一种鉴别诊断牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫方法.pdf

本发明涉及一种检测牛是否患有牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的方法，以及用于这种方法的检测试剂盒。本发明的方法是从待检牛身上采集血液，从所采集的血液中DNA，根据牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫核糖体转录间隔区核苷酸序列设计合成特异性引物，以所采集血液中提取的DNA为模板，以设计合成的特异性引物进行PCR扩增，取PCR产物与上样缓冲液混合，再加入到含有核酸电泳显色剂的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，根据扩增目的条带大小的不同来鉴别两种虫体的感染情况。

1、  一种鉴别诊断牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫方法，其特征是从待检牛身上采集血液，从所采集的血液中DNA，根据牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫核糖体转录间隔区核苷酸序列设计合成特异性引物，以所采集血液中提取的DNA为模板，以设计合成的特异性引物进行PCR扩增，取PCR产物与上样缓冲液混合，再加入到含有核酸电泳显色剂的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，凝胶成像系统下观察结果，根据扩增目的条带大小的不同来鉴别两种虫体的感染情况。

2、  根据权利要求1所述的鉴别诊断牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫方法，其特征是所用的牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫核糖体转录间隔区核苷酸引物为：
a.双芽巴贝斯虫虫上游引物：
B.Bs 5’—gcgttgtcgtcgctcttg-3’
b.双芽巴贝斯虫虫下游引物：
B.Br 5’—cttaaattcggcggatgg-3’
c.牛巴贝斯虫上游引物：
B.oS 5’—cttgcggcgatttggc-3’
d.牛巴贝斯虫下游引物：
B.oR 5’—cgtgaaggagcggtgtagag-3’。

3、  一种用于权利要求1或2所述方法的检测试剂盒，其特征是盒内有：
a.牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫特异性的引物；
b.PCR反应液；
c.Taq DNA聚合酶；
d.dNTPs；
e.MgCl₂；
f.反应缓冲液；
g.阴阳性对照。

4、  根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征是所为的牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫特异性的引物分别为：
a 双芽巴贝斯虫虫上游引物：
B.Bs 5’—gcgttgtcgtcgctcttg-3’
b.双芽巴贝斯虫虫下游引物：
B.Br 5’—cttaaattcggcggatgg-3’
c.牛巴贝斯虫上游引物：
B.oS 5’—cttgcggcgatttggc-3’
d.牛巴贝斯虫下游引物：
B.oR 5’—cgtgaaggagcggtgtagag-3’。

