一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒.pdf

本发明提供一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒，上游引物PSD11和下游引物PSD12，试剂盒包括：PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，Taq聚合酶，阳性对照DNA，DMSO，PSD11/PSD12和超纯水。以此引物为基础的试剂盒，在大豆疫霉根腐病菌纯DNA、带菌的发病组织及土壤中特异性地扩增出片段长度为382bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其检测试剂盒可用于生产实践中被大豆疫霉根腐病菌感染的植物组织和土壤中大豆疫霉根腐病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断，也可为海关进出境大豆所携带大豆疫霉根腐病菌高灵敏度快速分子检测和鉴定。

1.  一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述大豆疫霉根腐病菌分子检测的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：
上游引物PSD11(18bp)：5′～TGAGGTGTCTTGCGGCGT～3′
下游引物PSD12(19bp)：5′～AATTGAGATGCCACCTCCG～3′。

2.  根据权利要求1所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述大豆疫霉根腐病菌分子检测引物PSD11和PSD12在大豆疫霉根腐病菌上特异性地扩增出382bp的产物。

3.  根据权利要求1所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物的序列获得方法为：大豆疫霉根腐病菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl重量浓度2％十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液和90μl重量浓度10％十二烷基苯磺酸钠SDS后振荡混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min颠倒混匀一次，水浴1.5h后离心15min，离心速度为12,000rpm，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，离心5min，离心速度为12,000rpm，取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽提一次，离心5min，离心速度为12,000rpm，吸上清液，加0.1体积的3mol/LNaAC溶液和2体积的—20℃无水乙醇，—20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl体积浓度70％的—20℃乙醇进行洗涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE(溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用，在大豆疫霉根腐病菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，获得大豆疫霉根腐病菌分子检测引物序列，经对供试菌株和大豆疫霉根腐病菌的特异性进行PCR验证，所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物在大豆疫霉根腐病菌上特异性地扩增出382bp的产物。

4.  根据权利要求3所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液为重量浓度2％CTAB；100mmol/L Tris-HCl，PH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/L NaC。

5.  根据权利要求3所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述1×TE溶液为10mmol/L Tris-HCL，0.1mmol/LEDTA，pH8.0，其中TE中含5μg/μL RNase。

6.  根据权利要求3所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述经对供试菌株和大豆疫霉根腐病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，5mM MgCl₂2.5μl，10mM dNTPs 2.0μl，1.0U Taq DNA聚合酶，20pmol/μl引物PSD11/PSD12各0.2μl，重量浓度99.5％DMSO 0.5μl和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl；PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性1min，68℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。

7.  一种采用如权利要求1、2、3、4、5或6所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物的快速分子检测试剂盒，其特征在于：所述快速分子检测试剂盒包括：装有重量浓度≥99％的超纯水d.d.H₂O的超纯水管；装有浓度10×PCR缓冲液的管；装有5mM MgCl₂的管；装有10mM dNTPs的管；装有5U/μl Taq聚合酶的管；装有100ng/μl阳性对照DNA的管；装有重量浓度≥99.5％二甲基亚砜DMSO的管；装有20pmol/μl上游引物PSD11的管；装有20pmol/μl下游引物PSD12的管；采用该试剂盒进行PCR扩增反应为：PCR扩增反应采用25μl体系，其中：
10×PCR buffer                                        2.5μl；
5mM MgCl₂                                             2.5μl；
10mM dNTPs                                            2.0μl；
20pmol/μl PSD11                                        0.2μl；
20pmol/μl PSD12                                        0.2μl；
Taq聚合酶                                             0.2μl；
5ng/μl模板DNA                                         1.0μl；
DMSO                                                  0.5μl；
d.d.H₂O                                               15.90μl；
PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性1min，68℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。

8.  一种采用如权利要求7所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物快速分子检测试剂盒体系的建立，其特征在于：按照以下步骤建立：
(1)从被所述大豆疫霉根腐病菌感染的植物组织中或存在大豆疫霉根腐病菌的土壤样品中分离DNA；
(2)采用所述的分子检测试剂盒进行PCR扩增：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，5mM MgCl₂ 2.5μl，10mM dNTPs 2.0μl，1.0U Taq DNA聚合酶，20pmol/μl引物PSD11/PSD12各0.2μl，重量浓度99.5％ DMSO 0.5μl和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl，PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性1min，68℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min；
(3)将8μl步骤(2)的PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果；如果能特异性地扩增出382bp产物时，即可判断所述的植株组织或土壤样品中存在大豆疫霉根腐病菌；否则所述的植株组织或土壤样品中未存在大豆疫霉根腐病菌。

