抗动物病毒的抗病毒剂
技术领域
本发明涉及抗动物病毒的抗病毒剂。更具体而言，本发明涉及含有作为活性成分的蛋白或编码所述蛋白的核酸序列的抗动物病毒的抗病毒剂，以及含有所述蛋白或编码所述蛋白的核酸序列的抗病毒动物细胞，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合能力和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
发明背景
至今所开发的抗病毒剂大多为根据被感染的病毒类型表现出优良抗病毒活性且具有相对较低毒性的非蛋白药物，所述抗病毒活性例如为病毒吸附抑制、病毒穿透抑制、病毒脱壳抑制、病毒核酸转录(或翻译)抑制(例如，病毒胸苷激酶抑制、病毒反转录酶抑制、病毒聚合酶抑制和病毒mRNA加帽抑制)和病毒蛋白合成抑制。
有数件专利与抗病毒药物有关。例如，针对病毒转录抑制的韩国专利申请第10-2001-0021449号公开了抑制在细胞核内前病毒长末端重复序列(LTR)上的RNA表达的融合蛋白。
美国专利第5,849,800号公开了与病毒脱壳有关的金刚胺。
美国专利第4,957,924号公开了作为抑制病毒核酸的生物合成的抗病毒药物的无环鸟苷。所述无环鸟苷是通过修饰核酸内的糖来制备的药物且用于治疗疱疹病毒感染。所述无环鸟苷与三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)竞争并加入病毒DNA中，由此终止DNA复制。
美国专利第5,108,993号和第5,026,687号分别公开了齐多夫定和双脱氧肌苷，它们是用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的逆转录酶抑制剂。
美国专利第5,962,725号公开了抑制HIV蛋白酶活性以防止HIV产生所需蛋白的奈非那韦(nelfinavir)。
此外，已知阿立酮和普来可那立是介导病毒与宿主细胞结合然后穿透并脱壳的抗病毒药物。据报道，这些药物抑制衣壳蛋白从RNA基因组中脱壳。
已知三氟胸苷是引入到DNA中并由此导致在DNA复制过程中的突变体生长的嘧啶类似物。已知膦甲酸与疱疹DNA聚合酶结合而抑制DNA复制。已知利巴韦林和尼普兰诺辛A(neoplanocin A)是抑制mRNA帽结构的形成而抑制RNA合成的鸟苷和腺苷类似物。
其它抗病毒药物如沙奎那韦、利托那韦和茚地那韦抑制HIV蛋白酶活性而防止HIV产生所需蛋白。
然而，这些抗病毒药物具有副作用，如潜在感染率的增加和在短期内耐药病毒株的连续出现(Magden等，Appl Microbiol Biotechnol66：612-621，2005)。
称作免疫蛋白的抗体广泛用于治疗病毒疾病。但是，抗体的临床使用局限于涉及抗体对抗特定病毒的中和机制的被动免疫。例如，已知的帕利珠单抗(palivizumab)(Cardenas等，Expert Rev Anti Infect Ther3：719-726，2005)针对存在于呼吸道合胞病毒(RSV)包膜内的F-糖蛋白的A抗原位点内的表位。
美国专利第6,818,216号公开了一种新型抗RSV抗体，由于所述抗体与传统抗RSV抗体相比具有更优异的亲和力，因而可以以低剂量施用。
然而，这些抗体的根本性问题在于，由突变体在基因抗原结构上的改变抑制了抗体继续识别所述抗原，因此无法实现对抗原具有特异性的所述抗体的抗病毒活性。
造成这一问题的原因在于，抗病毒抗体的开发针对的是病毒基因产物。作为解决该问题的一个替代方案是开发出病毒核酸靶向抗体。然而，目前还未有与所述替代方案的抗体有关的报道。核酸酶据报道是降解核酸的酶。核酸酶转移到宿主细胞中对于该细胞而言是非常具有细胞毒性的，因而引起细胞死亡这一根本性问题。这种问题不可避免地限制了病毒核酸靶向抗体的开发。
同时，仅有少数称作催化抗体的抗体蛋白在与抗原结合的同时对该抗原表现出酶促活性。某些抗DNA抗体、抗RNA抗体和抗DNA/RNA抗体称作天然产生的催化抗体(Buneva等，Appl Biochem Biotechnol 75：63-76，1998；Jang等，cell MoI Life Sci 60：309-320，2003)。
另外，本领域内已知的唯一抗DNA催化抗体是BV04-01，BV04-01具有基于重组单链可变片段(scFv)的结构，并且表现出作为降解单链和双链DNA的抗DNA催化抗体的催化活性(Gololobov等，Mol Immunol34：1083-1093，1997)。
然而，对BV04-01的RNA酶活性、在动物细胞上的抗病毒活性和对自衍生的核酸的保护可能性根本没有报导。
发明内容
技术问题
本发明的一个方面是提供一种新型抗病毒剂，所述抗病毒剂具有对侵入动物细胞的外来核酸链的选择性降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性，因此不造成所述动物细胞的死亡。
本发明的另一个方面是提供一种抗病毒动物细胞，所述抗病毒动物细胞具有对侵入动物细胞的外来核酸链的选择性降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性，因此不造成所述动物细胞的死亡。
技术方案
根据为实现上述方面的本发明的一个方面，提供了抗动物病毒的抗病毒剂，所述抗病毒剂含有作为活性成分的蛋白，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的选择性结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
根据本发明的另一个方面，提供了一种抗动物病毒的抗病毒剂，所述抗病毒剂含有作为活性成分的编码蛋白的核酸序列，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的选择性结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
根据本发明的又一个方面，提供了一种含有作为活性成分的蛋白的抗病毒动物细胞，所述蛋白具有对引入动物细胞的外来核酸链的选择性结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
根据本发明的另一方面，提供了一种含有作为活性成分的编码蛋白的核酸序列的抗病毒动物细胞，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的选择性结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
有利作用
从上文可以明显看出的是，本发明的抗病毒剂能选择性地降解侵入动物细胞的外来核酸链，并且对所述动物细胞没有细胞毒性，因此表现出所述宿主细胞能够受到保护且能够只除去所述外来核酸链的有利作用。
附图说明
从如下详细说明并结合附图将可以更清晰地理解本发明的上述和其它方面、特性和其它优点，其中：
图1显示了本发明的3D8 scFv蛋白的VH、VL和接头的碱基和核酸序列(由“方框”表示的部分对应于所述接头的序列)；
图2显示了在细菌中表达的本发明的3D8 scFv、3D8VH和3D8 VL蛋白的表达载体图；
图3显示了确定表达在细菌中并纯化的本发明的3D8 scFv、3D8 VH和3D8VL蛋白的纯度的SDS-PAGE分析结果；
图4显示了确定以单体形式存在的本发明的VH和VL蛋白的HPLC结果；
图5显示了确定本发明的VH和VL之间的关联的表面等离子共振(SPR)分析结果；
图6显示了确定本发明的3D8 scFv、VH和VL抗体蛋白与具有不同碱基序列的ssDNA和dsDNA的亲和力的表面等离子共振(SPR)分析结果；
图7显示了在不同浓度的NaCl存在下的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果，该结果确定了本发明的3D8 scFv、VH和VL抗体蛋白与DNA的结合主要由静电力造成；
图8～10显示了琼脂糖凝胶电泳结果，该结果确定了本发明的3D8scFv、VH和VL蛋白的双链(ds(N)40)DNA降解活性取决于Mg2+和反应时间(在图8和图9中，“B”是用作对照组的BSA蛋白；“Mg”是Mg2+处理组；“E”是EDTA处理组，“M”是标记；“rc”是DNA的“松弛环形形式”的缩写；“lin”是“线性形式”的缩写并指线性DNA；而“sc”指“超螺旋形式”的缩写并指完全螺旋DNA)；
图11显示了原位丙烯酰胺凝胶测定结果，该结果确定了本发明的3D8 scFv、VH和VL蛋白的dsDNA降解活性基于所述蛋白的固有性质(“Etbr处理组”是对比数据结果的黑白色的组，其中深色位置是DNA不与Etbr反应的位置)；
图12显示了亲和力连接寡核苷酸核酸酶测定(ALONA，affinity-linked oligonucleotide nuclease assay)结果，该结果确定了本发明的3D8scFv、VH和VL蛋白的DNA酶活性对碱基序列不具有特异性；
图13显示了由X射线衍射分析的本发明的3D8 scFv蛋白晶体的结构；
图14显示了根据本发明的3D8 scFv蛋白晶体和作为传统抗DNA催化抗体的BV04-01的重叠结构；
图15显示了本发明的3D8 VH蛋白晶体的结构；
图16显示了本发明的3D8 VL蛋白晶体的结构；
图17显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)结果，该结果确定了scFv突变体的DNA结合能力和DNA酶活性，在所述突变体中，两个组氨酸(His)残基由丙氨酸取代(黑柱：ds-(dN：dN′)40，白柱：ss-(dN)40)；
图18显示了确定scFv突变体的DNA酶活性的琼脂糖凝胶电泳结果，在所述突变体中，两个组氨酸(His)残基由丙氨酸取代(“B”是用作对照组的BSA蛋白；“Mg”是Mg2+处理组；“E”是EDTA处理组，“M”是标记；“rc”是DNA的“松弛环形形式”的缩写；“lin”是“线性形式”的缩写并指线性DNA；而“sc”指“超螺旋形式”的缩写并指完全螺旋DNA)；
图19显示了确定3D8 VH突变体和3D8 VL突变体的DNA结合能力变化的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果，在所述突变体中，两个组氨酸(His)残基由丙氨酸取代(黑柱：ds-(dN：dN′)40，白柱：ss-(dN)40)；