一种鉴别诊断牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫方法
技术领域
本发明涉及一种检测牛是否患有牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的方法，以及用于这种方法的检测试剂盒。
背景技术
巴贝斯虫病是牛的一种蜱传性疾病，由牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、分歧巴贝斯虫(B.divergens)和其它巴贝斯虫等寄生原虫引起。牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的主要传播媒介牛蜱广泛存在于热带和亚热带国家，鉴于本类疾病的严重危害，国际兽医局(OIE)国际委员会于1985年通过议案，建议各成员国加强蜱传性血液原虫病的协作研究，建立国际性防制措施，以减少经济损失。我国是世界上巴贝斯虫病流行最严重的国家之一，在该病的防治方面仍有大量工作要做。
牛巴贝斯虫病检测技术现采用的方法是血涂片显微镜检测法、间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法。
血涂片检查方法仍是巴贝斯虫急性感染最可靠的诊断方法，各个从事巴贝斯虫病研究的实验室依然将该方法作为测定巴贝斯虫感染情况的标准方法。血涂片一般采用末梢血制成，研究表明较大动静脉中的染虫率一般低于末梢血。将动物耳尖血液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色，可在100倍油镜下检测。发现特征性虫体，再结合临床症状和流行病学资料，可得出十分可靠的诊断结论。但对于带虫期和感染初期血涂片中很难看到虫体的情况，此方法就显得苍白无力了。另外。此方法要求检查人员要熟悉各种巴贝斯虫形态，同时还要熟悉其它血液原虫如泰勒虫、无浆体的形态。与其他诊断方法相比，血涂片检查的检出率相对较低。血涂片检测方法可参见：Akinboade OA，Dipeolu OO.Comparison of blood smear and indirect fluorescent antibody techniques in detectionof haemoparasite infections in trade cattle in Nigeria[J].Vet Parasitol.1984，14(2)：95-104；Darghouth ME，Bouattour A，Ben Miled L，Sassi L.Diagnosis ofTheileria annulata infection of cattle in Tunisia：comparison of serology and bloodsmears[J].Vet Res.1996；27(6)：613-21。
间接免疫荧光(IFA)试验已经广泛用于检测牛巴贝斯虫抗体，但在牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫混合感染的情况下，在双芽巴贝斯虫IFA试验中出现牛巴贝斯虫抗体是突出问题，IFA试验的缺点是检测样品少，带主观性。间接荧光检测方法可参见：Bruning A.Equine piroplasmosis an update on diagnosis[J].Br Vet J，1996，152:139～151，或者Papadopoulos B，Brossard M，Perie NM(1996)Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region of Greece.3.Piroplasms ofsmall ruminants.Vet Parasitol 63：67-74。
酶联免疫吸附试验(ELISA)逐渐成为国际公认的检测牛巴贝斯虫的方法，但是用于检测双芽巴贝斯虫的ELISA方法还没有建立，主要因各种检测双芽巴贝斯虫抗体的ELISA存在特异性差，同时ELISA作为一种血清学检测方法，有时只能说明被检动物是否感染过病原，而对初患病的动物可能无法检出。酶联免疫检测可参见：Barry D.N.，Rodwell B.J.，Timms P.，et al.A microplate enzymeimmunoassay for detecting and measuring antibogies to Babesia bovis in cattle serum.Australian Veterinary Journal，1982，59:136；Molloy J.B.，Bowles P.M.，Bock R.E.，et al.Evaluation of an ELISA for detection of antibodies to Babesia bovis in cattle inAustralia and Zimbabwe.Prev Vet Med，1998，33：59-67。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的能有效检测出牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的方法，同时提供用于本发明检测方法的检测试剂盒。
本发明的方法是从待检牛身上采集血液，从所采集的血液中DNA，根据牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫核糖体转录间隔区核苷酸序列设计合成特异性引物，以所采集血液中提取的DNA为模板，以设计合成的特异性引物进行PCR扩增，取PCR产物与上样缓冲液混合，再加入到含有核酸电泳显色剂的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，根据扩增目的条带大小的不同来鉴别两种虫体的感染情况。
本发明中所用的牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫核糖体转录间隔区核苷酸引物为：
a.双芽巴贝斯虫虫上游引物：
B.Bs 5’—gcgttgtcgtcgctcttg-3’
b.双芽巴贝斯虫虫下游引物：
B.Br 5’—cttaaattcggcggatgg-3’
c.牛巴贝斯虫上游引物：
B.oS 5’—cttgcggcgatttggc-3’
d.牛巴贝斯虫下游引物：
B.oR 5’—cgtgaaggagcggtgtagag-3’。
本发明具有操作简单，成本较低，观察结果所需时间短的优点，并能够在一个PCR反应中同时检测多种寄生虫的感染情况。
附图说明
附图1为本发明PCR扩增的巴贝斯虫基因片段电泳图，其中，M：DNAMarker DL2000；1为双芽巴贝斯虫DNA；2为牛巴贝斯虫DNA；3为双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合样品。附图2为双芽巴贝斯虫引物BbS/BbR敏感性电泳检测图，其中，泳道1-9分别为10^-3-10^-1110倍稀释血样DNA。附图3为牛巴贝斯虫引物BoS/BoR敏感性检测电泳图。图4为牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合引物敏感性检测电泳图。图5为牛双芽巴贝斯虫引物B.Bs/B.Br特异性检测电泳图。图6为牛巴贝斯虫引物BoS/BoR特异性检测电泳图。
具体实施方式
以下提供本发明的具体实施方式，在以下具体实施方式中所用的试剂包括：
1)提取血液中基因组所用试剂：
a.红细胞裂解液    (Gentra公司)
b.细胞裂解液      (Gentra公司)
c.蛋白沉淀剂      (Gentra公司)
d.DNA水合剂       (Gentra公司)
e.异丙醇          (市售)
f.70％乙醇        (市售)
2)PCR反应所用试剂：
a.5×Buffer缓冲液(TakaRa公司)
b.2.5mM dNTP混合液(TakaRa公司)
c.rTaq酶(TakaRa公司)
d.基因组DNA
e.50pM引物
f.灭菌水去离子水
操作步骤：
(1)采集标本血液，提取基因组
从被检牛的静脉采血，再从所采的血液中提取基因组。为得到阳性的标本，本发明采用的方法是：用液氮中保存的含牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的血液分别接种实验动物，当染虫率达到5％以上，静脉采血，将所采血液4℃条件下4000rpm离心10分钟，弃去上清，尽量将红细胞吸去。2％枸橼酸钠洗涤三次4000rpm离心10分钟，最后将上清去掉，红细胞分装入1.5ml离心管中，-20℃保存。
从血液中提取基因组的方法：
a.加900ul BRC Cell Lysis Solution于盛300ul血液1.5的离心管中，颠倒10次，在室温下放置到液体澄清透明。
b.3000g离心3分钟，弃上清，保留下面的可见的白细胞沉淀和大约10～20μl液体，涡旋20秒。
c.每管中加入300ulCell Lysis Solution，吹打混匀
d.加入100ul Protein Preciptation Solution。
e.蜗旋20秒，至出现棕褐色沉淀颗粒。
f.13000g离心3分钟。
g.将上清液移至新标记的离心管中，加入300ul异丙醇，颠倒50次。
h.13000g离心5分钟。
i.弃上清，在干净的纸巾上放置，将剩余的液体吸干。
j.加入300ul70％乙醇。
k.13000g离心3分钟，小心除去乙醇，在吸水纸上吸干剩余液体。
l.在Speedcac真空干燥。
m.加入100μl DNA Hydration Solution。
n.4℃过夜或60℃温育1小时。
p.—20℃保存备用。
(2)根据牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫核糖体转录间隔区核苷酸序列设计合成特异性引物：
a.双芽巴贝斯虫虫上游引物：
B.Bs 5’—gcgttgtcgtcgctcttg-3’
b.双芽巴贝斯虫虫下游引物：
B.Br5’—cttaaattcggcggatgg-3’
c.牛巴贝斯虫上游引物：
B.oS5’—cttgcggcgatttggc-3’
d.牛巴贝斯虫下游引物：
B.oR5’—cgtgaaggagcggtgtagag-3’
(3)基因片段PCR扩增的反应体系及程序如下(所用试剂购自TakaRa公司)：
a.10×PCR buffer(plus Mg²⁺)       5μl
b.2.5mM dNTP Mixture              4μl
c.B.oS                            0.5μl
d.B.oR                            0.5μl
e.B.Bs                            0.5μl
d.B.Br                            0.5μl
e.Genomic DNA                     1μl
f.rTaq酶(5U/ul)                   0.3μl
f.灭菌去离子水补足50ul体系
(4)本发明的多重PCR检测方法反应程序：
a.96℃                 3min