9.  根据权利要求8所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物快速分子检测试剂盒体系的建立，其特征在于：当在用于植物组织中存在大豆疫霉根腐病菌时，采用CTAB法提取大豆疫霉根腐病菌的DNA。

10.  根据权利要求8所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物快速分子检测试剂盒体系的建立，其特征在于：当在土壤样品中存在大豆疫霉根腐病菌条件下，采用土壤DNA提取法提取土壤中大豆疫霉根腐病菌的DNA，所述土壤DNA提取法为：取过筛的土壤冷冻抽干24-48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500μl重量浓度0.4％脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12000rpm离心15min，取上清加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10μg/ml蛋白酶K，55℃水浴1-3h，水浴结束后，加入1/2体积的7.5M NH₄AC溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min，吸上清加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀，沉淀时间1.5h，沉淀结束后，12000rpm离心15min，用体积浓度70％乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干，每份样品所提DNA用10μl 1×TE或无菌超纯水溶解，-20℃保存备用。

一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒
技术领域
本发明于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，更具体涉及一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒。
背景技术
由大豆疫霉根腐病菌(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的土传病害，在我国被列为I类外检对象，该病于1991年首次在我国黑龙江省发现，此后呈逐年扩大的趋势，福建省1997年在漳州地区发现大豆疫病，2002年在漳州地区分离到了大豆疫病菌，目前该病害已对我国大豆生产构成了威胁。大豆疫霉根腐病是一种土传病害，病原菌可以经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，而且其侵染能力强，由其引起的病害多属于多循环病害，在较短的时间内可造成植株死亡。因此，开展大豆疫霉根腐病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对大豆疫霉根腐病的传播与控制具有重要意义。
自从发现大豆疫霉根腐病菌以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究，传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，从而确定是否存在大豆疫霉根腐病菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由大豆疫霉根腐病菌引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期及海关进出境快速检测和鉴定的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。
现在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立，但是特异性较差，常常受到相似种的干扰，也受到抗血清质量的影响，血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量。单克隆抗体的专化性太强，主要用于流行学中检测菌系，通常将多种单克隆抗体混合使用，以消除过度专化的问题。目前认为在检测应用方面，多克隆抗体要优于单抗，而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生交叉反应。因此，常规血清学方法的应用受到了一定的限制。随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对大豆疫霉根腐病菌的分子检测开展研究，但是由于ITS在病原菌的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物将两个相似性高的种区分开具有较大难度。目前国内外学者利用基于ITS碱基序列设计引物对大豆疫霉根腐病菌的分子检测特异性较差，经常出现假阳性的现象，主要是由于设计引物时没有充分考虑引物序列在近缘种之间的差异。因此要对大豆疫霉根腐病菌进行高特异性检测，从疫霉菌ITS碱基序列设计高特异引物是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是是提供一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒，针对现有技术中大豆疫霉根腐病菌的生物学检测方法所需周期长、目前大豆疫霉根腐病菌分子检测方法特异性差，灵敏度低的问题，通过测定大豆疫霉根腐病菌及其它疫霉菌的ITS碱基序列，并进行多重比对分析，针对大豆疫霉根腐病菌的ITS碱基特异序列设计出了一对高特异引物，用于带大豆疫霉根腐病菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，并提供一种结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的大豆疫霉根腐病菌的快速分子检测试剂盒，该试剂盒可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于大豆疫霉根腐病菌引起病害显症之前的早期监测及海关进出境大豆所携带大豆疫霉根腐病菌高灵敏度快速分子检测和鉴定具有十分重要的意义。
本发明的豆疫霉根腐病菌分子检测的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：
上游引物PSD11(18bp)：5′～TGAGGTGTCTTGCGGCGT～3′
下游引物PSD12(19bp)：5′～AATTGAGATGCCACCTCCG～3′。
该大豆疫霉根腐病菌分子检测引物的快速分子检测试剂盒包括：