图20显示了琼脂糖凝胶电泳结果，该结果确定了3D8 VH突变体和3D8VL突变体的DNA酶活性变化，在所述突变体中，一个组氨酸(His)残基由丙氨酸取代(“B”是用作对照组的BSA蛋白；“Mg”是Mg2+处理组；“E”是EDTA处理组，“M”是标记；“rc”是DNA的“松弛环形形式”的缩写；“lin”是“线性形式”的缩写并指线性DNA；而“sc”指“超螺旋形式”的缩写并指完全螺旋DNA)；
图21显示了琼脂糖凝胶电泳结果，该结果根据反应时间确定了本发明的scFv蛋白的RNA酶活性；
图22显示了原位水解测定，其中确定了本发明的3D8scFv蛋白的RNA酶活性是归因于所述蛋白的固有性质(“Etbr处理组”是对比数据结果的黑白色的组，其中深色位置是RNA不与Etbr反应的位置)；
图23显示了亲和力连接寡核苷酸核酸酶测定(ALONA)结果，该结果确定了本发明的3D8 scFv蛋白的RNA酶活性不依赖于Mg2+；
图24和图25显示了荧光显微镜图像，其中确定了转移进vero细胞的本发明的3D8scFv蛋白表现出对水泡性口炎病毒(VSV)增殖的抑制活性(“3D8-”指“不含3D8 scFv蛋白”，“3D8+”指“注射了3D8 scFv蛋白”，“VSV-”指“未用VSV处理”，而“VSV+”指“经VSV处理”)；
图26和27显示了荧光显微镜图像，确定了转移进vero细胞的本发明的3D8 scFv蛋白表现出对水泡性口炎病毒(VSV)增殖的抑制活性(“3D8-”指“不含3D8 scFv蛋白”，“3D8+”指“注射了3D8 scFv蛋白”，“VSV-”指“未用VSV处理”，而“VSV+”指“经VSV处理”)；
图28显示了MTT测定结果，该结果确定了通过VSV感染的细胞病变效应(CPE)是否在引入了3D8 scFv、3D8 VH、3D8 VL或其它蛋白的各个vero细胞上被抑制；
图29显示了共聚焦显微镜的免疫荧光染色结果，该结果确定了在其中转移有3D8 scFv、VH和VL蛋白的各个HeLa细胞上的VSV增殖抑制活性(“3D8-”指“不含3D8 scFv蛋白”，“3D8+”指“注射了3D8 scFv蛋白”，“VSV-”指“未用VSV处理”，而“VSV+”指“经VSV处理”)；
图30是其中克隆有3D8 scFv基因的动物细胞表达载体的示意图；
图31显示了RT-PCR结果，该结果确定了3D8 scFv mRNA在其中稳定转染有3D8 scFv基因的NIH/3T3细胞中顺利表达；
图32显示了使用TRITC的免疫荧光染色测定的结果，该结果确定了3D8 scFv mRNA在其中稳定转染有3D8 scFv基因的NIH/3T3细胞中的表达(“a”是显示不含3D8 scFv的NIH/3T3细胞的图像，而“b”是显示经3D8 scFv转染的NIH/3T3细胞的图像)；
图33是显示了RT-PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图像，所述结果确定3D8 scFv mRNA在经转化的HeLa细胞系中的表达；
图34显示了流式细胞测定结果，该结果确定3D8 scFv蛋白在代表性转化HeLa细胞系中的表达；
图35是显示RT-PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图像，所述结果确定3D8scFv mRNA在经转化的PK15细胞中的表达；
图36显示了MTT测定结果，该结果确定VSV引起的细胞病变效应(细胞死亡)是否在表达3D8 scFv蛋白的NIH/3T3细胞中被抑制；
图37显示了荧光显微镜测定结果，该结果确定VSV引起的细胞病变效应(细胞死亡)是否在表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞中被抑制；
图38显示了胞内染色结果，该结果确定了CSFV(典型猪瘟病毒)的增殖在经转化的PK15细胞内被抑制；
图39显示了MTT测定结果，该结果确定表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的定量抗VSV活性；
图40显示了荧光显微镜测定结果，该结果确定表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的抗VSV活性(细胞死亡抑制)；
图41显示了显微镜测定结果，该结果确定表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的抗ADV活性(细胞死亡抑制)；和
图42显示了显示RT-PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图像，所述结果确定经转化的HeLa细胞系的ADV病毒增殖抑制活性。
具体实施方式
现在将参考附图更详细地对本发明进行说明。
本发明提供了含有作为活性成分的本发明的蛋白或编码所述蛋白的核酸序列的抗病毒剂，以及含有作为活性成分的本发明的蛋白或编码所述蛋白的核酸序列的抗病毒动物细胞。
在一方面，本发明涉及含有作为活性成分的蛋白的抗动物病毒的抗病毒剂，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的选择性结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性，本发明还涉及含有作为活性成分的编码蛋白的核酸序列的抗动物病毒的抗病毒剂，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
在另一方面，本发明涉及含有作为活性成分的蛋白的抗病毒动物细胞，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性，本发明还涉及含有作为活性成分的编码蛋白的核酸序列的抗病毒动物细胞，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
根据本发明，用于所述抗病毒剂和抗病毒动物细胞的蛋白必须能与外来核酸链结合并降解所述核酸链，同时对所述动物细胞没有细胞毒性。
作为符合这些要求的蛋白的一个实例，评估了经分离并纯化的3D8蛋白的抗动物病毒的抗病毒活性。如从下列实施例1中所能见到的，评估结果表明所述3D8蛋白展示了抗动物病毒的抗病毒活性且没有细胞毒性。
本文所用术语“对外来核酸链的结合能力”指蛋白能识别核酸(如DNA和RNA)链并与所述核酸链结合的能力。蛋白与核酸链的结合基于在构成蛋白的氨基酸中的正电荷与DNA或RNA的磷酸主链中的负电荷之间的偶联。
抗核酸抗体和核酸酶通常通过识别DNA或RNA的特定序列来结合所述DNA或RNA。如从实验例2和5中可以明显看出，本发明的蛋白与核酸链结合而没有任何序列特异性，因此广泛用在与核酸降解活性相关的研究领域。
本文所用术语“对外来核酸链的降解能力”指蛋白能够通过水解切割诸如DNA和RNA等核酸链的能力。该术语也叫做“催化能力”。
同时，本文所用术语“细胞毒性”指细胞被侵入性外来材料杀死的现象。DNA酶(DNA降解酶)和RNA酶(RNA降解酶)通常具有细胞毒性。
另一方面，本发明的蛋白的特征在于对自身衍生的细胞没有细胞毒性。
编码具有对引入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力且对所述动物细胞没有细胞毒性的蛋白的核酸序列可为RNA或DNA序列。从稳定性角度考虑，优选的是DNA序列。
所述DNA序列可为被引入能在动物细胞内表达基因的载体中的核酸序列。如实施例4所能确定的，在动物细胞内具有这样的DNA序列的基因的引入导致蛋白的有效表达和有效抗病毒活性的展现。
优选的是，用于本发明的抗病毒剂和抗病毒动物细胞的蛋白获自诱发了自身免疫疾病的动物，所述蛋白能结合侵入性核酸链并降解所述核酸链且对动物细胞自身没有细胞毒性。这就是与核酸结合或反应的蛋白已知与自身免疫疾病密切相关的原因。在本发明中，对于所述动物没有特别限制。可以使用任何动物而没有特别限制，只要所述动物自然地诱发自身免疫疾病即可。优选的是使用小鼠。
在对所述动物诱发出自身免疫疾病的基因中，优选的是功能异常的Ipr基因。
具有功能异常Ipr基因的动物易患上自身免疫疾病。因此，具有对外来核酸链的结合和降解能力同时对动物细胞没有细胞毒性的蛋白可以容易地从所述Ipr基因功能异常的动物中获取。
Ipr基因介导了造成凋亡的主要因素之一的Fas蛋白的产生。Fas蛋白在细胞表面介导细胞凋亡。当Fas蛋白被激活时，细胞开始执行凋亡机制。另一方面，当Ipr基因受损时，Fas蛋白的形成被抑制，并且由此使正常细胞凋亡不会发生。该机制抑制了能攻击自身细胞的淋巴细胞的去除，因此导致自身免疫疾病。
作为能结合侵入动物细胞的外来核酸链并降解所述核酸链且对所述动物细胞没有细胞毒性的蛋白，可以使用具有对外来核酸链的特异性结合和降解能力的免疫球蛋白或其片段。所述免疫球蛋白可以优选为免疫球蛋白G(IgG)。更具体而言，所述IgG可为3D8蛋白。
本文所用“免疫球蛋白”是在免疫中起重要作用且发挥抗体的作用的血清成分的蛋白总称。这些免疫球蛋白由通过二硫键相连的一对分子量约为23,000的轻链(CL)和一对分子量约为50,000～70,000的重链(CH)构成。由γ、α、μ、δ和ε表示的重链类型确定了抗体类别，例如分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。
IgG由一对分子量约为25,000的轻链和一对分子量约为50,000的重链构成，且总分子量为150,000。
IgG是在高等动物(两栖动物或更高等)中很重要的免疫球蛋白，占整个人类免疫球蛋白的约70％，通过胎盘并表现出各种抗体活性。
同时，任何免疫球蛋白片段可以单独使用或作为它们的组合使用，只要它能结合核酸链并降解所述核酸链。优选的是选自scFv、VH、VL以及与VH和VL结合的Fv的片段。
scFv(单链可变片段)是通过接头连接的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的融合体。已知这种scFv与单独使用的VH或VL相比具有强的抗原结合力。介导VH和VL之间的结合的接头可为本领域内常用的任何类型。
如上所述，已知VH或VL的抗原结合力通常弱于scFv的抗原结合力。然而，在打算改善进入组织的渗透性的某些情形中，仍优选VH或VL。
优选的是，所述scFv可具有如SEQ ID NO 6所示的序列，所述VH可具有如SEQ ID NO 2所示的序列，而所述VL可具有如SEQ ID NO 4所示的序列。
在本发明的蛋白所需的核酸链结合能力和核酸链降解能力方面，任何蛋白只要具有对RNA的特异性结合/降解能力或对DNA的特异性结合/降解能力，都可用来获得本发明所想要的效果。因此具有仅对RNA链的特异性结合和降解能力的蛋白只能应用于RNA病毒，而具有仅对DNA链的特异性结合和降解能力的蛋白只能应用于DNA病毒。
