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一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物
技术领域
本发明涉及基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微卫星引物，可应用于三疣梭子蟹的种质鉴定与评价和遗传结构分析的微卫星引物。
背景技术
三疣梭子蟹(P.trituberculatus)，俗称海蟹或大蟹，属于甲壳纲，十足目，梭子蟹科。它广泛分布在中国南北沿海，是中国大型海洋经济蟹类，是沿海重要的渔业资源，开展三疣梭子蟹群体遗传结构分析和种质鉴定工作，对于三疣梭子蟹的增养殖亲本选择和原种、家系和优良品种资源保护具有重要的应用价值。
目前常用来进行评价生物遗传多样性和种质鉴定的分子标记均具有一定程度的缺陷，如RAPD技术(随机扩增序列多态性DNA，Random amplifiedpolymorphic DNA)，常因RAPD引物过短10个碱基、退火温度过低一般36-37℃，导致扩增产物的一些非特异结果，其可靠程度和真实性是主要的缺陷；而AFLP技术(扩增片段长度多态性，Amplifiedfragment lengthpolymorphism)，又因操作条件复杂如要求酶切、成本相对较高而限制了其广泛的应用。微卫星标记是一种新兴的分子标记技术，实质就是基因组中大量存在的串联重复序列，以这些重复序列作为遗传标记可以进行种质鉴定与标记、遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建等一系列工作，其工作原理是通过已知的基因序列寻找微卫星序列然后在微卫星序列上下游设计特异性引物，这样设计的引物就成为微卫星引物，通过使用设计好的成对引物就可以通过PCR技术扩增出微卫星标记带，通过电泳凝胶成像技术成像后进行种质鉴定与标记、遗传多样性分析或遗传连锁图谱的构建。应用微卫星引物扩增出的微卫星序列电泳分离时具有单碱基的高分辨率，遗传信息量大，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有很高的稳定性和多态性，且DNA用量较AFLP少，技术要求低，微卫星标记技术则正好克服了RAPD和AFLP技术的这些缺点，具有很好的应用价值。
线粒体DNA为细胞核外遗传物质，且以母性遗传为主，具有结构简单、碱基突变率高、核苷酸歧义度大和进化速度快等特点，特别适宜种质鉴定和遗传结构分析。D-LOOP俗称D环，又称线粒体控制区，具有较高的变异水平，特别适合于种以下水平的遗传分析和亲缘关系鉴定，目前，D-LOOP作为分子标记在种质资源评价和群体结构分析中被认为是最广泛的基因之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，开发一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物，该引物可克服现有技术引物过短，退火温度低，操作条件复杂，成本高、准确性低的缺陷。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物，其特点是，所述的微卫星引物为：
D-LOOP78DY1： F：AAGGCCTACATACAAAGAGC
              R：ACTAAGTGAAGAATGAGATA
D-LOOP91DY4： F：TATATCTAATTCTTCACTT
              R：AACTATCTAATTACTGTCTT
D-LOOP125DY4：F：CAAAACTAATTCCTATAAACTAAA
              R：AACCAAAGCATTCCCTGAG
D-LOOP52L2：  F：TTTGAGAATAAGATGATAGG
              R：AACGGGAGAATAAGATGAAA
D-LOOP229L13：F：TGGAGTTCCTATTTCATCTTATT
              R：TCACTTTCTTCCTTTGCTCAT
D-LOOP150DY2：F：TTTCTTCCTTTACTCATTA
              R：CTATTTCATCTTATTCTGTCGTT
D-LOOP135DY2：F：TACTAGTATATCGTTTA
              R：ATTTTGTATATTTAGGTG
D-LOOP225DY2：F：TCGTTTTATTGATTATT
              R：AAAAAGTTGAAAGAGTA
上述微卫星引物可通过以下方法得到，
(1)采集三疣梭子蟹活体运回实验室提取总DNA，通过PCR扩增三疣梭子蟹的D-LOOP基因，将PCR产物进行双向测序；
(2)将测定序列通过正反向拼接后建立完整的D-LOOP基因序列，通过TRF程序来查找微卫星位点；
(3)对找到的可用位点设计微卫星引物，最终得到如表1所述微卫星引物(序列表中SEQUENCE NO：1-16)及对应的引物指标参数：
表1 基于三疣梭子蟹D-LOOP基因微卫星引物及对应的引物指标参数

以下对发明人所作的研究试验进行阐述。
实验用三疣梭子蟹采集于辽宁大连、山东东营、江苏连云港、浙江舟山、福建漳州、广东湛江6个种群地区海域，采集时间、地点、简称及采集数量见表2，采集到的三疣梭子蟹活体运回实验室，-70℃低温冰箱或75％酒精保存。
表2 三疣梭子蟹样本信息

1、DNA提取。
取组织约50mg，先用蒸馏水将组织中的乙醇清洗干净，然后按照常规的酚一氯仿法提取DNA。
2、PCR扩增。
