE产物。
1.5 目的片段的回收
(1)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5mlEppendorf管中。
(2)称重，加入3-4倍体积的DR-I Buffer，65℃加热10min融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化。
(3)加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-II Buffer，均匀混合。
(4)将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。
(5)将500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。
(6)将700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。
(7)重复步骤6，然后12000rpm再离心1min。
(8)将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60℃的25μl的水或洗脱缓冲液，室温静置1min。
(9)12000rpm离心1min洗脱DNA。
(10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1hr。
(11)然后4℃，12000rpm离心15min，用70％冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40μl无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。
1.6 连接
用上述的回收目的片段与pMD-18T载体(购自宝生物工程有限公司，下同)按摩尔比约1:1的比例进行连接，连接体系如下：
目的片段                         7μl
T-vector                         1μl
10×T4DNA Ligase Buffer          1μl
T4DNA Ligase                     1μl
混匀并短暂离心，16℃连接过夜。得到重组质粒pMD18T-AS1，用于后面的反应。1.7CaCl₂法制备感受态细胞
(1)挑取DH10B单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
(2)按1：100-1：50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.3-0.6。
(3)将菌液冰浴10min，4℃ 4000rpm离心10min，收集菌体。
(4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl₂悬浮后，冰浴30min。
(5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl₂，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。
1.8 热击法转化Ecoli DH10B
(1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。
(2)在42℃恒温水浴中热激90sec(准确记时)。
(3)冰浴3-5min。
(4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min。
(5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。
(6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。
1.9 碱裂解法提取大肠杆菌质粒
(1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；
(2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；
(3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；
(4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；
(5)加入150μl冰预冷的溶液III，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；
(6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；
(7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；
(8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；
(9)12000rpm，离心3min；
(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；
(11)弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；
(12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。
(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；
(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；
(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；
(16)弃上清用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。
1.10 质粒酶切验证
用EcoRI酶切上述质粒，酶切反应体系如下表所示：
重组质粒pMD18T-AS1                 16μl
EcoRI限制性内切酶                  2μl
10×Buffer                         2μl
将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
1.11 DNA测序
挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与人参的PNY1同源，证明实验得到的就是麻花艽的β-amyrin合成酶基因，命名为麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1。
实施例2、麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1的功能验证
2.1 酵母表达载体的构建
2.1.1 目的基因的获得
(1)引物设计：设计一对PCR扩增带EcoRI和XhoI酶切位点都GsAS1基因。
P01：5’-GAATTCATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3’
EcoRI