更优选的是使用对DNA和RNA链都具有结合和降解能力的蛋白，因为它们对RNA病毒和DNA病毒均可以使用。
在本发明中，对侵入动物细胞的病毒没有特别限制。具体而言，所述病毒可为基于RNA的病毒，更具体而言，所述病毒可为HIV病毒(人类免疫缺陷)或SARS(严重急性呼吸道综合征)病毒。
在对确定具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合能力和降解能力且对所述动物细胞自身没有细胞毒性的蛋白是否表现出如上所述的抗动物病毒的抗病毒活性的尝试中，使用根据制备例1的方法获得的3D8抗体(IgG)的VH、VL和scFv域作为一个实例。根据制备例2的方法从3D8杂交瘤细胞中获得了所述VH、VL和scFv域抗体。将这些抗体在大肠杆菌内过表达并纯化后使用。
在实验例1中，研究了VH和VL蛋白的存在形式和它们之间的结合。研究结果确定，VH和VL蛋白均以单体而不是以多聚体形式存在，且VH和VL彼此自然结合形成Fv。
在实验例2中，研究了所述VH、VL和scFv蛋白的DNA结合能力和特性。从评估结果中可确定的是，所有这三种抗体蛋白(scFv、VH和VL蛋白)具有相当高的与ssDNA和dsDNA的结合力。scFv的DNA结合亲和力比VH和VL的DNA结合亲和力高出100倍～1,000倍。该结果显示，VH和VL域共存的蛋白的DNA亲和力要优于单独存在VH和VL域的蛋白的DNA亲和力。
在实验例3中，评估了所述VH、VL和scFv抗体蛋白的DNA降解活性和底物特异性。在镁离子(Mg2+)的存在下，所述抗体蛋白的DNA酶活性的顺序为scFv>VL>>VH。另一方面，在EDTA存在下，所有蛋白的DNA酶活性都被抑制。具体而言，从琼脂糖凝胶电泳测定中确定了随着时间的推移，所述蛋白降解了ss M13mp18 DNA以及ds M13mp18DNA。
使用亲和力连接寡核苷酸核酸酶测定(ALONA)来探查DNA酶活性的底物特异性。所述scFv、VH和VL蛋白基本没有表现出在DNA酶活性方面的DNA底物特异性。
从实验例4中确定了scFv、VH和VL蛋白通过不同机理降解DNA。
作为具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合能力和降解能力且对所述动物细胞自身没有细胞毒性的蛋白的一个实例，使用3D8 scFv蛋白来评估RNA酶活性。作为实验例5的结果，可以确定的是，所述scFv蛋白表现出对dsRNA和ssRNA的RNA酶活性，并取决于反应时间。所述底物特异性测定结果表明，scFv抗体蛋白在RNA酶活性方面能够降解RNA/DNA杂交体以及ssRNA和dsRNA。
在实施例1中，在用水泡性口炎病毒对注射了3D8 scFv蛋白的动物细胞进行转染后，证实了3D8 scFv蛋白抗所述病毒的抗病毒活性。结果，可以证实的是，其中没有引入3D8 scFv蛋白的动物细胞发生了细胞死亡(细胞死亡是由VSV导致的细胞病变效应(CPE)之一)(图24)，然而其中引入了3D8 scFv蛋白的动物细胞不管进行VSV感染与否都仍然存活。此外，在HeLa细胞(人类宫颈癌细胞系)上观察到了所述3D8 scFv蛋白的细胞死亡抑制活性。
其中没有感染VSV的转移有3D8 scFv蛋白的Hela细胞没有所述3D8 scFv蛋白所固有的细胞毒性。另一方面，作为对照组的转移有RNA酶A的Hela细胞(未转染有VSV)由于所述RNA酶A所固有的细胞毒性而全部死亡。
这些结果表明，所述3D8 scFv蛋白的抗病毒活性显著大于传统核酸酶的抗病毒活性，而具有对引入动物细胞的外来核酸链的结合能力和降解能力同时对所述动物细胞自身没有细胞毒性的蛋白展现了抗动物病毒的抗病毒活性。
从实施例2所获得的结果确定，3D8 VH和VL蛋白以及3D8 scFv蛋白展现出抗动物病毒的抗病毒活性。
即使在编码具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合能力和降解能力且对所述动物细胞没有细胞毒性的蛋白的核酸序列侵入动物细胞的情形中，也证明了所述核酸序列展示出抗病毒感染的动物细胞的抗病毒活性。具体而言，从实施例4可以证实，3D8 scFv基因转染的动物细胞也产生scFv蛋白，而且还表现出抗多种病毒的抗性。
下文中将给出本发明的抗动物病毒的抗病毒剂的配制和使用方法。
<配制和施用：含有作为活性成分的蛋白的抗动物病毒的抗病毒剂，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力，并且对所述动物细胞自身没有细胞毒性>
含有本发明的蛋白作为活性成分的抗动物病毒的抗病毒剂能够选择性地降解侵入的外来核酸链，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。具体而言，本发明的抗病毒剂能够只除去侵入性外来病毒而不杀死自身细胞，因此可用于病毒介导的疾病，如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。更具体而言，所述疾病的治疗影响了受病毒感染的细胞，并因此防止了所述细胞的死亡。
本发明的抗病毒剂含有作为活性成分的蛋白，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合能力和降解能力，并且对所述动物细胞本身没有细胞毒性。
“含有作为活性成分的蛋白的抗病毒剂”这一表述是指，以使所述蛋白能发挥所需抗病毒活性的量将所述蛋白添加到所述抗病毒剂中，并且在光一上是指，所述蛋白与各种用于递送和稳定药物的佐剂一起配制为多种剂型。
优选的是，所述蛋白可包括具有对外来核酸链的结合/降解能力的免疫球蛋白或其片段。更优选的是，所述免疫球蛋白可为免疫球蛋白G(IgG)。最优选的是，所述IgG可为3D8蛋白。优选的是，所述免疫球蛋白片段可为选自scFv、VH、VL以及与VH和VL结合的Fv中的片段。
本发明的抗病毒剂还可包含药用载体或添加剂(一般而言，缓冲剂溶液、等渗溶液或水性悬浮液等，并且可选的是稳定剂或防腐剂等)。制剂通常包含盐水和可选的经保护或稳定处理的分子，如高分子量蛋白(例如，人类血清白蛋白)。
将具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力且对所述动物细胞自身没有细胞毒性的蛋白(优选为IgG或其片段)，以使得所述蛋白“有效”或“对治疗有效”的剂量施用于受体。
施用于受体的蛋白的有效剂量可在约0.1mg/kg～约20mg/kg范围内。一般而言，蛋白的有效剂量根据各种因素如蛋白类型(例如，整个IgG或其片段)、亲和力和具体治疗蛋白的个体特性来确定，并且取决于药代动力学参数。因此，本发明的蛋白的有效剂量可取决于这些不同的因素。
根据本发明的主要实施方式，含有蛋白的抗病毒剂的使用能使所述治疗蛋白即使以低剂量施用也能实现所需的疗效。
此外，本发明的治疗蛋白的使用(例如，剂量和处方设计)可能受到不希望的副作用(例如，发热、头疼、气喘和血压降低等)的限制。
于是，对患者施用的治疗蛋白的标准剂量可以根据患者的个体特性而改变。在实践中，熟练临床医师可以考虑例如具体必要性和患者的总体状况等因素来为患者设计出最优选的治疗策略(例如，最佳剂量和用药方案)。治疗蛋白的合适剂量可根据各种基准来确定。
根据本发明的一个实施方式，医师可在逐渐减少治疗蛋白的给定量的同时，对患者施用本发明的含所述蛋白的抗病毒剂。在监测了治疗蛋白的效能、病毒缺陷细胞的活性和各种治疗症状，同时考虑剂量和施用频率后，可以控制治疗蛋白的相对浓度和剂型以优化疗效并使副作用最小化。
同时，本发明的治疗蛋白通常可在体外或通过动物模型确定。例如，可以通过以下方法来确定最佳剂量，即，在体外将不同浓度的本发明的治疗蛋白引入目标细胞(病毒感染细胞)中，然后评估所述目标细胞的死亡比例。
可通过静脉内、腹膜内、动脉内、肌内或皮内注射直接对受试对象施用本发明的含有所述治疗蛋白的抗病毒剂。
诸如利妥昔单抗(rituxan)(以RituximabTM的名称销售)和奥马珠单抗(omalizumab)(以XolairTM的名称销售)等单克隆抗体在临床治疗中有效且等价处方方案(即，制剂和/或剂量和/或用药程序)可用于本发明的含有所述治疗蛋白的抗病毒剂。
本发明的抗病毒剂可与化学疗法或治疗病毒疾病的治疗程序或其组合联合来同时使用或相继使用。
<配制和施用：含有作为活性成分的编码蛋白的核酸序列的抗动物病毒的抗病毒剂，所述蛋白具有对侵入动物细胞的外来核酸链的结合和降解能力，并且对所述动物细胞自身没有细胞毒性>
可以使用数个单独的表达载体或单个表达载体来进行DNA序列的表达，如编码蛋白的核酸序列的表达。
优选的是，根据本发明的核酸序列编码的蛋白包括具有对外来核酸链的结合/降解能力的免疫球蛋白或其片段。更优选的是，所述免疫球蛋白可为免疫球蛋白G(IgG)。最优选的是，所述IgG可为3D8蛋白。此外，所述免疫球蛋白片段可为选自scFv、VH、VL以及与VH和VL结合的Fv中的核酸编码的免疫球蛋白片段。
如果分别对各个序列采用单一载体，可在注射和电穿孔前将所述载体混合以便允许个体肌肉细胞携带上和表达各所述载体。
本文所用术语“表达载体”指通过编码多肽的核酸的插入或合并来操作且能在所述载体处于适当环境中时指导所述多肽的表达的质粒或媒介物。
合适的表达载体通常包含启动子、复制起点、聚A识别序列和核糖体识别位点或内部核糖体进入位点，且可包含诸如增强子等其它调控元件(组织特异性)。
帮助所插入的编码核酸序列在肌肉内有效转录的启动子可以为组成型，或如果需要时可为诱导型、组织特异型或发育阶段特异型。可用于本发明的启动子的实例包括通常在肌肉内发挥功能的启动子，如骨骼肌动蛋白基因启动子(Muscat等，Mol.Cell.Biol.7，4089(1989))、肌肉肌酸激酶启动子(Sternberg等，Mol.Cell.Biol.，8，2896(1988))和肌球蛋白轻链增强子/启动子(Donoghue等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 88，5847(1991))。
优选的表达载体包含具有多个核酸内切酶限制位点的表达盒，所述核酸内切酶限制位点允许编码不同多肽的DNA以将所述编码DNA与启动子或载体的其它转录调控元件操作性地连接的方式容易地克隆到所述表达盒内。优选的表达载体还可具有用于原核细胞的复制起点和至少一个选择性标记以帮助克隆到这类细胞中。本领域内的技术人员了解如何通过选择用于在肌肉中表达的多肽的正确配置有启动子、增强子和其他转录或翻译调控元件的适当组合的载体来优化表达。