根据GeneBank中三疣梭子蟹线粒体基因组序列(GenBank accessionNo.AB093006.1)，用DNAStar软件包中PrimerSelect程序设计特异引物，引物的序列为D-loop F：5′-CGAGCTACTACACGCAACAAC-3′和D-loop R：5′-GACGGTGTAAATCCGTTACGA-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应总体积为50μl，包括5μl 10×PCR Buffer，4μl 25mmol/LMgCl₂，1μl 10mmol/L dNTP，4μl 2.5mmol/L双向引物，0.4μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，3μl DNA模板，加无菌双蒸水至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min后进行降落PCR，94℃变性45s，53℃退火45s(每5个循环降低2℃)，72℃延伸1.5min，15个循环，接下来进行94℃变性45s，47℃退火45s，72℃延伸1.5min，15个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，染色后在凝胶成像系统检测。
3、测序。
PCR产物用上海生工生物工程技术服务有限公司生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，后送上海华大天源生物科技有限公司采用扩增产物在ABI prism TM377测序仪上直接进行正反双向测序，6个群体(每个群体至少测10个)测定出多个三疣梭子蟹D-LOOP完整基因序列。然后用DNASTAR软件中的Seqman程序作比较分析，用存在微卫星变异的个体D-LOOP完整基因序列来设计引物，最终选定的5个用于制作引物的个体分别为DY1、DY2、DY4、L2、L13，其对应的D-LOOP完整基因序列依次见序列表第17-21号序列(SEQUENCE NO：17-21)。
4、微卫星位点的确定。
将测序的结果使用DNAStar软件包的Seqman程序进行双向拼结，并将所有序列使用DNASTAR软件中的Seqman程序转化为基因序列的FASTA格式，以便Tandem Repeats Finder软件识别(简称为TRF程序)。将序列转化成FASTA模式后用TRF程序依次打开，设定TRF程序的math(匹配)，mismath(错配)和indel(插入缺失)参数为分别为2，7，7，最小重复序列(minimum alignmentscore to report reapeat)为20，最大区间(maximum period size)为2000，然后运行Run，结果即保存到FASTA文件格式的目录下，即序列数据所在的文件夹中，每Run一个FASTA格式的序列文件变会产生两个HTML格式的结果文件。HTML格式的结果文件中分别显示微卫星所在的序列位置、大小、拷贝数、重复碱基等情况。将所有的FASTA格式序列文件通过运行TRF程序查找到的微卫星结果，见表3。
表3 三疣梭子蟹D-LOOP基因中的可用的微卫星位点分布
 

个体ATAAAATATATTAATATATTATATTATAATATTATAATGCL22/436-447L132/315-3302.5/491-500DY12.7/183-2012.5/607-6168/844-8592.5/873-882DY22.7/183-2015/599-6169/844-8612.5/877-886DY42.7/183-2013.6/254-2705/844-8532.5/867-876
注：个体一纵栏指三疣梭子蟹的个体编号，表格的横行为出现的微卫星重复序列名称，如“ATAAAAT”指重复序列为ATAAAAT的微卫星，而应的表中的数字如“2.7/183-201”是指DY1这个个体在183-201区间内“ATAAAAT”重复次数为2.7次。
上述DNAStar V3.0软件的出处为Steve ShearDown，1989-2001 versionreserved by DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA；上述Tandem Repeats Finde(TRF)软件的出处为G.Benson，＂Tandem repeats finder：a program to analyzeDNA sequences＂Nucleic Acids Research(1999)Vol.27，No.2，pp.573-580.网址为http://tandem.bu.edu/trf/trf.html。
5、微卫星引物的开发。
考虑到开发微卫星分子标记能够应用这就要求具有良好的产物长度多态性，而不存长度多态性的微卫星位点去掉，因此结合DNASTAR中的Seqman对所有序列进行对比，选择含有插入或缺失的微卫星位点来开发引物，开发的微卫星标记引物组是理想的，因此符合条件的微卫星位点见表3。
用表3中所有具有多态性的微卫星来开发引物，以“ATAAAAT”为例，其余过程相同。开发过程如下：对表3中重复类型为“ATAAAAT”的微卫星，将其任一个体的序列导入到引物设计软件(选择设计引物的个体D-LOOP基因序列依据为不同个体的微卫星两侧翼区序列均保守相同，因此任一个体均可以用来设计引物，出于方便，一般选择该微卫星位点没有丢失的序列来设计，如“ATAAAAT”这个微卫星则最好选择DY1(SEQUENCE NO：17)等含有“ATAAAAT”2.7个拷贝的三疣梭子蟹个体D-LOOP基因序列。以下以DY1(SEQUENCE NO：17)为例说明“ATAAAAT”微卫星引物开发过程。