e.72℃           10min
f.4℃               保存
(5)PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察结果：
取PCR产物10μl在1.5％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)中，在75伏的电压下进行电泳分析，观察扩增结果参见图1，针对牛巴贝斯虫，引物对BoS/BoR扩增目的片断大小为408bp；针对双芽巴贝斯虫，引物对BbS/Bbr扩增目的片断大小为646bp。经测序，扩增产物的序列与间隔区序列完全相符。
(6)敏感性检验
过显微镜检测出所采血样的染虫率，用阴性血液稀释至染虫率10^-3-10^-11。同时将感染有B.bigemina、B.bovis的血液混合并倍比稀释至染虫率10^-3-10^-11。提取基因组，并按并按照上述反应条件进行PCR扩增。敏感性检测中，B.Bs/B.Br能够检测出染虫率10^-6血液中的双芽巴贝斯虫，B.oS/B.oR能够检测出染虫率10^-6血液中的牛巴贝斯虫。混合感染情况下B.Bs/B.Br、B.oS/B.oR的敏感性分别为10^-5、10^-4。参见图2、3、4，在敏感性检测中，BbS/BbR能够检测出染虫率10^-6血液中的双芽巴贝斯虫，BoS/BoR能够检测出染虫率10-6血液中的牛巴贝斯虫。混合感染情况下BbS/Bbr、BoS/BoR的敏感性分别为10^-5、10^-4，可见本发明有较高的检测敏感性。
(7)特异性检验
用本发明的双芽巴贝斯虫特异性引物扩增牛巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫和阴性牛血基因组；用牛巴贝斯虫特异性引物扩增双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫和阴性牛血基因组，再将其进行电泳观察，均无扩增产物出现，说明本发明的的引物具有特异性，参见图5、6，可见本发明具有特异性，完全可以避免误误检的现象。
(8)实际样品的检验
在相关的试验中，用本发明的方法检测收集的114份血液样品，阳性样品50.88％(58/114)，同样的样品经显微镜检查，阳性样品为27份(27/114)，检出率仅为23.68％。另外试验还表明，人工感染动物后第3天用本发明的方法就可检测出虫体的存在，而其中有两头动物感染后第二天用本发明的方法检测即呈阳性。而显微镜检测在第5天以后血涂片中才可看到虫体的存在。可见本发明可以早期发现动物患病的情况，这对于疾病的治疗与早期预防均有积极的意义。
用本发明的方法还可建立相关商业化检测试剂盒，这可以更加方便使用。