本发明的方法学允许分别来自骨骼肌、平滑肌和心肌的多链蛋白表达。优选的是骨骼肌注射后的表达，因为该肌肉来源丰富且易于获得。对于骨骼肌，所述表达载体可以通过传统方式(如注射器和针)或通过无针注射装置经皮肤注射进入所述骨骼肌。后一类装置在本领域内是熟知的，并且通常涉及通过紧贴皮肤保持的微孔的压力辅助输送。
可参考授予Morrow等的美国专利第4,596,556号、授予Parsons的美国专利第4,913,699号和授予Castellano等的美国专利第5,730,723号适当地选择注射装置。另一种可商购获得的注射装置是BIOJECTTM(来自Bioject Medical Technologies，Inc.，Portland Oregon U.S.A.)。另一种无针注射装置是使用加压气体来作为气压功能而将小颗粒(例如，金颗粒)输送到目标皮肤位点的基因枪输送系统。生物导弹输送装置的实例是PDS-1000“基因枪”(由美国Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware销售)。
表达载体可以在0.9％的氯化钠中施用，然而，可以加入各种溶剂和赋形剂而不影响表达水平。例如，本领域内众所周知的是，蔗糖能增加在骨骼肌中的DNA吸收。
可以根据熟知方法，将本发明的表现出抗动物病毒的抗病毒效能的动物细胞用于实验用途和细胞药物。
本发明的方式
参考下列实例(制备例、实验例和实施例)来对本发明进行更详细的说明。本发明的范围不必限于这些实例且旨在包括利用等效技术思想的修改。
实施例
制备例1：3D8杂交瘤细胞系的建立
利用聚乙二醇(PEG)4000融合MRL-lpr/lpr小鼠的脾细胞(来自美国Jackson Laboratory)和V653细胞(来自韩国细胞系库)并在37℃于5％CO2培养箱中的次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基(来自Sigma-Aldrich，Inc.)中培养15天。在培养期间，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)选择具有DNA结合能力的抗体。
通过有限稀释法将所述细胞系培养两次，以获得约十种分泌抗DNA抗体的杂交瘤细胞系。通过ELISA从所述杂交瘤细胞系中选出显示出最大DNA结合能力的分泌抗DNA抗体的细胞系。将所选的细胞系在2006年9月13日存到韩国细胞系研究基金会(KCLRF，Korean Cell LineResearch Foundation)(登录号：KCLRF-BP-00146)。
使用同种型检测定剂盒(Pierce，Inc.)检测出所选的杂交瘤细胞系分泌的抗体的同种型。结果，确定从所述细胞系衍生的抗体是IgG2a/κ并称为“3D8”。
制备例2：克隆来自3D8杂交瘤细胞系的重链(VH)和轻链(VL)可变域基因
将约1×106的获自制备例1的杂交瘤细胞溶解于0.2mL的RNA提取试剂中(RNAzol BTM；TEL-TEST，Inc.)并均化。在所述溶液中加入0.02mL氯仿，彻底搅拌15秒，然后让其在冰浴中静置5分钟。离心所得溶液，然后分离所得上清液。向残留物中加入0.25mL乙醇，让其在4℃静置15分钟，然后离心(12000g，4℃)15分钟。所得RNA沉淀用70％乙醇洗涤、干燥并溶解于重蒸水中。测量所述RNA在260nm和280nm处的吸光度，并确定所述RNA的纯度和产量。
使用RT-PreMix试剂盒(BioneerInc.)由如此获得的RNA合成cDNA。此时，使用寡聚(dT)寡核苷酸作为引物。使用所述cDNA作为模板，用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增VH和VL基因。
用于VH基因扩增的引物组如下：
正向：5′-ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT-3′(SEQ ID NO 7)
反向：5′-TGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3′(SEQ IDNO 8)
使用Taq DNA聚合酶通过降落PCR对所述VH基因进行30个循环的扩增。(每个循环中的)降落PCR条件如下：94℃×1分钟->每个循环(从初始退火温度(65℃))降低0.5℃×1分钟->72℃×1分钟。
用于VL基因扩增的引物组如下：
正向：5′-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGTGTCTC-3′(SEQ IDNO 9)
反向：5′-GGATGGTGGGAAGATGGATAC-3′(SEQ ID NO 10)
使用Taq DNA聚合酶通过降落PCR对所述VL基因进行30个循环的扩增。(每个循环中的)降落PCR条件如下：94℃×1分钟->每个循环(从初始退火温度(63℃))降低0.3℃×1分钟->72℃×1分钟。
用1％琼脂糖凝胶对各自的PCR反应溶液进行电泳，并从所述凝胶中提取了VH和VL基因，然后将它们克隆到pGEM-T Easy载体(来自Promega Corp.)中。克隆基因的碱基序列由Perkin Elmer 373A自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.)分析。
用于碱基序列分析的引物组如下：
正向：5′-CAAGCTGGGATTTAGGTG-3′(SEQ ID NO 11)
反向：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ ID NO 12)
从碱基序列分析结果中可以确定，所述VH基因的碱基序列与SEQID NO 1所示的序列相同，所述VH基因的氨基酸序列与SEQ ID NO 2所示的相同，所述VL基因的碱基序列与SEQ ID NO 3所示的相同，而所述VL基因的氨基酸序列与SEQ ID NO 4所示的相同。Blast搜索结果确定至今尚未有这种碱基序列的报道。
制备例3：VH、VL和scFv(单链片段可变)域基因在细菌表达载体中的亚克隆
为在细菌中表达VH或VL蛋白，将在制备例2中所获的VH和VL基因克隆到pIg20H和pIg20L载体(来自美国Stollar BD教授，TuftsUniversity)中。制备了含有作为限制酶识别位点的XmaI/XbaI片段的引物并将其用于VH克隆。同时，制备了含有作为限制酶识别位点的BglII/NcoI片段的引物并将其用于VL克隆。
为构造scFv构建体，将分别克隆在pGEM-T Easy载体(Promega Corp.)上的VH和VL基因相继亚克隆在含有接头DNA(解码为“GGGGS3”)的pIg20表达载体中(来自美国Stollar BD教授，Tufts University)。此处所用的引物的碱基序列如下：
<用于VH亚克隆的引物>
正向：5′-TCCCCCCGGGAGGTCCAGCTG-3′(SEQ ID NO 13)
反向：5′-GCTCTAGAGGAGACGGT-3′(SEQ ID NO 14)
<用于VL亚克隆的引物>
正向：5′-GAAGATCTTGTGATGTCA-3′(SEQ ID NO 15)
反向：5′-CATGCCATGGTGATGATGATGTTTTATTTCCAG-3′(SEQID NO 16)
作为所述亚克隆的结果，获得了pIg20H-3D8VH、pIg20L-3D8VL和pIg20-3D8 scFv载体(克隆在所述pIg20载体中的scFv基因的碱基序列如图1所示，而所述pIg20H-3D8VH、pIg20L-3D8VL和pIg20-3D8 scFv载体的图如图2所示)。所述scFv基因分别具有如SEQ ID NO 5所示的碱基序列和如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
制备例4：3D8重组scFv、VH和VL抗体蛋白的表达和纯化
为了纯化VH、VL和scFv蛋白，将pIg20H-3D8VH、pIg20L-3D8VL和pIg20-3D8 scFv载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysE细胞中(来自Novagen Inc.)，并在含100μg/mL的氨苄青霉素和20μg/mL的氯霉素的LB培养基中培养直到吸光度(A600)达到0.8。在所述培养基中加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)并在常温下再培养4小时。将所培养的细胞离心(10,000×g，4℃)10分钟，然后将所得上清液经0.45μm过滤膜过滤。使滤液以1mL/分钟的流动速率通过IgG-琼脂糖柱(Amersham pharmacia Biotech Ltd.)，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)和乙酸铵(pH5.0)洗涤，然后用0.1M乙酸(pH3.4)洗脱。将洗脱的蛋白用PBS透析并在还原条件下进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以确定所述蛋白的纯度。
图3显示了VH、VL和scFv蛋白的SDS-PAGE分析结果。在对20μg的各种蛋白进行SDS-PAGE并用考马斯蓝染色后，确认三种重组抗体已被纯化，纯净度为95％以上。
实验例1：VH和VL蛋白的存在形式和它们之间的结合
使用HPLC系统对经纯化的VH、VL、scFv和Fv(定义为具有VH和VL之间的非共价键的可变片段)蛋白执行尺寸排阻色谱(SEC)。将0.02mL蛋白(浓度为5μM～20μM)注射到TSK G3000SWXL柱中(TosoHaas，日本)，并使磷酸盐缓冲溶液(50mM磷酸钠/150mM NaCl，pH7.4)以0.7mL/分钟的流动速率在其中流过，根据280nm处的吸光度获得所述蛋白的色谱图。
在磷酸盐缓冲溶液条件下，VH和VL蛋白都以单体的形式存在，并没有观察到多聚体形式的VH或VL(图4)。
此外，从图4中看到了VH-VL结合的Fv。用表面等离子共振(SPR)生物传感器(Biacore ![]()
，Pharmacia，瑞典)分析了VH和VL蛋白之间的定量结合。将0.5mg/mL～1.0mg/mL的VL蛋白固定在羧甲基化葡聚糖涂覆的CM5传感器芯片(Amersham pharmacia Biotech制造)表面并让VH蛋白(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM)在磷酸盐缓冲溶液条件下在所述芯片表面上流过。感应谱分析显示，VH与VL以14nM的结合亲和力KD偶联(图5)。