打开软件用DNAStar软件包中PrimerSelect程序，导入DY1(SEQUENCENO：17)序列，点击菜单栏中的“Conditions”→“Sequence position and limitits”即可设定引物所要扩增的微卫星位置组，选择的依据是上下游引物通火温度相近即可，引物间包含有所在的微卫星位点如“ATAAAAT”微卫星，同时两引物间最好不含有别的微卫星，因此对“ATAAAAT”微卫星可供设计引物的区域为DY1(SEQUENCE NO：17)序列的0-250间，符合该要求的引物为F：AAGGCCTACATACAAAGAGC，Tm为45.7，起始位置为151；R：ACTAAGTGAAGAATGAGATA，Tm为35.8，起始位置为228，扩增的目的片段为78bp，同样的将表3中其余的7个可用的微卫星的引物设计出来。结果汇总如表1所示。表1设计出的引的给出的退火温度为理论值，实际应用时可以适当提高或降低退火温度5℃左右。如作为实际使用时Tm值在30℃左右的可以提高到36-40℃。
本发明将微卫星和D-LOOP的优点结合起来开发基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微卫星标记引物，且开发出该基因的微卫星标记引物具有重要的应用价值。筛选出的引物扩增产物清晰、稳定、多态性好，可应用于三疣梭子蟹的种质评价和种质鉴定以及三疣梭子蟹的群体遗体多样性评价，该方法具有快速、经济、准确和操作简便等特点。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物，所述的微卫星引物为：
D-LOOP78DY1：  F：AAGGCCTACATACAAAGAGC
               R：ACTAAGTGAAGAATGAGATA
D-LOOP91DY4：  F：TATATCTAATTCTTCACTT
               R：AACTATCTAATTACTGTCTT
D-LOOP125DY4： F：CAAAACTAATTCCTATAAACTAAA
               R：AACCAAAGCATTCCCTGAG
D-LOOP52L2：   F：TTTGAGAATAAGATGATAGG
               R：AACGGGAGAATAAGATGAAA
D-LOOP229L13： F：TGGAGTTCCTATTTCATCTTATT
               R：TCACTTTCTTCCTTTGCTCAT
D-LOOP150DY2： F：TTTCTTCCTTTACTCATTA
               R：CTATTTCATCTTATTCTGTCGTT
D-LOOP135DY2： F：TACTAGTATATCGTTTA
               R：ATTTTGTATATTTAGGTG
D-LOOP225DY2： F：TCGTTTTATTGATTATT
               R：AAAAAGTTGAAAGAGTA
所述的微卫星引物对应的引物指标参数见表1所示。
所述的一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因的微卫星引物通过以下方法得到，先采集三疣梭子蟹提取基因组DNA，通过PCR扩增三疣梭子蟹的D-LOOP基因，将该基因电泳回D-LOOP目的片段，将该片段与载体进行连接反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行克隆后双向测序；将测定序列通过正反向拼接后建立完整的D-LOOP基因序列，通过TRF程序来查找三疣梭子蟹的D-LOOP基因微卫星位点并开发得到微卫星引物。
实施例2。基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微卫星引物，用其进行群体遗传结构分析，其步骤址如下，
1.引物的合成
应用DNA合成仪合成表1中的引物8对，各2OD，一般由有DNA合成能力的生物工程公司来完成。
2.三疣梭子蟹基因组的提取
采集三疣梭子蟹几个家系样本各30个，新鲜样品带回实验室，采用标准酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体过程及试剂配方，三疣梭子蟹的基因组DNA采用SDS裂解液配方：10mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5％SDS，提取的步骤为取三疣梭子蟹的肌肉组织50mg，放入液氮中研磨成细粉，放入2.0ml的离心管中，加入600μl的SDS组织裂解液，放入55℃水浴摇床，裂解1h后加入蛋白酶K10μl(20mg/ml)，继续裂解3～4h，然后将离心管取出用手指轻弹离心管底部，让未裂解组织与裂解液充分接触，使组织细胞能够充分裂解，裂解完毕后每只离心管加入600μl Tris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，加入600μl氯仿异戊醇混合液，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min，12000rpm，离心10min，取上清液，加入1200μl冷冻无水乙醇，颠倒45-55次，室温静置10～15min，8000rpm，离心10min，弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500μl 70％的乙醇，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min，弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕，加入50μlTE，溶解DNA，4℃保存，制备0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.PCR反应体系