P12：5’-CTCGAGCGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3’
XhoI
(2)PCR反应体系：
10×PCR buffer                     2μl
MgCl₂(25mmol/L)                    1.5μl
dNTP(each 250μmol/L)               0.2μl
P01(4μmol/L)                       1μl
P02(4μmol/L)                       1μl
重组质粒pMD18T-AS1                 1μl
rTaq(TaKaRa)                       0.2μl
无菌水                             13.1μl
(3)PCR反应条件为
94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。
2.1.2 表达载体的构建步骤
引入酵母表达载体pPICZA(购自宝生物工程有限公司)，该载体上含有中所含有EcoR和XhoI两个酶切位点。
将带有EcoR和XhoI酶切位点的cDNA与质粒分别进行EcoR和XhoI的双酶切，再按照5:1的比例在T4连接酶的催化下进行连接16小时以上。反应体系及条件如下：
(1)cDNA酶切反应体系和条件：
cDNA/EcoR+XhoI                      6μl
EcoR                                1μl
XhoI                                1μl
10×H Buffer                        2μl
37℃ 16h；
(2)质粒酶切反应体系和条件：
pPICZA质粒                   6μl
EcoR                         1μl
XhoI                         1μl
10×H Buffer                 2μl
37℃ 16h；
连接反应用T4DNALigase进行，体系和条件同T载体的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，得到酵母表达载体pPICZA-GS1。提取阳性克隆pPICZA-GS1的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。
2.2 DNA导入酵母
(1)挑取酵母菌株(毕赤酵母)的单克隆，接种至10ml液体YPD培养基，30℃，200rpm，培养2-3天；
(2)按照1：50的比例将菌液转移至50ml YPD液体培养基中30℃，200rpm，培养3～5h，此时的菌液OD 0.4～0.6。
(3)将菌液分装至10ml无菌离心管中，每管5ml；
(4)3000rpm离心5min，收集细胞。用2.5ml无菌ddH20重悬菌体；
(5)3000rpm离心5min，收集细胞。用0.1ml 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体；
(6)3000rpm离心1～2min沉淀细胞(仅需将菌体离心至离心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；
(7)用50μl 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体，将菌悬液移至灭菌的1.5mlEppendorf管中；
(8)将1ml单链担体DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；(注：无需每次使用时都煮沸担体DNA，可分装成小份冻存；冻融3～4次后应再煮沸，取出后应保持在冰上)
(9)将步骤7准备的样品，3000rpm离心1～2min沉淀细胞，用微量取样器小心吸走上清；
(10)按下列顺序加入：240μl PEG(50％w/v)(加入后用枪头上下吹打，尽量将菌体悬浮)；36μl 1M(10×)LiAc；25μl单链担体DNA(2.0mg/ml)50μl水和质粒DNA(0.1～10μg)(一般情况下，质粒加入10～40μl即可)；
(11)涡旋振荡Eppendorf管1min，直到细胞完全混匀，30℃水浴30min；
(12)42℃水浴中热激20～25min；
(13)5000rpm离心1～2min，用微量移液器除去转化混合液；
(14)吸取0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器轻轻抽提以悬浮沉淀；
(15)取50μl转化液，均匀涂布在含卡那霉素抗性的培养基上，30℃培养2～4d。用未转化的酵母做对照。
2.3 酵母重组子的鉴定
2.3.1 菌落PCR鉴定初筛
(1)平板上的菌落长到肉眼可见时。
(2)将除了模板以外的其他PCR反应液组分准备好，并分装。
(3)用一根灭菌牙签挑取菌落，在PCR管中测一下，放入一个灭菌的1.5ml离心管，对PCR管和1.5ml离心管编号。
(4)PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增显现特异性条带的克隆，置于1.5ml离心管中的半截牙签扔到5mlYPD培养基中，30℃培养，24±1小时提取DNA，用DNA作为模板再进行PCR进一步确定。
PCR反应体系及条件如下：
10×PCR buffer                    2μl
MgCl₂(25mmol/L)                   1.5μl
dNTP(each 250μmol/L)              0.2μl
P0(4μmol/L)                       1μl
P1(4μmol/L)                       1μl
菌液                              1μl
rTaq(TaKaRa)                      0.2μl
无菌水                            13.1μl
PCR反应条件为：
94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。
2.3.2 酵母总DNA为模板进行二次鉴定
酵母基因组的提取
(1)接种重组和空质粒转化子于5ml MD培养基，菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16-18小时。
(2)室温下，1500g离心5-10min收集菌体。
(3)100uL TE(pH7.0)重悬后1500g离心5-10min收集菌体。
(4)用2ml的SCED(PH7.5)重悬。
(5)加入1～3mg蜗牛酶，37℃，50min。
(6)加入2ml 1％ SDS，轻摇混匀，然后置于冰上5min。
(7)加入1.5ml 5M醋酸钾，轻轻混匀。
(8)10000g离心5-10min，弃上清。
(9)加入2倍体积无水乙醇，室温放置15min。
(10)10000g离心20min，弃上清。
(11)加入0.7mlTE缓冲液。
(12)加入等体积的苯酚:氯仿(1:1V/V).