实验例2：VH、VL和scFv蛋白的DNA结合能力分析和表征
通过表面等离子共振(SPR)分析评估了经纯化的VH、VL和scFv蛋白与带不同碱基序列的DNA的定量结合能力。
将具有含生物素标记3’端的40聚体合成DNA片段固定在链霉亲和素涂覆的传感器芯片上，此前用HES缓冲液(10mMHEPES，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)稀释的scFv(5nM～200nM)、VH(0.2μM～50μM)和VL(1.6μM～200μM)蛋白以50μl/分钟的流动速率在所述芯片上流动3分钟，并让HES缓冲液再以50μl/分钟的流动速率流到所述芯片上，以诱导与所述DNA连接的所述蛋白的解离。
感应谱分析确定了所有三种抗体蛋白(scFv、VH和VL抗体蛋白)具有相当高的与ssDNA和dsDNA的结合能力。所述高结合能力表明，scFv、VH和VL抗体蛋白很难具有对DNA的碱基序列特异性(图6)。此外，scFv的DNA亲和力比VH和VL的DNA亲和力高出100倍～1,000倍。该结果显示，其中VH和VL域共存的蛋白的DNA亲和力要优于其中单独存在VH和VL域的蛋白的DNA亲和力。
为确定所述scFv、VH和VL蛋白的非特异性DNA结合主要由静电力造成的事实，在不同浓度(0M～0.8M)的NaCl存在下，使用具有40聚体的碱基序列经预先确定的单链(ss(N)40)或双链(ds(N)40)核酸作为底物进行了ELISA。
从ELISA结果中可以看出，随着NaCl浓度的增加，所有三种蛋白都经历了DNA结合亲和力从50％到90％的减少。该行为表明抗体蛋白与DNA的结合主要由静电力造成(在图7中，符号“●”表示结合ss(N)40底物的scFv，符号“○”表示结合ds(N)40底物的scFv，符号“▼”表示结合ss(N)40底物的VH，符号“![]()
”表示结合ds(N)40底物的VH，符号“■”表示结合ss(N)40底物的VL，而符号“□”表示结合ds(N)40底物的VL)。
实验例3：VH、VL和scFv蛋白的DNA降解能力和底物特异性
经纯化的scFv(0.8μM)、VH(5μM)和VL(5μM)蛋白与300ng的质粒M13mp18(来自New England Biolabs，Ltd)在TBS溶液(20mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，5mM MgCl2)的存在下反应1小时～12小时。反应混合物用胰蛋白酶处理并进行琼脂糖凝胶电泳。
将含50mM EDTA(而非MgCl2)的TBS溶液加入所得物，以确定DNA酶活性的镁离子(Mg2+)依赖性。图8显示了在反应一小时后的琼脂糖凝胶电泳结果。图9显示了反应12小时后的琼脂糖凝胶电泳结果。在图8～10中，术语“rc”是DNA的“松弛环形形式”的缩写；术语“lin”是“线性形式”的缩写并指线性DNA；术语“sc”指“超螺旋形式”的缩写并指完全螺旋DNA。sc类型的DNA依次被降解为rc类型和lin类型的DNA。其后，lin类型DNA被完全降解为更小的DNA片段。
在镁离子(Mg2+)存在下，各个蛋白的DNA酶活性的顺序为scFv>VL>>VH。另一方面，在EDTA存在时，所有蛋白的DNA酶活性都被抑制。具体而言，如可从琼脂糖凝胶电泳结果所看到的，ss M13mp18DNA以及ds M13mp18DNA随着时间的推移而被降解(图10)。
图11显示了获自原位丙烯酰胺凝胶测定的结果。所述丙烯酰胺凝胶测定根据如下步骤进行。首先，让2μg～10μg的scFv蛋白在含dsM13mp18 DNA(20μg/mL)或ss M13mp18 DNA(20μg/mL)的12％丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE。为了从凝胶中除去十二烷基硫酸钠(SDS)并诱导蛋白折叠，用7M脲溶液洗涤凝胶一小时并让其在Tris溶液中(10mMTris，pH8.0，10mM MgCl2，50mM NaCl)在37℃静置过夜。然后用溴化乙锭和考马斯蓝相继染色凝胶。观察到仅在有蛋白且未被溴化乙锭染色的区域内发生DNA降解。(在图11中，“Etbr处理组”是对比数据结果的黑白色的组，而深色位置是DNA没有与Etbr反应的位置)。该行为表明，scFv蛋白的DNA酶活性归因于scFv的固有性质，而不是归因于在蛋白纯化期间污染的副产品。总之，这些结果表明本发明的重组scFv蛋白表现出强力的抗单链(ss)DNA和双链(ds)DNA的DNA酶活性。
使用亲和力连接寡核苷酸核酸酶测定(ALONA)来探查DNA酶活性的底物特异性。将具有地高辛标记的5’端和生物素标记的3’端的寡核苷酸，即ss-(dT)40、ds-(dT:dA)40、ss-(dN)40、ds-(dN:dN′)40、ss-(dG-dC)20和ds-(dG-dC:dC-dG)20通过生物素-链霉亲和素结合来固定在内涂覆链霉亲和素的96孔培养板上，然后让其与3D8 scFv(0.8μM)、Fv(5μM)、VH(5μM)和VL(5μM)在37℃于含MgCl2的TBS溶液(2mM)中反应10小时。本文所用ss-(dT)40指由胸腺嘧啶组成的单链核酸。本文所用ds-(dT：dA)40指由胸腺嘧啶40聚体和腺嘌呤40聚体组成的双链核酸。本文所用ss-(dN)40指由特定碱基40聚体组成的单链核酸。本文所用ds-(dN:dN′)40指一条碱基40聚体与另一条碱基40聚体互补结合的双链核酸。本文所用ss-(dG-dC)40指其中鸟嘌呤与胞嘧啶交替连接的20聚体单链核酸。本文所用ds-(dG-dC:dC-dG)指其中鸟嘌呤-胞嘧啶链20聚体与胞嘧啶-鸟嘌呤链20聚体连接的双链核酸。
剩余DNA与碱性磷酸酶联抗地高辛抗体反应，并向其中加入p-NPP溶液(在0.1M甘氨酸、1mM ZnCl2、1mM MgCl2中的1mg/mL p-NPP，pH10.3)作为碱性磷酸酶的底物。测量了在405nm处的吸光度(图42)。如图12所示的结果可以明显看出，scFv、VH和VL的DNA酶活性对DNA底物基本上是非特异性的。
实验例4：敲除组氨酸的scFv蛋白的DNA酶活性的变化
比较本发明的3D8 scFv抗体蛋白与作为传统已知的抗DNA催化抗体的BV04-01/ss-(dT)3的三维结构(图13和图14)，可以推断，VH和VL蛋白各自存在的一个组氨酸(His)残基介导了DNA酶活性(图15和图16)。
基于此推断，使用定位突变试剂盒和引物将VH的His35和VL的His94(即，图1中由数字“35”和“94”代表的残基)用丙氨酸取代。在细菌中表达所得蛋白并提纯。评价所述蛋白的DNA结合能力和DNA降解能力的变化。通过ELSIA评价所述蛋白的DNA结合能力。更具体而言，用溶解于TBS溶液(20mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，5mM MgCl2)中的40聚体寡核苷酸(10μg/mL，100μl)在37℃包被聚苯乙烯96孔培养板1小时。培养板用TBST(含0.1％Tween 20的TBS)洗涤三次，向其中加入3％BSA-TBS，在37℃静置1小时，然后用TBST洗涤三次。在每个孔中引入经纯化的scFv、VH和VL野生型蛋白(20μg/mL，100μl)和组氨酸突变体蛋白，并在37℃反应1小时，然后用TBST洗涤三次。所得蛋白和兔IgG(10D/mL，100D)在37℃反应1小时，用TBST洗涤三次，然后与碱性磷酸酶联抗兔IgG(1:10,000稀释，100μl)在37℃反应1小时，并用TBST洗涤三次。最后，在所得蛋白中加入作为碱性磷酸酶底物的p-NPP溶液(在0.1M甘氨酸、1mM ZnCl2、ImM MgCl2中的1mg/mL的p-NPP，pH10.3)。测量所述蛋白在405nm处的吸光度。
以与实验例3相同的方法评估了所述蛋白的DNA酶活性。
结果，scFv蛋白中His残基取代对DNA结合没有大的影响(图17)，但导致了对DNA酶活性的抑制。这些行为表明，所述两个His残基介导了scFv蛋白的DNA酶活性。
另一方面，VH和VL蛋白中的His残基取代几乎不影响DNA结合能力和DNA酶活性。这些行为意味着VH和VL蛋白的DNA降解机理与scFv蛋白的DNA降解机理不同(图19和图20)。
在图18和图20中，术语“rc”是DNA的“松弛环形形式”的缩写；术语“lin”是“线性形式”的缩写并指线性DNA；而“sc”指“超螺旋形式”的缩写并指完全螺旋DNA。
在图17～20中，符号“*”表示其中组氨酸被丙氨酸取代的突变体。
实验例5：3D8 scFv蛋白的RNA酶活性
为评估3D8 scFv蛋白的RNA酶活性，首先制备了ssRNA和dsRNA底物。
使用烟草花叶病毒壳蛋白(TMV-CP)基因克隆pLITMUS载体(来自New England BioLabs，Inc.)的T7启动子，通过体外转录然后纯化合成ssRNA，从而制备了所述ssRNA。
所述dsRNA通过使用pLITMUS载体的T7和SP6启动子进行体外转录来合成dsRNA然后提纯并杂交而获得。
将300ng如此制备的ssRNA(或dsRNA)与0.8μM的scFv蛋白在TBS溶液中反应1小时～5小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶电泳结果可以确认，所述scFv蛋白对dsRNA和ssRNA都表现出RNA酶活性，并取决于反应时间(图21)。
为确定3D8 scFv蛋白的RNA酶活性是归因于scFv的固有性质而不是蛋白纯化期间被污染的副产物这一假定，进行了所述3D8 scFv蛋白的原位水解测定。即，让3D8 scFv蛋白在含20μg/mL的dsRNA或20μg/mL的ssRNA的丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。用7M脲溶液洗涤凝胶1小时并让其在Tris溶液(10mMTris，pH8.0，10mM MgCl2，50mM NaCl)中在37℃静置过夜。用溴化乙锭和考马斯蓝依次染色凝胶。观察到只有在存在蛋白因此没有被溴化乙锭染色的区域发生RNA降解。(在图22中，“Etbr处理组”是对比数据结果的黑白色的组，而深色位置是RNA不与Etbr反应的位置)。这些结果表明，所述scFv蛋白对ssRNA和dsRNA都表现出强力的RNA酶活性(图22)。