PCR体系：25μl，Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、10×Buffer的体积为2.75μl、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTP mixture 0.5μl，引物2μl，其余用水补足；反应条件：首先95℃预变性5min，然后进入以下40个循环94℃变性45s，45℃-52℃(不同引物对应不同的退火温度见表三)Touchdown程序退火45s，72℃延伸1.5min，然后72℃再次延伸10min，最后4℃保存。
4.电泳检测与数据统计
(1)8％变性聚丙烯酰胺的制备：15ml8％变性胶，7.5ul TEMED，10ul AP。
(2)上样：变性上样缓冲液配方为98％甲酰胺49ml，10mM EDTA(pH8.0)1ml，0.25％溴芬兰0.125g，0.25％二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR产物和上样缓冲液体1：1加样2-4微升，同时设立合适的DNA分子量标准物(DL-2000)；
(3)电泳：电压以400V左右维持2h置，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶前沿1-2cm处时，关闭电源；
(4)取出凝胶板，用硝酸银染色；
(5)凝胶呈像系统(Chemi Doc XRS)拍照，记录结果；
(6)经电泳获得的图谱每群体在所有位点的谱带式样组成一个01矩阵。用Arequin2.0软件进行分子方差分析(AMOVA)，计算遗传多态度(π)和遗传分化指数(Fst)等各种种质资源评价指标，最终得出评价结果。
实施例3。基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微卫星引物，进行家系鉴定，其步骤如下，
1.提取三疣梭子蟹繁育家系的基因组DNA
(1)SDS裂解液配方：10mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/LEDTA(pH＝8.0)，0.5％ SDS。
(2)步骤：取三疣梭子蟹的步足上的肌肉组织50mg，放入液氮中研磨成细粉，放入2.0ml的离心管中，加入600μl的SDS组织裂解液，放入55℃水浴摇床，裂解1小时后加入蛋白酶K 10μl(20mg/ml)，继续裂解3～4个小时，然后将离心管取出用手指轻弹离心管底部，让未裂解组织与裂解液充分接触，使组织细胞能够充分裂解；
裂解完毕后每只离心管加入600μl Tris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min；
12000rpm，4离心10min；
取上清液，加入600μl氯仿异戊醇混合液，轻轻振荡摇匀，颠倒50次；室温静置10～15min；
12000rpm，离心10min；
取上清液，加入1200μl冷冻无水乙醇，颠倒45-55次；室温静置10～15min；
12000rpm，离心10min；
弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500μl 70％的酒精，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min；
弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕；
加入50μlTE，溶解DNA，4℃保存；
制备0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
2.合成表8对三疣梭子蟹引物
利用实施例1合成表1中的8对引物。
3.PCR反应体系
PCR体系：25μl，Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、10×Buffer的体积为2.75μl、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTP mixture 0.5μl，引物2μl，其余用水补足；反应条件：首先95℃预变性5min，然后进入以下40个循环94℃变性45s，45℃-52℃(不同引物对应不同的退火温度见表三)Touchdown程序退火45s，72℃延伸1.5min，然后72℃再次延伸10min，最后4℃保存。
4.电泳检测与数据统计
(1)8％变性聚丙烯酰胺的制备：15ml8％变性胶，7.5ul TEMED，10ul AP。
(2)上样：变性上样缓冲液配方为98％甲酰胺49ml，10mM EDTA(pH8.0)1ml，0.25％溴芬兰0.125g，0.25％二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR产物和上样缓冲液体1：1加样2-4微升，同时设立合适的DNA分子量标准物(DL-2000)；
(3)电泳：电压以400V左右维持2h置，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶前沿1-2cm处时，关闭电源；
(4)取出凝胶板，用硝酸银染色；
(5)凝胶呈像系统(Chemi Doc XRS)拍照，记录结果；
(6)经电泳获得的图谱找到所要研究家系的相应特异性分子标记，作为该家系的分子标记。
SEQUENCE LISTING
<110>淮海工学院
<120>一组基于三疣梭子蟹线粒体D-LOOP基因微卫星引物
<130>200902
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<170>PatentIn version 3.3
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