利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法.pdf

本发明涉及一种利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法。其特点是：是在严格限铜的培养基中对甲烷氧化细菌进行分段发酵培养，从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂吸附和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素。在用本发明的方法对甲烷氧化细菌进行分段培养时，甲烷氧化细菌先在较高铜含量的培养条件下快速生长，待达到一定细胞密度后，在低铜培养条件下大量释放甲烷氧化菌素，释放的甲烷氧化菌素不能与铜结合，无法被细胞识别进入细胞内部，从而在发酵介质中积累。从发酵介质中获得甲烷氧化菌素，解决了甲烷氧化菌素进入细胞后结合于内膜系统而分离纯化困难的问题。与常规生产方法相比，本发明的方法可以极大程度地提高甲烷氧化菌素的产量，且简化了甲烷氧化菌素分离纯化的程序，基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌素的应用中发挥巨大作用。

1、  一种利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法，其特征在于：是是在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中分阶段添加CuSO₄，在发酵液中获得甲烷氧化菌素。

2、  根据权利要求1所述的一种利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法，其特征在于：首先在液体培养基中添加5uM CuSO₄培养甲烷氧化细菌，待达到一定细胞密度后再采用低铜含量的培养液培养，使甲烷氧化细菌在严格限铜的培养条件下向发酵液中大量分泌甲烷氧化菌素，其中，低铜培养液中CuSO₄含量范围为0-0.05uM。

3、  根据权利要求1所述的一种利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法，其特征在于：采用严格限铜的培养条件分段培养甲烷氧化细菌，从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂吸附和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素。