以与实验例3中相同的方式通过亲和力连接寡核苷酸核酸酶测定(ALONA)探查了RNA酶活性的底物特异性，不同的是使用了具有地高辛标记的5’端和生物素标记的3’端的寡核苷酸，即ss-(rU)40、ds-(rU:rA)40和ds-(rU:dA)40(RNA/DNA杂交体)。
将这些底物通过生物素-链霉亲和素结合来固定在链霉亲和素涂覆的96孔培养板上，并让其在含MgCl2的TBS溶液(2mM)中与0.8μM的3D8 scFv蛋白在37℃反应10小时。
同时，在所得物中加入含50mMEDTA(而不是MgCl2)的TBS溶液，以确定RNA酶活性的二价镁离子(Mg2+)依赖性。
本文所用的ss-(rU)40指由核糖尿嘧啶(ribouracil)40聚体构成的单链核酸。本文所用的ds-(rU:rA)40指由核糖尿嘧啶40聚体和核糖腺嘌呤40聚体构成的双链核酸。本文所用的ds-(rU:dA)40指由核糖尿嘧啶40聚体和脱氧核糖腺嘌呤40聚体构成的RNA/DNA杂交体形式的双链核酸，在所述核酸中将核糖尿嘧啶与脱氧腺嘌呤交替相连排布。
用碱性磷酸酶联抗地高辛抗体与剩余RNA和RNA/DNA杂交体反应，并向其中加入p-NPP溶液(在0.1M甘氨酸，1mM ZnCl2，ImM MgCl2中的1mg/mL的p-NPP，pH10.3)作为碱性磷酸酶的底物。测量所得混合物在405nm处的吸光度。结果如图23所示。
结果表明，scFv抗体蛋白能降解RNA/DNA杂交体以及ssRNA和dsRNA，并且scFv抗体蛋白的RNA酶活性不依赖于Mg2+，这与所述scFv抗体蛋白的DNA酶活性不同。
已知在传统RNA酶上观察到了不依赖于Mg2+的RNA酶活性。
实施例1：通过荧光显微镜对转移有3D8 scFv蛋白的动物细胞的抗病毒活性的确定
用Alexa 488标记试剂盒(Molecular probes，Inc.，绿色荧光)对如此在细菌中表达并纯化的3D8 scFv抗体进行荧光标记。
然后，用微孔穿孔器(microporator)(来自韩国Digital Bio TechnologyCo.，Ltd.)在伏特数为100、脉宽为35和脉冲数为2的电穿孔条件下将所述3D8 scFv抗体注射到vero细胞内(非洲绿猴肾细胞)。在2×105个vero细胞中导入20μg scFv蛋白，将导入蛋白的细胞接种到含0.5mL的DMEM-10％胎牛血清的48孔培养板上，然后将接种后的板在5％CO2培养箱中培养10小时。
重要的是，利用具有单RNA链作为基因组的水泡性口炎病毒(VSV)，在5％CO2培养箱中以MOI 5对所述细胞进行1小时的转染，然后在新的DMEM-10％胎牛血清培养基中温育。
24小时后，用荧光显微镜观察所述细胞。从荧光显微镜测定中可以确认，其中未导入3D8 scFv蛋白的vero细胞发生了细胞死亡(一种由VSV引起的细胞病变效应(CPE))(图24)，而其中导入有3D8 scFv蛋白的vero细胞不管VSV感染与否都仍然存活(图25)。
在图24和图25中，“3D8-”指“不含3D8 scFv蛋白”，“3D8+”指“注射了3D8 scFv蛋白”，而“VSV+”指“经VSV处理”。
通过电穿孔(伏特数为1000，脉宽为35，脉冲数为2)将所述3D8 scFv蛋白转染到HeLa细胞(人类宫颈癌细胞系)内并用VSV转染(感染)。观察到HeLa细胞表现出与所述vero细胞相似的抗病毒活性，即细胞死亡受到抑制(参见图27，并且从图26中可以看出，其中转染了VSV的转移有3D8 scFv蛋白的HeLa细胞没有表现出所述3D8 scFv蛋白的固有细胞毒性(参见图27中“3D8+/VSV-”部分))。
在图26和27中，“3D8-”指“不含3D8 scFv蛋白”，“3D8+”指“注射了3D8 scFv蛋白”，“VSV-”指“未用VSV处理”，而“VSV+”指“经VSV处理”。
另一方面，所有转移有RNA酶A的HeLa细胞(未用VSV转染)由于RNA酶A的固有细胞毒性而在5小时内死亡。
该结果显示，所述3D8 scFv蛋白的抗病毒活性显著高于传统核酸酶的抗病毒活性。
实施例2：转移有3D8 scFv、VH或VL蛋白的动物细胞的抗病毒活性的定量测定
通过MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)测定定量确定了3D8 scFv、VH或VL蛋白的抗病毒活性。
将这些蛋白、作为对照组的牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶以20μg/2×105细胞电穿孔到HeLa细胞中，以1×105细胞/孔分到96孔培养板上，并在5％CO2培养箱中培养24小时。
仅进行电穿孔而不含蛋白的HeLa细胞用作另一个对照组。24小时后，将所述不含蛋白的HeLa细胞组用VSV(MOI＝1)转染1小时并在新的培养基中培养24小时。
当用荧光显微镜观察所述不含蛋白的HeLa细胞时，向其中加入MTT溶液(1mg/mL PBS，100μl)并在5％CO2培养箱中培养4小时～5小时。
将所得甲暨(fomazan)溶解在200μl二甲亚砜(DMSO)中。用吸收分光光度计在595nm处测量所述甲暨的吸光度，以确定所述HeLa细胞的存活率。
结果，转移有所述scFv、VH或VL蛋白的HeLa细胞的存活率显著高于对照组的HeLa细胞存活率。该结果确定了所有scFv、VH和VL蛋白都具有抗VSV的抗病毒活性(参见图28：“对照”为未处理组而“BSA”和“溶菌酶”为对照组)。
实施例3：通过共聚焦显微镜对转移3D8 scFv、VH和VL蛋白的动物细胞的抗病毒活性的确定
将所述scFv、VH和VL蛋白以20μg/2×105细胞/孔电穿孔到24孔培养板上的HeLa细胞内，并在带灭菌盖玻片的孔内培养24小时。
在24小时培养完成，将所述细胞用VSV转染1小时并在新的培养基中培养12小时。为通过共聚焦显微镜监测HeLa细胞内的VSV片段的增殖，进行了免疫荧光染色。具体而言，将所述培养基从各孔中分离，用含2％FBS的PBS缓冲溶液洗涤所述细胞一次，然后向其中加入400μl固定/增透溶液(Becton Dickinson，Inc.)，并让其在4℃静置20分钟。所得细胞用含2％FBS的PBS缓冲溶液洗涤两次，然后与500μl的抗VSV-FITC抗体(1:1000稀释)(Abeam，Inc.)在4℃反应40分钟，并用含2％FBS的PBS缓冲溶液洗涤三次。
将含有作为使细胞核染为蓝色的试剂的3μl的DAPI(4′-6-二脒基-2-苯基吲哚)的固定溶液(Invitrogen，Corp.)加到预先准备的载玻片上，用附着有所述细胞的盖玻片覆盖所述载玻片，用所述固定溶液密封剩余相邻区域，然后用共聚焦显微镜观察VSV颗粒。
从共聚焦显微镜监测中可以确认，存在于转移有scFv、VH或VL蛋白的细胞中的VSV片段的量低于未转移有scFv、VH或VL蛋白的细胞中的VSV片段的量。低量的所述VSV片段表明，scFv、VH和VL蛋白抑制了VSV的增殖。(参见图29，“3D8-”指“不含3D8 scFv蛋白”，“3D8+”指“转移有3D8 scFv蛋白”，“VSV-”指“未用VSV处理”，而“VSV+”指“经VSV处理”)。
制备例5：NIH/3T3、HeLa、PK15动物细胞的转化
为了建立其中稳定表达3D8 scFv蛋白的细胞系，用pIg20-3D8质粒进行了PCR以获得3D8 scFv基因，并将所述3D8 scFv基因克隆到动物细胞表达载体中(图30)。使用包括pc DNA3.1载体(invitrogen，Inc.)、逆转录病毒载体pLXIN(invitrogen，Inc.)和逆转录病毒载体pQCXIN(invitrogen，Inc.)在内的三种载体进行所述3D8 scFv基因克隆(在图30中，这些载体分别由“a”、“b”和“c”表示)。此处所用的各PCR引物组如下：
a)3D8 scFv基因在pc DNA3.1载体中的克隆
正向：5′-GGATCCTGCTATGGCAAAAGCCCGGGAG-3′(SEQ ID NO17)
反向：5′-CTCGAGGTCCATGGTGATGATGATG-3′(SEQ ID NO 18)
b)3D8 scFv基因在pLXIN载体中的克隆
正向：5′-TCTCGAGATGGAGGTCCAGCTGCAG-3′(SEQ ID NO 19)
反向：5′-TGGATCCTTATTAAAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3′(SEQ ID NO 20)
c)3D8 scFv基因在pQCXIN载体中的克隆
正向：5′-GTTCTAGAGCGGCCGCATGGAGGTCCAGCTGCAGC-3′(SEQ ID NO 21)
反向：5′-TGGATCCTTATTAAAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3′(SEQ ID NO 22)
(1)通过简单转染来建立表达3D8scFv的HeLa和NIH/3T3细胞系
将HeLa细胞系和NIH/3T3细胞系(小鼠胚胎成纤维细胞)以105细胞/孔在60mm培养板上培养，12小时后，用pc DNA3.1-3D8 scFv载体转染这些细胞。在刚要转染前，用新鲜培养基(DMEM-10％FBS)替代所述培养基。将6μl JetPEI转染溶液(Qbiogen，Inc.)和3μg pcDNA3.1-3D8scFv载体与NaCl(100μl，150mM)均匀混合，并将其于室温静置30分钟。将所得混合物加入在60mm培养板上培养的HeLa细胞系或NIH/3T3细胞系。24小时后，用含G418抗生素(1mg/mL)的选择培养基替换所用培养基，并且重要的是，连续重复替换所述选择培养基(以2天～3天间隔进行2周)以获得群落。
通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)确定了形成群落的细胞表达3D8 scFv mRNA。使用Trizol溶液(Invitrogen Life Technologies，Inc.)从所述细胞中提取总细胞RNA，然后由3μg所提取的RNA合成cDNA并使用RT-PCR PreMix试剂盒(来自Bioneer，Ltd.)对所述cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)。
图31是显示所述NIH/3T3细胞的RT-PCR分析结果的琼脂糖凝胶电泳图像。在图31中，泳道1为尺寸标记(来自Bioneer，Inc.的100bp序列梯)，泳道2是其中使用蒸馏水(D.W)作为PCR模板的阴性对照组的PCR图案，泳道3是其中使用未转染NIH/3T3的细胞合成的cDNA作为PCR模板的阴性对照组的PCR图案，而泳道4显示了其中使用从转染有pcDNA3.1-3D8 scFv的NIH/3T3细胞合成的cDNA作为PCR模板的PCR图案。