(13)加入1/2体积的7.5M醋酸铵溶液。
(14)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1hr。
(15)10000g离心20min。
(16)加入1ml 75％乙醇漂洗沉淀一次。
(17)干燥后，加入50ul的TE或H₂O溶解，-20℃备用。
PCR反应体系的组成和反应条件同菌落PCR，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例3、植物表达载体的构建
3.1 目的基因的获得
引物设计及PCR反应的体系和条件：
(1)设计如下一对PCR扩增引物，引入植物表达载体pROK2(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点SacI和XbalI。
P11：5’-CGAGCTATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3’
SacI
P12：5’-GCTCTAGACGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3’
XbalI
(2)PCR反应体系：
10×PCR buffer                   2μl
MgCl₂(25mmol/L)                  1.5μl
dNTP(each 250μmol/L)             0.2μl
P11(4μmol/L)                     1μl
P12(4μmol/L)                     1μl
重组质粒pMD18T-AS1               1μl
rTaq(TaKaRa)                     0.2μl
无菌水                           13.1μl
(3)PCR反应条件为
94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。
3.2 表达载体的构建
将带有SacI，XbalI酶切位点的cDNA与质粒分别进行SacI和XbalI的双酶切，再按照5:1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下：
(1)酶切反应体系和条件：
cDNA/SacI+XbalI                6μl
SacI                           1μl
10X Buffer                     2μl
ddH₂O                          1μl
上表体系30℃1h，下表体系37℃1h
原反应液                       10μl
XbalI                          1μl
0.1％BSA                       2μl
0.1％TritonX-100               2μl
10X Buffer                     2μl
ddH₂O                          3μl
(2)质粒酶切反应体系和条件：
pROK2质粒                      6μl
SacI                           1μl
10 X k Buffer                  2μl
ddH₂O                          1μl
上表体系30℃1h，下表体系37℃1h
原反应液                       10μl
XbalI                                 1μl
0.1％BSA                              2μl
0.1％TritonX-100                      2μl
10 X H Buffer                         2μl
ddH₂O                                 3μl
连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同pMD18-T的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，提取阳性克隆pROK-AS1的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。
3.3 测序
将含有重组质粒的阳性菌株送上海博亚生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1的cDNA序列。至此得到了重组表达载体，即含基因GsAS1的植物表达载体pROK-AS1。
实施例4、基因枪转化麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1
4.1 基因枪转化方法
转化使用继代两周的麻花艽胚性愈伤组织。在微弹轰击之前转至含有渗透剂的MS继代培养基上于黑暗、26℃保温4h进行高渗处理。渗透剂为甘露醇，浓度采用0.4mol/L。将2mg金粒(直径1μm)、质粒DNA各2.5μl(1μg/μl)、25μl亚精胺(0.1mol/L)和50μl CaCl2(215mol/L)混合，涡旋或超声波处理多次使之均匀，10000r/min离心5s后去上清，沉淀用250μl乙醇洗涤并重新悬浮于240μl乙醇溶液。将包被有DNA的金粒悬浮液涂于微弹承载片，每片涂3.5μl，放置几分钟干燥后用于基因枪轰击；每次涂液前将悬浮液旋涡处理使之均匀。每次轰击的微弹量约2912μg。基因枪型号为PDS1000PHe(BioRad)，气压采用1100psi。
4.2 培养选择和再生体系
轰击后16h将胚性愈伤组织块从高渗培养基移至含600mg/mlKan的IB继代培养基上进行筛选，将褐色和黑色愈伤去掉，最终获得绿色再生植株。
4.3 CTAB法提取转基因植株基因组DNA
(1)称取0.5G的剪股颖叶子，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。
(2)混合物冷却至室温后加入等体积的酚:氛仿:异戊醇(25:24:1)，4℃下10000g离心10min。
(3)将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃下10000g离心10min。
(4)将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。
(5)4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100闪含无DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37℃水浴30min
(6)加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA.4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。
4.4 PCR检测转基因植株
以CTAB法提取的DNA为模板，PCR法扩增以35S启动子片段。
35S片段启动子引物序列：
35SS：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’
35SA：5’-GACGATCTACCCGAGCAA-3’
(1)PCR反应体系
10×PCR buffer                       2μl
MgCl₂(25mmol/L)                      1.5μl
dNTP(each 250μmol/L)                 0.2μl
35SS(4μmol/L)                        1μl
35SA(4μmol/L)                        1μl
DNA模板                              1μl
rTaq(TaKaRa)                         0.2μl
无菌水                               13.1μl
(2)PCR反应程序
94℃ 5min；94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。
反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例5、转化后阳性再生植株齐墩果酸测定
转化后筛选得到的阳性植株经液氮研磨后加入10ml氯仿，超声40min后离心去上清。最后将上清液进行HPLC测定齐墩果酸含量。
结果证实：本发明的转基因植株比非转基因植株的齐墩果酸含量提高1倍以上。注：上述实验中用到的试剂等购自TAKARA、Promega、Sigma、Invitrogen等公司。
实验中用到的LB培养基配方(均为重量比)：0.5％酵母粉、1％NaCl、1％蛋白胨。
其它试剂配方：见《分子克隆》第三版。
序列表
<110>山东大学
<120>麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及其应用
<141>2009-1-18
<160>3
<210>1
<211>2278
<212>cDNA
<213>麻花艽
<221>麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1
<222>(1)…(2278)
<400>1


<210>2
<211>3389
<212>DNA
<213>人工序列
<221>酵母表达载体pPICZA-GS1
<222>(1)…(3389)
<400>2



<210>3
<211>15151
<212>DNA
<213>人工序列
<221>植物表达载体pROK-AS1
<222>(1)…(15151)
<400>3