利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD)可通过清除超氧化物自由基而达到抗氧化效果，目前已允许SOD作为食品添加剂使用，然而，SOD是一种蛋白质酶，所以在溶液中很不稳定，在受到外界各种物理化学因素的影响时，也会像其它酶蛋白分子那样发生亚基的解聚、变性或其它方面的构象变化。伴随着结构的改变必然导致酶活性的下降或丧失。另外，由于动植物中SOD含量低，提取量非常小，因此作为食品添加剂价格过于昂贵。而采用化学合成法生产的SOD模拟酶虽然产量可能会提高，但往往活性小、非天然、可能还具有毒性等，相比较而言，由于微生物生长快、培养容易，容易工业化，因此利用微生物生产具有超氧化物歧化酶活性的天然抗氧化剂的技术具有广阔的应用前景。甲烷氧化菌素是一种小分子荧光蛋白，来自于甲烷氧化细菌。与铜结合后的甲烷氧化菌素具有较强的超氧化物歧化酶活性，分子量小，结构稳定，是非常有潜力的天然食品抗氧化剂资源。甲烷氧化细菌能够通过甲烷单加氧酶开始的一个酶系将甲烷最终代谢成二氧化碳和水，并在此过程中获得生长所需的碳源和能源，甲烷氧化细菌的生长和甲烷单加氧酶的合成受到铜的调节，铜在甲烷氧化细菌中扮演着重要的生物学角色。甲烷氧化细菌能够分泌对铜具有强亲和力的甲烷氧化菌素捕捉周围环境中的铜，与铜结合的甲烷氧化菌素会被甲烷氧化细菌识别而重新回到细胞中从而起到富集铜的作用。当培养基中铜浓度很低时，分泌的甲烷氧化菌素由于无法与铜结合而被细胞识别，在培养介质中会有甲烷氧化菌素积累。但是低铜培养介质中甲烷氧化细菌由于缺铜而生长缓慢，甲烷氧化菌素产量低，导致发酵介质中甲烷氧化菌素积累量低，不利于分离纯化。当培养基中铜浓度较高时，虽然甲烷氧化细菌生长快，甲烷氧化菌素产量高，但分泌的甲烷氧化菌素与铜结合后会重新回到细胞中在内膜系统中积累，发酵介质中甲烷氧化菌素含量低，而结合于内膜系统中的甲烷氧化菌素分离纯化困难。这些已成为限制甲烷氧化菌素工业化应用的瓶颈问题。因此，使甲烷氧化菌素在发酵介质中大量分泌，以便采用简单的分离纯化方法获得甲烷氧化菌素对实现甲烷氧化菌素作为天然抗氧化剂和防腐剂应用具有着重要意义。
发明内容：
本发明目的是提供一种工艺较为简单、成本低廉、快速的利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的制备方法。本发明目的是这样实现的：是是在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中分阶段添加CuSO₄，在发酵液中获得甲烷氧化菌素。首先在液体培养基中添加5uM CuSO₄培养甲烷氧化细菌，待达到一定细胞密度后再采用低铜含量的培养液培养，使甲烷氧化细菌在严格限铜的培养条件下向发酵液中大量分泌甲烷氧化菌素，其中，低铜培养液中CuSO₄含量范围为0-0.05uM。采用严格限铜的培养条件分段培养甲烷氧化细菌，从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂吸附和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素。本发明目的是在铜浓度不同的培养基中对甲烷氧化细菌进行分段发酵培养，从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种甲烷氧化菌素的生产方法，包括以下2个方面：1、先在较高铜含量培养基(添加5uM CuSO₄)中使甲烷氧化细菌快速生长，待达到一定细胞密度后再将其放入低铜培养基(添加0-0.05uM CuSO₄)中使其大量分泌甲烷氧化菌素(mb)，甲烷氧化细菌在低铜条件下释放的甲烷氧化菌素不能与铜结合，不结合铜的甲烷氧化菌素由于无法被细胞识别进入细胞内部，从而在介质中大量积累。2、从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素(mb)。在用本发明的方法对甲烷氧化细菌进行分段培养时，甲烷氧化细菌先在较高铜含量的培养条件下快速生长，达到一定细胞密度，然后在低铜条件下大量释放甲烷氧化菌素，释放的甲烷氧化菌素不能与铜结合，无法被细胞识别进入细胞内部，从而在介质中积累，解决了甲烷氧化菌素产量低的问题，而且从发酵液中分离纯化甲烷氧化菌素的方法简单，具有较高的工业化应用可行性。与常规方法相比，本发明的方法可以极大程度地提高甲烷氧化菌素的产量，且简化了甲烷氧化菌素分离纯化的程序，基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌素的应用(如作为天然抗氧化剂和防腐剂使用等)中发挥巨大作用，应用前景广阔。
具体实施方式：
是是在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中分阶段添加CuSO₄，在发酵液中获得甲烷氧化菌素。首先在液体培养基中添加5uM CuSO₄培养甲烷氧化细菌，待达到一定细胞密度后再采用低铜含量的培养液培养，使甲烷氧化细菌在严格限铜的培养条件下向发酵液中大量分泌甲烷氧化菌素，其中，低铜培养液中CuSO₄含量范围为0-0.05uM。采用严格限铜的培养条件分段培养甲烷氧化细菌，从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂吸附和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素。本发明目的是在铜浓度不同的培养基中对甲烷氧化细菌进行分段发酵培养，从发酵液中通过离心、Dianion HP-20大孔树脂和冷冻干燥获得甲烷氧化菌素。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为去离子水。
无机盐培养基成分如下(g/L)：
K₂HPO₄：1.06；NaH₂PO₄·12H₂O：4.34；MgSO₄·7H₂O：0.074；CaCl₂·2H₂O：7.0；K₂SO₄：0.34；NaNO₃：1.7；FeSO₄·7H₂O：0.0224；MnSO₄·7H₂O：0.446；ZnSO₄·7H₂O：0.57；Na₂MoO₄·2H₂O：0.096；H₃BO₃：0.124；CoCl₂·6H₂O：0.096；KI：0.166；pH7.0。(甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b培养基)
NH₃Cl：0.5；K₂HPO₄：0.49；KH₂PO₄·7H₂O：0.40；MgSO₄·7H₂O：0.3；CaCl₂·2H₂O：0.02；KNO₃：1.6；NaCl：0.3；FeSO₄·7H₂O：0.004；MnSO₄·H₂O：0.0004；ZnSO₄·7H₂O：0.00034；Na₂MoO₄·2H₂O：0.00024；pH7.0(甲烷氧化细菌M.trichosporium3011培养基)
实施例1、本发明的甲烷氧化菌素的生产以甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b和M.trichosporium 3011为例，具体过程如下：
甲烷氧化细菌在不同铜浓度下分段培养
将甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b或Methylosinus trichosporiumIMV 3011以10％接钟量接种在含有添加5uM CuSO₄的100毫升无菌液体培养基的500毫升密闭的三角瓶中，采用抽真空法将空气置换为甲烷-氧气(1:10，V/V)的混合气，32摄氏度，300转/分钟进行培养，每隔24小时取样进行细胞密度测定，当培养液中OD600达到0.8-1.1时，以8000转/分钟离心得到菌体，将其添加到CuSO₄浓度为0.01uM的低铜新鲜培养基中继续培养。当培养液中OD600达到0.8-1.2时，如果培养介质呈现黄色，则收获细胞，否则继续用低铜培养基替换，直至介质中呈现黄色，即表明甲烷氧化菌素在发酵介质中累积。细胞密度测定采用光密度法，在SP-756P型分光光度计上测定波长600纳米处的光密度值(OD600)。
甲烷氧化菌素的定量测定采用Diaion HP-20大孔吸附树脂层析后冻干称重法。
具体步骤如下：
将培养好的发酵液离心去除细胞，剩余介质以13000xg二次离心20分钟，上清液用Diaion HP-20大孔吸附树脂层析，然后用体积比60％甲醇和40％水的溶液洗提Diaion HP-20，洗提液进行真空冷冻干燥，得到甲烷氧化菌素固体。由于甲烷氧化菌素与铜结合后会变成黄色，在394-422nm处有最大吸收，因此也可以在该波长范围内采用分光光度法进行定量测定。
实施例2、本发明的甲烷氧化细菌培养方法与甲烷氧化细菌常规培养方法在发酵介质中获得甲烷氧化菌素的比较甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b和Methylosinus trichosporium IMV 3011进行本发明培养方法与甲烷氧化细菌常规培养方法在发酵介质中获得甲烷氧化菌素的比较，具体过程如下：
1.甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b和Methylosinustrichosporium IMV 3011的常规培养，用常规方法对甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b和Methylosinus trichosporium IMV 3011进行培养，具体方法为：将甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium IMV 3011以10％接钟量接种在含有添加5uM或0.01uM CuSO₄的100毫升无菌液体培养基的500毫升密闭的三角瓶中，采用抽真空法将空气置换为甲烷-氧气(1:10，V/V)的混合气，32摄氏度，300转/分钟进行培养，每隔24小时取样进行细胞密度测定，并采用抽真空法置换入新鲜的甲烷-氧气(1:10，V/V)的混合气，在相同条件下继续培养，培养72～96小时后中止培养。
2.甲烷氧化细菌M.trichosporium OB3b和Methylosinus trichosporiumIMV 3011的限铜分段培养
具体方法如实施例1
采用限铜分段培养甲烷氧化细菌，其发酵介质中的甲烷氧化菌素的产量高于以正常铜含量和低铜含量培养基常规培养的甲烷氧化菌素的产量，这主要是由于分段限铜培养方法首先保证了正常铜含量下甲烷氧化细菌的快速生长，达到一定细胞密度后在低铜下分泌到介质中的甲烷氧化菌素不能与铜结合被细胞识别而进入细胞内部，从而在介质中大量累积。
结果如表1所示：