如从图31中可以明显看出，在泳道4的图案中观察到对应于3D8scFv基因尺寸的750bp条带。所述条带的存在表明所述经转染的NIH/3T3细胞稳定表达3D8 scFv mRNA。
然后，通过免疫荧光染色确定所述经转染的NIH/3T3细胞是否表达3D8 scFv蛋白。即，将所述细胞通过4％多聚甲醛固定，并相继使用0.1％Triton X-100进行膜增透和使用5％脱脂奶(DIFCO，Inc.)封闭膜。将所得NIH/3T3细胞与兔衍生抗3D8 scFv一抗(在3％脱脂奶-TBST中以1:50稀释)在室温下反应30分钟，用3％脱脂奶-TBST洗涤两次，与TRITC联抗兔IgG(1:2,000稀释)在室温下反应30分钟，并用3％脱脂奶-TBST洗涤两次。
荧光显微镜测定结果表明，3D8 scFv蛋白在所述经转染的NIH/3T3细胞中均匀表达(图32)。
在图32中，“a”是显示不含3D8 scFv的NIH/3T3细胞的图，而“b”是显示转染了3D8 scFv的NIH/3T3细胞的图。
从转染了3D8 scFv的Hela细胞系中选出G418并在96孔板上进行有限稀释，以使在每个孔中引入0.5个细胞以建立单克隆细胞系。
图33是显示RT-PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图像，所述结果确定了scFv mRNA在经转染的HeLa细胞系中的表达。在图33中，泳道M是100bp序列梯(来自Bioneer，Inc.)，“正常HeLa”泳道是阴性对照组的PCR图案，其中使用由未转染HeLa细胞合成的cDNA作为模板，而按从左至右的顺序，第三至第七泳道分别为其中使用从经转化的转染有pcDNA3.1-3D8 scFv的HeLa细胞系合成的cDNA作为模板的组的RT-PCR图案。
如图33所示，在所有转染细胞系中都观察到了对应于3D8 scFv基因尺寸的750bp DNA条带(H1-1、H1-2、H2-1、H2-2、H3-2和H3-3)。该行为表明，所述转染HeLa细胞稳定表达了3D8 scFv mRNA。
然后，通过流式细胞仪确定了在两个代表性转染HeLa细胞系(H1-1和H1-2)中的3D8 scFv蛋白的表达(图34)。即，将所述细胞通过4％多聚甲醛固定，并相继使用0.1％Triton X-100进行膜增透和使用2％胎牛血清(Invitrogen，Corp.)进行膜封闭。将所得HeLa细胞与兔衍生抗3D8scFv一抗(在2％胎牛血清-TBST中以1:50稀释)在室温下反应30分钟，用2％胎牛血清-TBST洗涤两次，与FITC偶联抗兔IgG(1:2,000稀释)在室温下反应30分钟，并用2％胎牛血清-TBST洗涤两次。
流式细胞仪分析结果显示，3D8 scFv蛋白在所述经转染的HeLa细胞中表达(图34)。
(2)使用逆转录病毒载体对表达3D8 scFv的HeLa和PK15细胞系进行的确定
将其中克隆有3D8 scFv基因的两个逆转录病毒载体，即pLXIN-3D8scFv和pQCXIN-3D8 scFv转染到作为包装细胞系的PT67细胞内。将2×105个PT67细胞在6孔板的一个孔上生长约24小时，并用不含血清的TOMTM(Welgene，Inc.)洗涤。将2μg的DNA、5μl的lipofectamineTM(Invitrogen，Corp.)和200μl的TOMTM互相混合，使其在室温下反应15分钟，再向其中加入800μl TOMTM培养基，然后将倒进含细胞的孔内，并在37℃于5％CO2培养箱中温育8小时。8小时后，将所述细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养约24小时，然后用含800μg/mL G418的DMEM-10％胎牛血清培养基替换所用培养基。约两周后，当细胞开始在孔内成簇并生长时，将它们培养2天～3天并离心以获得病毒上清液。剩余溶液经0.45μm过滤器过滤以除去细胞残余物。
为将由PT67包装细胞系获得的含3D8 scFv基因的逆转录病毒颗粒转导到HeLa和PK15细胞内，将1×105个HeLa细胞和PK15细胞(猪肾成纤维细胞)在60mm培养板上培养约24小时，并使用添加有溴化己二甲胺(polyblene)(10μg/mL)的含10％血清的DMEM培养基在37℃于5％CO2培养箱中温育两周。将所述细胞在添加了5mL通过培养所述PT67包装细胞获得的病毒上清液的培养基中在37℃温育24小时，然后使用1mg/mL的含G418培养基进行G418选择。
在用逆转录病毒转染所述HeLa和PK15细胞后约三周，当通过所述g418选择形成了所述转导细胞的细胞簇时，进行有限稀释而在96孔板的一个孔中引入0.5个细胞，以建立单克隆细胞系。H4-2、H5-14、H5-18和H5-26建立为转染有所述逆转录病毒的代表性HeLa细胞系，而P1-1、P1-2和P1-3建立为转染有所述逆转录病毒的代表性PK细胞系。
图35是显示RT-PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图像，所述RT-PCR结果确定了3D8 scFv mRNA在经转化的PK15细胞系中的表达。在图35中，泳道M为100bp序列梯(来自Bioneer，Inc.)，“正常PK15”泳道是阴性对照组的PCR图案，其中使用由未转染PK15细胞合成的cDNA作为模板，并且按从左至右的顺序，第三至第七泳道分别为其中使用从经转化的转染有pcDNA3.1-3D8 scFv的HeLa细胞系合成的cDNA作为模板的组的RT-PCR图案，而泳道P1-1、P1-2和P1-3分别是其中使用由经转化的PK15细胞系合成的cDNA作为模板的组的RT-PCR图案。
如图35所示，在所有经转化的PK15细胞系(P1-1、P1-2和P1-3)中都观察到了对应于3D8 scFv VH和VL基因的尺寸的400bp DNA条带。这表明所述经转化的PK15细胞稳定表达了3D8 scFv mRNA。
实施例4：表达3D8 scFv蛋白的动物细胞的抗病毒活性测定
对其中已证明表达了3D8 scFv基因的NIH/3T3和HeLa细胞系的抗病毒活性进行确定。具体而言，评估了所述NIH/3T3细胞系抗水泡性口炎病毒(VSV)的抗病毒活性，评估了所述HeLa细胞系抗VSV、单纯疱疹病毒(HSV)和伪狂犬病(Aujesky’s disease)病毒(ADV)的抗病毒活性，并评估了所述PK15细胞系抗典型猪瘟病毒(CSFV)的抗病毒活性。
感染到所述经转化的细胞系中的病毒量在0.1～1.0的感染复数(MOI)范围内。为确定各细胞系的抗病毒活性，用病毒感染所述细胞系，在约20小时～72小时后，进行细胞死亡监测、RT-PCR或胞内病毒染色。根据如下方式确定各细胞系的病毒活性：
·确定抗VSV的抗病毒活性(负链RNA基因组)
：在病毒感染后20小时～40小时用显微镜观察细胞死亡
·确定抗HSV的抗病毒活性(双链DNA基因组)
：在病毒感染后20小时～40小时用显微镜观察细胞死亡
：在用HSV-GFP(绿色荧光蛋白)病毒感染细胞后24小时用显微镜观察细胞死亡，所述HSV-GFP病毒当在细胞内表达GFP时发绿色荧光。
·确定抗ADV的抗病毒活性(双链DNA基因组)
：在感染后40小时进行靶向ADV gp50基因的RT-PCR。
·评估抗CSFV的抗病毒活性(正链RNA基因组)
：在感染后72小时时对胞内病毒进行染色。
图36显示了以与实施例2中的相同方式确定表达所述3D8 scFv蛋白的NIH/3T3细胞的抗VSV活性的定量MTT测定结果。
在用VSV以MOI 1感染所述细胞后24小时，互相比较细胞系的细胞存活率。具体而言，未转化的NIH/3T3细胞系的存活率约为47％，而经3D8 scFv基因转化的NIH/3T3细胞系的存活率约为76％。相似地，未转化的HeLa细胞的存活率约为32％，而经3D8 scFv转化的HeLa细胞的存活率约为85％(图36)。这些结果表明，3D8 scFv蛋白能抑制NIH/3T3细胞中的VSV(RNA病毒)活性。
图37显示了荧光显微镜测定结果，该结果确定表达所述3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的抗VSV活性。在用VSV以MOI 1感染所述细胞后24小时，观察了细胞行为。从所述细胞观察发现，经转化的HeLa细胞的死亡率低于未转化的HeLa细胞的死亡率(图37中，“正常HeLa”是不表达3D8 scFv蛋白的正常细胞，而H4-2、H5-14、H5-18和H5-26是表达3D8 scFv蛋白的细胞)。这些结果表明，3D8 scFv蛋白能抑制HeLa细胞中的VSV(RNA病毒)活性。
图38显示了胞内染色结果，该结果确定经转化的PK15细胞的CSFV增殖抑制活性。在用CSFV(MOI＝0.5)感染所述细胞1小时后，将所述细胞从病毒接种培养基中分离。在添加有1ml含10％FPS的完全DMEM的每个孔中培养所述细胞72小时。培养72小时后，将所述细胞从所述培养基分离并用PBS洗涤。用80％丙酮在-20℃将所述细胞固定10分钟。在除去丙酮并干燥后，将所述细胞与识别CSFV E2抗原的3B6单克隆抗体(来自韩国National Veterinary Research & Quarantine Service的抗E2抗体)在37℃反应40分钟。所得细胞用PBS洗涤三次，并与生物素偶联抗小鼠抗体在37℃反应40分钟。所得细胞用PBS洗涤三次，在AB溶液中培养40分钟，用PBS洗涤三次，然后与二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)底物溶液在室温下反应约10分钟。反应后，从孔中除去DAB溶液，用自来水洗涤培养箱，用自来水将孔装到1/4并用显微镜观察。
如从图38中可以看出，正常PK15细胞(在图38中由“正常PK15”表示)表面和与其相邻区域全部被染为深色，而在细胞系内表达3D8 scFv蛋白的经转化的PK15细胞系(P1-1、P1-2、P1-3)几乎没有染色。这些结果表明，3D8 scFv蛋白能抑制PK15细胞中的CSFV增殖。
同时，图39显示了以与实施例2中的相同方式进行的定量MTT测定的结果，该结果确定表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的抗VSV活性。
在用VSV(MOI＝0.1或1)感染所述细胞后24小时和36小时，互相比较了所述细胞系的存活率。结果证实，经3D8 scFv基因转化的H4-2细胞的存活率高于未转化HeLa细胞的存活率，具体而言，所述经3D8scFv基因转化的H4-2细胞的存活率在MOI1时为约75％，而在MOI0.1时为约88％(图39)。这些结果表明，3D8 scFv蛋白能抑制HeLa细胞中的VSV活性。
图40显示了以与实施例4中的相同方式进行荧光显微镜测定的结果，该结果确定表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的抗VSV活性。
在用HSV-GSP以MOI 1和MOI 0.5感染所述细胞后24小时，观察了所述细胞的荧光活性。经观察发现，经转化的HeLa细胞的荧光细胞比例(fluorescent cell ratio)低于未转化HeLa细胞的荧光细胞比例。这些结果表明，3D8 scFv蛋白能抑制HeLa细胞中的VSV增殖。
图41显示了显微镜测定结果，该结果确定表达3D8 scFv蛋白的HeLa细胞的抗ADV活性。在用ADV以MOI 0.1和MOI 1感染细胞后24小时和40小时，观察了所述细胞行为。在所有情形中，观察到经转化HeLa细胞的死亡率低于未转化HeLa细胞的死亡率。这些结果表明，3D8 scFv蛋白能抑制HeLa细胞中的ADV(DNA病毒)增殖。
图42是显示RT-PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图像，该结果确定经转化的HeLa细胞系的ADV病毒增殖抑制活性。在图42中，泳道M为100bp序列梯(来自Bioneer，Inc.)，“正常HeLa”泳道是其中使用由未转化的HeLa细胞合成的cDNA作为模板的阴性对照组的RT-PCR图案，而按从左至右的顺序，第三至第七泳道分别为其中使用由经转化的HeLa细胞系(H1-2、H2-2、H3-1、H3-2和H3-3)合成的cDNA作为模板的组的RT-PCR图案。
用于所述PCR的引物的碱基序列如下。所述引物靶向ADV病毒的gp50基因。
ADV正向引物：5′-CGTACCGCGCCCACGTGGCC-3(SEQ ID NO23)
ADV反向引物：5′-GTCGGTGAGGATGTTCACGC-3′(SEQ ID NO24)
从图42中明显可以看出，在未转化HeLa细胞中观察到了263bp的ADV gp50 DNA强带，而在经转化的HeLa细胞中观察到了弱带。与图41相似，这些结果表明3D8 scFv蛋白能抑制HeLa细胞中的ADV病毒增殖。
总之，上述结果证明，DNA病毒(例如，ADV和HSV)和RNA病毒(例如，VSV和CSFV)在表达3D8 scFv蛋白的细胞中的增殖受到抑制。
配制例1：3D8 scFv蛋白的配制
ScFv(SEQ ID NO：6) 40μg
Tween 802mg
甘氨酸 2g
通过将所述成分溶解在注射用生理盐水中，进行无菌过滤，分装到2mL小瓶中，冻干并密封来制备组合物(20mL)。
配制例2：3D8 scFv蛋白的配制
ScFv(SEQ ID NO：6) 40μg
Tween 801mg
山梨糖醇 2g
甘氨酸 1g
通过将所述成分溶解在注射用生理盐水中，进行无菌过滤，分装到2mL小瓶中，冻干然后密封来制备组合物(20mL)。
配制实施例3：3D8 scFv蛋白的配制
ScFv(SEQ ID NO：6) 20μg
血清白蛋白 501mg
山梨糖醇 4g
通过将所述成分溶解于0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.0)中，进行无菌过滤，分装到2mL小瓶中，冻干然后密封来制备组合物(20mL)。
施用例1：3D8 scFv DNA的肌内注射
将100μg表达scFv蛋白的载体DNA(SEQ ID NO：6)肌内注射到小鼠的股四头肌中。将稀释在0.9％NaCl中的50μg载体DNA各自注射到小鼠的两个股四头肌中。
注射后，通过将电极置于与注射位点相邻的肌肉上并对所述位点施加具有10串1,000次脉冲的电势来进行电穿孔。此时，施加的脉冲长度为200微秒(两次)，两个连续脉冲之间的间隔为600微秒，而电流限制为50mA。对皮肤使用导电凝胶。在较大型动物的情形中，可将所述电极插入动物的肌肉中。
工业应用
从上文可以明显看出，本发明能够应用于动物细胞，特别是能应用于人类细胞，因此可广泛用于与由包括HIV病毒和SARS病毒在内的多种病毒引起的疾病的治疗相关的药物行业中。
序列表
<110>亚洲大学校产学协力团
<120>抗动物病毒的抗病毒剂
<150>KR 10-2006-0090361
<151>2006-09-19
<160>24
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>360
<212>DNA
<213>MRL-lpr/lpr小鼠
<220>
<221>基因
<222>(1)..(360)
<223>可变重链(VH)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>1
![]()
![]()
<210>2
<211>120
<212>PRT
<213>MRL-lpr/lpr小鼠
<400>2
![]()
![]()
<210>3
<211>348
<212>DNA
<213>MRL-lpr/lpr小鼠
<220>
<221>基因
<222>(1)..(348)
<223>可变轻链(VL)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(348)
<400>3
![]()
![]()
<210>4
<211>116
<212>PRT
<213>MRL-lpr/lpr小鼠
<400>4
![]()
<210>5
<211>753
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头连接在VH(序列No.1)和VL(序列No.2)之间
<220>
<221>基因
<222>(1)..(753)
<223>轻链可变片段(scFv)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(753)
<400>5
![]()
![]()
<210>6
<211>251
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
![]()
![]()
![]()
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆VH的正向引物
<400>7
![]()
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆VH的反向引物
<400>8
![]()
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆VL的正向引物
<400>9
![]()
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆VL的反向引物
<400>10
![]()
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于核苷酸分析的正向引物
<400>11
![]()
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于核苷酸分析的反向引物
<400>12
![]()
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于VH亚克隆的正向引物
<400>13
![]()
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于VH亚克隆的反向引物
<400>14
![]()
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于VL亚克隆的正向引物
<400>15
![]()
<210>16
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于VL亚克隆的反向引物
<400>16
![]()
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将来自pIg20-3D8的3D8 scFv亚克隆到pcDNA3.1中的正向引物
<400>17
![]()
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将来自pIg20-3D8的3D8 scFv亚克隆到pcDNA3.1中的反向引物
<400>18
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<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将来自pIg20-3D8的3D8 scFv亚克隆到pLXIN中的正向引物
<400>19
![]()
<210>20
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将来自pIg20-3D8的3D8 scFv亚克隆到pLXIN中的反向引物
<400>20
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<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将来自pIg20-3D8的3D8 scFv亚克隆到pQCXIN中的正向引物
<400>21
![]()
<210>22
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将来自pIg20-3D8的3D8 scFv亚克隆到pQCXIN中的反向引物
<400>22
![]()
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测ADV病毒中的gp50基因的正向引物
<400>23
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<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测ADV病毒中的gp50基因的反向引物
<400>24
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